Name: 简化全身体积描记法以表征呼吸类鼻疽期间的肺功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习简化全身体积描记法以非侵入性监测小鼠呼吸功能与疾病进展。该技术可测量呼吸频率和潮气量，为评估呼吸道感染严重程度提供可靠的生物标志物。

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本研究由美国国立卫生研究院COBRE资助项目P20GM125504-01子项目8246资助。

本文所述实验程序已通过路易维尔大学机构生物安全委员会（方案编号 #14-038）和机构动物护理与使用委员会（方案编号 #19567）的审查和批准。
1. 采样室的组装
<ol>
	<li>使用台钻和3/4&#34;金刚石钻头，在一个600 mL方形广口玻璃梅森罐（配有95 mm垫圈和带夹钳的气密盖，含提手和触发夹盖）的平面上钻出两个孔（图1）。 
	注意：采样室目前无商业产品，必须自行制作。</li>
	<li>将黄铜穿舱接头（1/4&#34; NPT内螺纹，3/4-16 UNF外螺纹）穿过梅森罐上的两个孔，并在穿舱接头与玻璃接触面的两侧均使用橡胶垫圈（内径3/4&#34;，外径1&#34;），以确保气密密封。</li>
	<li>一个穿舱接头组件用于连接压力传感器，另一个则连接带有鲁尔接头的注射器，用于校准。
	<ol>
		<li>对于压力传感器，将高性能表压传感器的1/4&#34; NPT螺纹部分用聚四氟乙烯胶带缠绕后旋入穿舱接头。按照制造商的接线说明，使用电烙铁将压力传感器导线焊接至8针公头DIN连接器，以便与市售的高质量数据采集设备连接（见材料表）。 
		注意：DIN连接器的线路中需使用一个150 kΩ、1/8瓦、1%精度的金属膜电阻。</li>
		<li>对于校准端口，使用1/4&#34;公NPT转1/8&#34;母NPT转接头，将1/8&#34;公NPT连接至镀镍的母鲁尔锁紧接头，并通过聚四氟乙烯胶带缠绕螺纹连接部分，将其固定在黄铜穿舱接头上。不使用时，用聚丙烯螺纹公鲁尔帽密封鲁尔接头。 
		&#8203;注意：切勿将穿舱接头过度拧紧在玻璃罐上，以免产生裂纹。如有需要，可在橡胶垫圈上涂抹硅脂，以确保穿舱接头与玻璃罐之间的气密性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统设置
<ol>
	<li>根据制造商的说明，使用 8 针 DIN 连接器将采样室连接到桥式放大器，并将桥式放大器连接到数据采集设备。</li>
	<li>使用制造商提供的电缆将数据采集设备连接至电源和运行生理数据分析软件的计算机。 
	注意：确保在使用前至少预热 5 分钟，以保证传感器测量稳定。</li>
	<li>启动软件以与数据采集系统建立连接。</li>
	<li>在软件中下载可选的 Spirometry Module，并在 Spirometry &#62; Settings 窗口中将默认单位设置从 L/s 修改为 µL/s。</li>
</ol>
3. 系统校准
<ol>
	<li>在软件中创建一个4通道窗口，包含以下数据窗口：通道1：原始数据，采样率为4 k/s，量程为1 mV；通道2：对通道1应用高通1 Hz自动调节滤波器后的数字滤波信号；通道3：对通道2的数据进行平滑处理，通过平均100个采样点实现；通道4：基于通道3数据的呼吸流量测定（定制流量头，校准公式为：流量 (µL/s) = 120,000 × 电压）。 
	注意：120,000 是一个占位用的相关系数，将在校准过程中进行调整。</li>
	<li>设置对通道4的DataPad分析，包含以下列：第1列：通道4数据，注释 &#62; 完整注释文本；第2列：通道4数据，周期性测量 &#62; 平均周期频率；第3列：通道4数据，周期性测量 &#62; 平均周期高度。</li>
	<li>将图表显示右下角的帧率设置为100:1。将此窗口配置保存为模板，供今后所有研究使用。</li>
	<li>关闭样品室盖，并将一支25 µL气密型注射器连接至鲁尔接头。使用Chaney适配器调节注射器，使其可重复递送20 µL体积。 
	注意：可选使用一段较短的1/16&#34;管路及鲁尔/卡套接头将注射器连接至样品室。但应避免使用过长的管路，以防显著改变样品室的总体空气体积。</li>
	<li>利用Chaney适配器的深度限位装置，将20 µL空气吸入注射器中。</li>
