活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

在这里，我们描述了从幼虫4 C. elegans 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的详细方案。

该协议填补了秀丽隐杆线虫生化研究的技术空白，并扩大了它们作为模式生物的用途。该技术既简单又稳健，可以一致地分离功能活性秀丽隐杆线虫核提取物。首先将同步的L1动物放在10个含有150毫米线虫生长培养基的板上，这些板中播种了大肠杆菌OP50，并允许动物在20摄氏度下生长48小时，直到它们达到L4阶段。

一旦制备了低渗和高渗缓冲液，通过用70%乙醇淹没研磨室来清洁Balch均质机。然后用去离子水冲洗腔室以除去多余的乙醇。将碳化钨球插入磨削室。

盖上Balch均质机枪管的两端，并用提供的指旋螺钉固定盖子。然后，按照文本手稿中所述，为每个样品准备五毫升完整的低渗和高渗缓冲液。接下来，用一毫升完全低渗缓冲液填充无菌的两毫升注射器，并轻轻冲洗Balch均质机的研磨室，在腔室中留下约500微升的完整低渗缓冲液。

将冲洗过的均质机存放在冰上，冷却30分钟。将用M9缓冲液喂养良好的L4动物收集在15毫升锥形管中，并以1， 000次g离心动物三分钟。除去上清液，并继续洗涤动物沉淀，直到上清液清除。

接下来用三毫升冷的低渗缓冲液洗涤动物，并再次离心，如图所示。除去上清液低渗缓冲液后，向动物沉淀中加入一毫升完全低渗缓冲液，并将动物悬浮液转移到新的无菌两毫升注射器中。为了使保持在冰上的动物均质化，轻轻地将动物推过装有钨球的Balch均质机的研磨室。

然后将动物收集回注射器中，并重复此过程30次。经过30个均质循环后，从Balch均质机收集最大的动物悬浮液，并将注射器的尖端向下放置在1.7毫升微管内。取出钨球，并用去离子水清洁研磨室。

干燥并将球放回相应的标记管中。然后将直径为7.9880毫米，间隙为12微米的钨球插入研磨室，并重新密封均质机。用一毫升冰冷的完全低渗缓冲液再次冲洗研磨室。

如图所示，将悬浮液研磨25次。将动物悬浮液转移到干净的1.7毫升微管中，并将悬浮液储存在冰上。通过离心将动物尸体和碎屑沉淀下来。

将40微升的上清液移液到标有输入级分的管中，并将该级分储存在冰上。将剩余的上清液转移到新的1.7毫升管中而不干扰沉淀，并离心以沉淀细胞核。然后在不干扰沉淀细胞核的情况下将上清液转移到标记为胞质级分的新的1.7毫升管中。

为了洗涤细胞核沉淀，向沉淀中加入500微升完整的低渗缓冲液，悬浮沉淀，并在4摄氏度下以4， 000次g离心5分钟。在离心结束时，将核沉淀重悬于500微升新鲜完全低渗缓冲液中，并再次按照所示离心样品。然后将沉淀溶解在40微升完全高渗缓冲液中。

将核悬浮液转移到一个新的1.7毫升管中，标有核馏分，并将其储存在冰上。使用荧光定量试剂盒测定三个组分的蛋白质浓度。将核部分等分到含有六微克核蛋白的一次性管中，并在干冰和乙醇浴中快速冷冻。

将样品储存在零下80摄氏度，直至进一步使用。代表性凝胶图像显示了使用CMV启动子DNA模板的秀丽隐杆线虫L4幼虫核提取物的转录产物。活性核蛋白的成功分离导致体外转录后产生132碱基对条带，分离失败导致条带弱或无条带。

请记住清楚地标记完整的缓冲区。不适当的缓冲液会损害核蛋白的功能。此外，保持均质机冰冷，以防止蛋白质变性。

开发这种技术使研究人员能够在压力条件下测量秀丽隐杆线虫的RNA转录速率，表明动物的转录速率可以根据环境条件而变化。