	<li>在软件中对体积描记仪进行归零操作（设置 &#62; 归零所有输入 (Alt-Z)），然后开始记录。</li>
	<li>在记录过程中，待基线稳定后，快速推拉注射器活塞约10次，以模拟受试者呼吸，产生已知体积为20 µL的人工呼吸。完成后停止记录。 
	注意：人工呼吸频率应超过2 Hz，以最大程度提高校准的可重复性。</li>
	<li>通过右键单击编号的体积描记记录起始位置，并点击添加注释，标注所测样品的身份信息。</li>
	<li>重置注射器，归零输入信号，并重复进行两次20 µL脉冲的记录（共完成三次记录）。</li>
	<li>完成所有测量后，使用计算机鼠标选择一段能准确代表人工20 µL呼吸的呼吸体积描记数据区域。 
	注意：在DataPad模块中，预览标题将显示呼吸频率（平均周期频率，Hz）和呼吸深度（平均周期高度，µL）的临时读数。可点击添加到DataPad图标将该预览数据保存至DataPad。</li>
	<li>查看第3列数据（平均周期高度），计算三次记录中测得的平均呼吸体积，并按以下公式计算校准系数：校准系数 = 实际递送体积 / 测得体积 × 120,000。 
	&#8203;注意：120,000 是步骤3.1中使用的流量头校准系数占位值，现根据实测数据进行修正。系统现已根据当前环境温度和湿度条件，针对典型小鼠呼吸完成校准。系统可开始监测受试动物呼吸，且建议每日重新校准一次，以补偿温湿度波动的影响。</li>
</ol>
4. 受试者监测
<ol>
	<li>按照步骤 3.4 所述打开主模板，或完成步骤 4.2 至 4.3。</li>
	<li>在软件中创建一个4 通道窗口，并进行如下数据处理：通道 1：原始数据，采样率为4 k/s，量程为1 mV；通道 2：对通道 1 应用高通1 Hz自动调节滤波器进行数字滤波；通道 3：对通道 2 的数据进行平滑处理，采用 100 个样本的平均法；通道 4：对通道 3 的数据进行体积描记法流量计算（定制流量头，校准公式为：流量 (µL/s) = 120,000 × 电压）。 
	注意：120,000 是针对当前压力传感器计算得出的相关系数；然而，用户应执行步骤 3 中描述的系统校准，并使用用户自定义的相关系数替代该值。</li>
	<li>对通道 4 设置 DataPad 分析，包含以下列：第 1 列：通道 4 数据，注释 &#62; 完整注释文本；第 2 列：通道 4 数据，周期性测量 &#62; 平均周期频率；第 3 列：通道 4 数据，周期性测量 &#62; 平均周期高度。</li>
	<li>将实验对象放入采样室并关闭盖子。本实验使用一只清醒的 4 至 12 周龄雌性白化 C57BL/6J 小鼠（B6(Cg)-Tyrc-2J/J）。</li>
	<li>通过短暂松开鲁尔接口密封帽以平衡采样室内的大气压力（由盖子密封引起），然后重新拧紧。</li>
	<li>在对所有输入信号进行归零（快捷键 Alt-Z）并开始记录之前，观察实验对象在采样室内是否处于无主动运动状态。 
	注意：如果实验对象在采样室内开始移动，基线可能会偏离量程范围，此时可在记录过程中重新对所有输入信号归零，从而在量程范围内生成新的记录。若实验对象在记录期间进行探索或理毛行为，请注明体积描记记录中哪一部分最能准确反映正常呼吸。</li>
	<li>通过右键单击编号的体积描记记录起始位置，然后点击添加注释，以标注实验对象的身份信息。</li>
	<li>将实验对象放回其笼中。为避免窒息和应激，限制其在密闭采样室内的停留时间不超过 5 分钟。 
	注意：由于采样室具有 600 mL 的空气体积，而健康小鼠的呼吸速率通常低于&#60;15 mL/min，因此发生窒息的风险较低。</li>
	<li>使用计算机鼠标选择一段能准确代表实验对象呼吸状态的体积描记曲线。 
	注意：在 DataPad 模块中，预览标题栏将显示呼吸频率（平均周期频率，Hz）和呼吸容积（平均周期高度，µL）的临时读数。可使用添加到 DataPad图标将该预览数据记录至 DataPad。</li>
	<li>继续逐一测量实验小鼠，并将具有代表性的呼吸体积描记片段记录至 DataPad。</li>
	<li>数据记录完成后，将 DataPad 数据导出至 Excel。按以下公式计算每分钟通气量：每分钟通气量 (mL/min) = 呼吸频率 (Hz) × 呼吸容积 (µL) × 0.06。</li>
</ol>

<ol><li>Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+Burkholderia+pseudomallei+capsular+polysaccharide+encoded+by+the+wcb+operon+in+acute+disseminated+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis.</a> Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).</li>
<li>West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pulmonary+infection+and+inflammation+induced+by+inhalation+of+Burkholderia+pseudomallei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei.</a> International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).</li>
<li>Lawrenz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+murine+lung-specific+disease+models+for+Pseudomonas+aeruginosa+applicable+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing.</a> Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiratory+function+in+mice+using+unrestrained+whole-body+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755(2014).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).</li>
<li>Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+abnormalities+in+the+chest+radiograph+and+changes+in+pulmonary+function+in+chronic+bronchitis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema.</a> Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).</li>
<li>Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human melioidosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+a+select+agent-excluded+Burkholderia+pseudomallei+capsule+mutant+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters.</a> Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+secretion+system+cluster+3+is+a+critical+virulence+determinant+for+lung-specific+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441(2015).</li>
<li>Rocco, P. R. M., Zin, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRocco%2C+PRM+%22Anaesthesia%2C+Pain%2C+Intensive+Care+and+Emergency+Medicine%22">Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine</a>. Gullo, A. , Springer. (2002).</li>
<li>Fodah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS One. 9 (9), 107394(2014).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

sWBP 是一种有吸引力的方法，可增强对小型动物模型中呼吸道感染的理解。重要的是，这是一种非侵入性方法，因此在感染攻毒过程中不会对实验动物造成过度应激的显著风险。实际上，监测受试对象呼吸状况的操作是一种快速检测，仅需几分钟且对动物的干预极少。该方法的科学优势在于能够高分辨率地了解微生物病原体在疾病过程中如何影响肺功能。这一方法将为基础研究带来益处，有助于阐明病原体引发疾病的具体机制，同时也具有转化应用价值，可用于评估新型治疗手段如何使受试对象恢复至呼吸健康状态。
本研究中提供的代表性结果针对的是可引发早期嗜睡反应的病原体B. pseudomallei。并非所有细菌性肺部感染在小鼠感染模型中均表现出相同的临床特征。既往其他感染模型的研究经验表明，细菌性病原体Klebsiella pneumoniae在感染小鼠后直至死亡（通常在感染后约第3天）前均表现为无症状感染11。目前推测，机体对吸入空气的需求量（即每分钟通气量）可能与特定疾病所表现出的嗜睡程度密切相关。未来还需进一步研究以明确不同细菌性病原体在呼吸道疾病期间对肺功能的影响。已知不同病原体具有独特的逃避免疫防御机制，包括以下方面的差异：（1）作为胞内或胞外病原体的倾向性；（2）引发早期或晚期低体温反应的能力；（3）使用不同类型的毒力决定因子3,12,13。因此，不同疾病的致病策略可能导致感染期间对肺功能和呼吸产生独特的影响。
本方案中描述的推荐设置可根据sWBP过程中遇到的独特挑战进行调整。在sWBP记录过程中常见的问题之一是受试者在样本室内的活动。如前所述，这种活动会改变基线，从而影响呼吸测量的准确性。可通过使用数字滤波器来校正漂移的基线，从而在存在轻微移动的情况下仍能获得有效的呼吸测量数据。过度活动可能导致基线超出归零输入的测量范围。建议采用1 mV的记录范围（通道1设置），这可在观察体积描记法峰值的同时，避免数据超出量程而丢失。对于活动特别频繁的受试者，可能需要将记录范围扩展至&gt;1 mV，以防止信号持续超出量程。
推荐的操作流程要求每天（或每次实验 session）进行校准，以适应环境温湿度的波动。传统的全身生物电阻抗分析（WBP）采用复杂的计算方法，需同时考虑环境及受试者的温度和湿度因素。5,6已证明，在当前的sWBP装置中，环境温度/湿度对校准源测得的呼吸容积无显著影响。因此，该sWBP方法在本质上不同于 &gt;Drorbaugh 和 Fenn 50 年前提出的方法。在此，sWBP 直接将压力变化与测得的呼吸容积相关联，无需主机进行额外校正。
必须将实验动物的全身体积描记法（WBP）与临床WBP进行对比。sWBP试图采集的生物测量数据包括呼吸容积和呼吸频率。在临床上，这些测量通常使用简易肺量计设备完成，患者将呼吸监测器置于口部，并向监测气流的装置中正常呼吸。在实验动物中进行类似的肺量测定则需要对动物进行束缚，从而导致应激反应，并固有地干扰其呼吸模式。因此，简易肺量测定法在临床上可行，却不适用于实验动物。在临床应用中，WBP用于采集更高级的数据，例如肺残余容积等。此类数据的获取依赖于受试者能够遵从关于呼吸方式的指令，包括用力呼气（通过深呼气排空肺部）。实验动物无法可靠地遵从研究人员的呼吸指令，因此在临床WBP中获得的许多高级测量指标无法在实验动物中重现。实验动物的WBP与临床WBP在本质上是不同的。实验动物WBP旨在以非束缚方式采集基本的通气数据（呼吸频率和呼吸容积），以避免动物应激和呼吸干扰。迄今为止，实验动物中WBP的应用似乎复制了临床WBP所使用的技术，包括基于环境温度、湿度以及受试者体温和湿度的复杂计算，但却无法获取能够遵从用力呼气指令的受试者所产生的高级数据。鉴于此，本研究旨在验证简化版WBP是否足以采集与呼吸系统疾病研究相关的呼吸频率和呼吸容积数据。研究采用了一次校准流程，以补偿环境温度和湿度的任何变化。此外，通过人工小鼠模型证明，受试者的体温和湿度对呼吸容积的测量结果无显著影响。研究得出结论：sWBP在实验动物研究中具有良好的应用价值，且无需使用者对数据进行繁琐的数学处理。

呼吸道细菌病原体常与肺部炎症反应相关，可导致肺组织病理学改变1,2。在临床环境中，肺炎的诊断通常包括痰液培养、血氧饱和度分析以及胸部X光检查。这些技术可被应用于小型动物感染模型，但其中仅血氧饱和度分析可在小鼠中实现对疾病严重程度的快速、实时评估。既往研究曾探讨将血氧饱和度（SpO2）作为监测呼吸系统疾病进展的方法；然而，在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染模型中，濒死小鼠的SpO2读数却意外地偏高3，这并不符合预测性或濒死性疾病的预期表现，可能是因为小鼠能够调节其生理活动。因此，迄今为止尚未确定可用于小鼠细菌性呼吸道疾病的SpO2诊断阈值。
因此，本研究探讨了使用其他临床相关方法来检测肺部疾病对肺功能的影响，作为一种快速的生理学测量手段。简化式全身体积描记法（sWBP）提供了一种快速、无创的生物测量分析方法，可用于研究呼吸频率和深度。先前的研究已展示了如何在实验室中组装WBP设备4；然而，这些研究中所示的多个组件目前在市场上无法购得。此外，传统的WBP需要基于湿度和温度进行复杂的数据采集与处理5,6。因此，研究决定开发一种经每日校准以适应室温/湿度的简化WBP设备，并评估受试者自身温湿度对所测呼吸容积是否存在影响。为此，已构建一种改进的sWBP设备，其组件均采用目前可获取的材料。此外，还进一步研究了该实验室自制设备是否能够检测小鼠致死性呼吸道类鼻疽模型中，随疾病进展所引起的呼吸变化。
本研究构建的sWBP装置采用市售设备和软件，将模拟压力传感器数据转换为数字读出。压力传感器通过贯通式接头安装在密封的玻璃罐上。使用玻璃罐的优点在于其材料具有较高的结构刚性，能够抵抗罐内压力的变化，从而减少对呼吸监测过程中体积变化测量的影响。采样室被设计为在方形罐体的两个平面上各有一个端口，一个通过鲁尔接头接入腔室用于校准，另一个用于安装压力传感器。所选用的压力传感器配备高灵敏度的表压变送器，可检测微小压力变化（量程为25 mbar）。
本方案采用小鼠呼吸系统类鼻疽模型进行演示。Burkholderia pseudomallei（Bp）是类鼻疽的致病菌，该疾病与世界热带地区相关7。Bp存在于自然环境中，尤其存在于静止水体和潮湿土壤中，通常通过易感宿主皮肤的伤口或擦伤引起皮下感染。然而，Bp也可通过吸入感染，并可能通过气溶胶传播被用于生物恐怖主义，构成潜在威胁。虽然具有完全毒力的Bp菌株需在BSL-3实验室中操作，但此前已构建出一种无荚膜突变株，可在BSL-2条件下安全操作，且不列入高致病性病原体管控清单8。此外，已建立一种经气管插管介导的气管内（IMIT）感染模型，用于研究Bp引起的呼吸道疾病进展过程5,9。我们利用该感染模型，对疾病进展至濒死终点期间呼吸模式的变化进行了表征。

<table><tbody><tr><td>1/8&quot; NPT 鲁尔接头</td><td>Amazon</td><td>B07DH9MY8W</td><td>校准端口</td></tr><tr><td>1/8&quot; NPT 转 1/4&quot; NPT 转接头</td><td>Amazon</td><td>B07T6CR6FS</td><td>面板安装接头转鲁尔接头</td></tr><tr><td>150 kΩ 电阻器</td><td>Amazon</td><td>B07GPRYL81</td><td>压力传感器激励电压选择</td></tr><tr><td>3/4&quot; 金刚石钻头</td><td>Drilax</td><td>DRILAX100425</td><td>用于在玻璃罐上钻制面板安装孔</td></tr><tr><td>桥式放大器</td><td>AD Instruments</td><td>FE221</td><td>单通道选项</td></tr><tr><td>面板安装接头</td><td>Legines</td><td>3000L-B</td><td>1/4&quot; NPT，3/4-16 UNF 黄铜面板耦合器</td></tr><tr><td>Chaney 接头</td><td>Hamilton</td><td>14725</td><td>用于设定体积的气密性注射器接头</td></tr><tr><td>DIN 连接器</td><td>AD Instruments</td><td>SP0104</td><td>用于连接压力传感器与桥式放大器</td></tr><tr><td>气密注射器，25 µL</td><td>Hamilton</td><td>80201</td><td>校准用注射器</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>AD Instruments</td><td></td><td>生命科学数据采集软件</td></tr><tr><td>鲁尔堵头</td><td>Cole Parmer</td><td>45513-56</td><td>校准端口封闭件</td></tr><tr><td>PowerLab 4/26</td><td>AD Instruments</td><td>PL2604</td><td>与计算机连接的数字接口</td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Omega Engineering</td><td>PX409-10WGV</td><td>高精度充油式表压传感器</td></tr><tr><td>橡胶垫圈</td><td>Amazon</td><td>B07LH4C8LS</td><td>用于安装面板接头（每个腔室需 4 个）</td></tr><tr><td>方形玻璃罐</td><td>Amazon</td><td>B07VNSPR8P</td><td>600 ml，配有 95 mm 硅胶垫圈</td></tr></tbody></table>

简化型全身体积描记法用于表征呼吸系统类鼻疽期间的肺功能

Simplified Whole Body Plethysmography to Characterize Lung Function During Respiratory Melioidosis

疾病研究的替代动物模型需遵循负责任研究的“3R原则”。随着新技术的不断出现，人们经常重新审视动物模型的优化方法，以确保动物福利和科学认知能够同步发展。本文展示了简化型全身体积描记法（sWBP）在致死性呼吸系统类鼻疽疾病模型中无创研究呼吸衰竭的应用。sWBP具有足够的灵敏度，可在整个疾病进程中持续检测小鼠的呼吸情况，从而对濒死相关症状（如呼吸过缓和呼吸减弱）进行测量，并有望用于制定人道终点判断标准。
在呼吸系统疾病研究中，无创小动物整体身体描记法（sWBP）的优势之一在于，宿主呼出气体的监测是所有生理学检测方法中最能接近评估主要感染组织（即肺组织）功能障碍的一种手段。除了具有重要的生物学意义外，sWBP技术还具有快速、无创的优点，可最大限度地减少实验动物的应激反应。本研究展示了利用实验室自制的sWBP装置，在鼠类呼吸系统类鼻疽病模型中，全程监测呼吸衰竭过程中疾病进展的应用。

系统校准 
数据分析软件支持对自定义流量头（例如本文所述的流量头）进行直接校准。该操作在设置肺量计流量时执行。如步骤 3.1 所述，软件提供输入已知校准空气体积的选项，从而计算系统内的电压与体积之间的相关系数。然而，这种方法仅基于单次读数生成相关系数，而实际观察发现，当校准标准的样本量 n = 1 时，其内在变异导致校准结果实用性较差。当前方法可弥补这一不足，允许用户通过多次读数取平均值来执行每日校准，以计算校准系数。本文展示了注入 20 µL 空气进行校准的操作，该体积代表典型小鼠呼吸时的较高呼吸容积。软件默认设定原点截距为 (0,0)，因此采用此方法时，校准范围为 0–20 µL。
本文提出的sWBP方法每日进行校准，从而能够消除环境湿度/温度波动的影响。针对特定WBP的原始方法可追溯至1955年Drorbaugh和Fenn提出的技术，他们开发了WBP用于测量人类婴儿的通气量5。Drorbaugh和Fenn的计算方法考虑了环境及受试者自身温度和湿度的变化。当前的方法通过每次sWBP实验前进行校准，来校正环境波动的影响。然而，仍有必要探讨小鼠鼻腔/肺部对呼吸气体的加热和湿化是否会影响已知空气体积的测量结果。因此，设计了一套人工装置，以模拟受试动物对校准空气的加热和湿化效应。将鲁尔接头连接至一个15 mL锥形管，并将该密封锥形管串联置于样品室与气密校准注射器之间。首先使用一个置于室温（23 °C）下的空锥形管进行20 µL的校准。随后，在锥形管中加入蒸馏水至鲁尔接头下方，静置以使锥形管顶部空间达到平衡，再次测量校准体积以评估湿度的影响。接着将锥形管放入加热块中，在湿润环境中平衡至37 °C，最后在无水条件下平衡至37 °C，以评估受试者加热效应且无额外湿度贡献的情况。图2显示，所测试的各种条件均未对气密注射器提供的20 µL校准体积产生显著影响。基于此结果，得出结论：sWBP为监测实验动物呼吸提供了一种便捷的方法，无需依赖于动物体温和湿度的复杂计算，因为这些因素对测得的呼吸容积并无显著影响。
受试对象监测 
使用无创全身体积描记法（sWBP）监测由细菌病原体B. pseudomallei引起的致死性呼吸道感染期间的呼吸情况。在清醒动物中监测呼吸的一个挑战是健康正常动物对样本舱内的环境充满好奇，会在舱内移动。小鼠的活动会导致基线持续波动，这一问题可通过在测量前数天内让受试动物预先适应样本舱环境而在一定程度上缓解。该问题主要影响健康小鼠的基线测量，因为在感染过程中动物会变得迟钝，活动减少，从而使sWBP测量更易于管理。尽管可能有人考虑使用某种形式的束缚，无论是物理束缚还是麻醉，但应谨慎对待。使用物理束缚可能因引起应激而影响自然呼吸。此外，已知麻醉剂对呼吸频率和深度具有显著影响10；因此，本研究决定利用实验室自有的sWBP装置评估麻醉的影响。异氟烷常用于感染模型中进行体内诊断成像，因此本实验对一只C57BL/6小鼠实施麻醉，并使用sWBP监测其从麻醉到恢复的全过程。本试验选用一只4周龄的白化C57BL/6J幼鼠，以延长其从麻醉中恢复的时间窗口。图3显示，所用麻醉剂会导致小鼠呼吸频率减慢，但潮气量显著增大。随着小鼠从镇静状态中逐渐恢复，其呼吸频率上升，呼吸容积下降，总体效应是每分钟吸入的空气总量缓慢增加。本试验发现，呼吸容积在恢复后的前30秒内即恢复至麻醉前水平。呼吸频率持续上升，直至从麻醉中移出后2–2.5分钟恢复至基线呼吸水平。分钟通气量的变化趋势与呼吸频率高度一致，在脱离麻醉后2.5分钟内恢复至基线水平。该结果支持在sWBP方法中不应使用麻醉，因为麻醉会显著影响呼吸基线，这并不意外，因其会减缓宿主代谢，从而降低对吸入氧的需求。此外，还应在不同受试对象之间对样本舱进行清洁消毒，以满足特定研究的感染控制要求，并避免尿液或粪便中的信息素对动物间应激水平造成影响。
全身体积描记法（WBP）是一种以非侵入性方式监测呼吸系统疾病模型肺功能的有吸引力的策略。本研究采用sWBP来观察致死性呼吸型类鼻疽感染期间小鼠呼吸模式的变化（图4），其时间点与肺部生物发光监测相对应。观察发现，该模型在感染后约3天进入濒死状态之前，会早期出现嗜睡症状，并以缓慢进展的方式持续存在。此外，在感染第一天内，小鼠的呼吸频率和总吸入气量（每分钟通气量）迅速下降，并在感染的剩余过程中持续保持在较低水平（图4A，C）。这种模式与早期出现并持续至感染后接下来两天的嗜睡症状一致。相比之下，呼吸容积在最初24小时内并未急剧下降，而是呈现轻微且稳定的减少趋势，在为期3天的病程中接近线性下降（图4B）。
<img alt="气体分析装置连接笔记本电脑及数据图表；化学吸收实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：sWBP装置。 定制的样品室由一个带有密封盖的方形玻璃罐制成，其两个平面上安装有贯通接头。其中一个贯通接头用于安装表压传感器，该传感器连接至桥式放大器和数据采集设备模数转换器。 通过 一个8针DIN接口。第二个舱壁安装有鲁尔接头，用于通过气密注射器进行校准。该设备连接至运行软件的计算机。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="在不同温度和湿度条件下测得的体积比较柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：受试者温度和湿度对呼出气体体积的影响。 在20 µL校准注射器与样品室之间串联安装一个带有鲁尔接头的15 mL锥形管。系统在锥形管不额外引入温湿度影响的条件下校准至20 µL。其他测量数据是在锥形管与蒸馏水饱和湿度平衡后，以及/或将其从室温（23 °C）加热至体温（37 °C）后采集的。通过单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验，对每种条件进行n = 5次测量，未检测到显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="呼吸频率和容积分析；图表显示随时间变化的呼吸频率、容积和每分钟通气量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：气体麻醉对小鼠呼吸的影响。 一只4周龄雌性白化C57BL/6J小鼠（8.6 g）使用含3%异氟烷的氧气镇静5分钟，随后转移至sWBP样品室。在停止麻醉后，采集150秒内的呼吸数据。该小鼠在脱离麻醉后约100秒开始出现初步活动行为。（A）麻醉前基线呼吸状态，测得呼吸频率为4.97 Hz，单次呼吸容积为9.74 µL，每分钟通气量为2.91 mL。（B）麻醉恢复期最初60秒内呼吸参数的变化。（A-B）纵轴表示每次呼吸的容积（µL），横轴表示时间（秒）。（C-E）在150秒的麻醉恢复期间采集通气数据，每个时间点的数据均基于≥3个呼吸周期的平均值，分别对应（C）呼吸频率、（D）呼吸容积，以及（E）计算所得的每分钟通气量。各图中均以水平虚线标示麻醉前的基线值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="呼吸频率、潮气量、每分钟通气量随时间变化的曲线图；呼吸数据的分析；比较研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：呼吸道感染类鼻疽对宿主呼吸功能的影响。 选取五只8周龄雌性C57BL/6小鼠，以4.9 log CFU的发光类鼻疽伯克霍尔德菌（B. pseudomallei）菌株JW270进行感染。在为期3天的感染过程中持续进行清醒小动物全身体积描记（sWBP），检测呼吸频率（A）和潮气量（B）。总吸入气量以每分钟通气量（Minute Volume）表示（C）。五只动物的每项数据均独立绘图，并采用三阶多项式回归分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案介绍了简化型全身体积描记仪的构建与使用方法，用于无创监测细菌性呼吸道疾病的进展。

疾病替代动物模型的研究需遵循负责任研究的“3R原则”。人们经常重新审视动物模型的优化方法，以……

简化型全身体积描记法的使用有助于揭示实验动物肺功能与疾病进展之间的关系。该技术的主要优势在于能够采集非束缚状态下动物的呼吸数据。首先进行系统设置，使用八针DIN连接器将采样室连接至桥式放大器，并将桥式放大器连接至数据采集设备。将数据采集设备连接至电源和装有生理数据分析软件的计算机。连接后，启动软件以与数据采集系统建立通信。在软件中下载可选的肺量计模块，并进入肺量计选项卡，在设置窗口中将默认单位从升每秒修改为微升每秒。系统校准过程中，在软件中创建一个四通道窗口。在第一通道中，将采样率设置为每秒 4,000 个数据点，量程设置为 1 毫伏。第二通道将使用高通、1 赫兹、自动调节滤波器对第一通道进行数字滤波。在通道二数据的平滑选项卡中，通过对100个样本取平均值创建通道三。然后，基于通道三数据创建肺量计流量通道四。接下来，设置通道四的数据表分析，包含三列。对于第一列，进入通道四的数据和注释，以获取完整的注释文本。然后设置第二列，使用通道四的数据和循环测量，以选择平均循环频率。对于第三列和通道四的数据，选择循环测量和平均循环高度。在图表显示界面右下角将帧率设置为100比1，并将窗口配置保存为模板，用于后续研究。操作完成后，关闭样品室盖，并将一支25微升气密型注射器连接至引诱剂接头。然后，将注射器安装到Chaney接头上，利用Chaney接头的深度限位装置，向注射器内抽取20微升空气。接下来，在软件中对体积描记仪进行调零，进入设置选项卡，选择“调零所有输入”，然后开始记录。记录过程中，等待基线稳定后，迅速下压并回拉注射器活塞，重复10次，以模拟受试者的呼吸，产生体积为20 µL的定量呼吸。操作完成后，通过右键点击编号的体积描记记录的起始位置停止记录，并点击“添加注释”以标注所测样品的身份信息。重置注射器并将输入信号归零，重复进行两次20 µL脉冲的记录测量。完成三次记录会话中的所有测量后，使用计算机鼠标选择呼吸容积描记图中能准确代表人工20微升呼吸的部分。接着，查看第三列的平均循环高度数据，并根据三次记录计算测得呼吸容积的平均值。打开之前所述的主模板。接下来，将一只4至12周龄、雌性、白化型C57 black 6J小鼠放入采样室，并扣紧盖子。短暂松开引诱剂舱的密封盖以平衡室内的大气压力，然后再次拧紧盖子。在归零所有输入信号并开始记录之前，需确认小鼠在采样室内没有主动活动。通过右键单击编号的体积描记记录的起始位置，然后点击添加注释，来标记受试对象的身份。随后将鼠标移回至笼具位置。选择一段能够准确代表受试对象呼吸状态的呼吸体积描记图部分。在数据记录模块中，数据将显示在预览窗口的标题栏中，临时显示呼吸频率和呼吸容积的读数。可使用“添加到数据记录”图标将数据预览记录到数据记录模块中。依次对每只实验小鼠持续测量各项参数，并将呼吸容积描记的代表性片段记录到数据记录模块中。数据记录完成后，将数据垫中的数据导出至 Excel 并计算每分钟通气量。在全身体积描记法的临床应用中，受试者自身体温以及环境温度和湿度会影响复杂的呼吸计算。在本研究中，简化版全身体积描记法（SWBP）方法对环境温度和湿度的变化进行了控制，结果发现，受试者自身带来的温湿度因素对 20 微升校准体积的呼吸测量准确性无显著影响。研究了吸入性麻醉剂对小鼠呼吸的影响。图中显示了麻醉前的基线呼吸状态以及小鼠从麻醉中恢复期间的呼吸情况。使用首选麻醉剂处理后，小鼠表现出呼吸频率减慢，同时潮气量增大。随着小鼠从镇静状态中恢复，呼吸频率逐渐增加，呼吸容积逐渐减小。类似地，呼吸频率持续上升，直至在撤除麻醉后2至2.5分钟恢复到基础呼吸水平。每分钟通气量紧随呼吸频率的变化，在撤除麻醉后2.5分钟达到基础每分钟通气量水平。在宿主小鼠的呼吸型类鼻疽感染过程中，监测了其呼吸变化。感染首日，小鼠的呼吸频率和总吸入空气量迅速下降，并在疾病后续过程中持续保持在较低水平。相比之下，呼吸容积在最初24小时内并未急剧下降，而是在为期三天的病程中呈现稳定递减的趋势。这些数据表明，呼吸容积可能为小鼠呼吸系统疾病的严重程度提供一种生物识别指标。进行该操作时最重要的是：必须等待小鼠完全静止后再开始记录。有时需要耐心等待，因为好奇的小鼠会探索采样室。该技术将为探索细菌突变体在疾病过程改变期间对宿主肺功能产生不同影响的机制，以及治疗干预如何加速感染小鼠肺功能恢复正常提供新的途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

简化全身体积描记法以表征呼吸类鼻疽期间的肺功能

本文描述了一种磁共振成像方法，用于研究多种生理条件下肺部血流分布情况，具体而言是暴露于三种不同吸入氧浓度（低氧、常氧和高氧）下的情况。该技术在磁共振扫描环境中应用了人体肺部生理学研究方法。...

使用校准动脉自旋标记法对肺灌注进行磁共振成像定量

呼吸生理学的评估传统上依赖于需要对动物进行束缚或麻醉的技术。然而，无束缚式整体容积描记法能够对动物模型的呼吸生理学提供精确、无创且定量的分析。此外，该技术允许对小鼠进行重复的呼吸评估，从而实现纵向研究。...

使用无束缚全身体积描记法测量小鼠呼吸功能

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CT 与 129Xe MRI 可提供互补的肺部结构-功能信息，可通过图像配准用于区域性分析。本文提供了一种基于现有文献的协议，利用开源平台实现 129Xe MR 与 CT...

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三维（3D）相位解析功能性肺成像（PREFUL）是一种功能性磁共振成像（MRI）技术，可在8分钟内通过潮式呼吸及无对比剂的扫描方式，实现对整个人肺容积区域通气功能的定量评估。本文介绍了一种用于采集和分析3D...

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