Name: 活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学习从秀丽隐杆线虫分离功能性活性核提取物的方法，用于体外转录研究。该技术采用Balch匀浆器处理L4期幼虫，为基因表达调控研究提供可靠的生化工具。

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本工作由美国国立卫生研究院MIRA基金（R35GM124678，授予J. S.）资助。

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
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<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

C. elegans 是研究真核生物转录系统的理想模式生物，因其培养成本低且易于进行遗传操作。本文描述了一种从 L4 期 C. elegans 中稳定分离功能活性核提取物的实验方案。尽管本方案重点在于可视化转录活性，但转录后产生的 cDNA 可通过 RT-qPCR 进行定量，从而更精确地测量转录活性8。该从 C. elegans 中分离核蛋白的方法有助于拓展对真核生物转录机制的研究。由于 C. elegans 并非培养皿中的细胞培养物或酵母菌落，而是一种自由活动的多细胞动物，因此对其核提取物的研究可更清晰地揭示转录机制在不同时间或环境条件下的动态变化。这使得研究人员能够充分利用 C. elegans 成本低廉且生命力强的优势。C. elegans 与其他模式生物或细胞培养体系不同，在出现细菌或酵母污染时具有更强的耐受性。一旦发生污染，可利用已建立的实验方案轻松清除 C. elegans 群体中的污染物，从而节省处理污染所耗费的时间与精力<sup class="xre...

小型自由生活的线虫Caenorhabditis elegans是一种结构简单但功能强大的模式生物，可用于研究广泛的生物学问题。自1963年引入以来，该线虫在神经生物学、代谢、衰老、发育、免疫和遗传学等领域的问题解答中发挥了不可估量的作用1。这种生物具备多种使其成为理想模式生物的特征，包括较短的世代时间、高效的RNA干扰效应、透明的身体，以及完整的细胞谱系图和神经系统图谱。
尽管线虫对科学的贡献巨大，但其在阐明真核生物转录系统方面的应用仍显不足，目前我们对这些机制的理解主要来自利用酵母、果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物所开展的研究2。阻碍研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质蛋白、糖蛋白和脂质组成，使得从幼虫期到成虫期的C. elegans均能抵抗化学或机械力诱导的蛋白质提取3。曾有研究建立了一种使用C. elegans核提取物的体外转录系统，但由于该系统应用范围有限，且提取过程中使用Dounce匀浆器可能导致蛋白质不稳定，因而未被广泛采用4,5。
与之前使用Dounce匀浆器破碎线虫（C. elegans）来制备核提取物的方案不同，本方案采用Balch匀浆器。Balch匀浆器由两个主要部件组成：一个碳化钨球和一块带有贯穿通道的不锈钢块。将碳化钨球装入Balch匀浆器中，并在两端加盖以密封研磨腔。两个垂直端口可连接注射器，通向研磨腔。当样品通过注射器从一侧推至另一侧经过研磨腔时，注射器产生的压力迫使样品通过碳化钨球与腔壁之间的狭窄缝隙。这种缓慢而持续的压力使样品不断破碎，直至其颗粒大小均匀并能轻松通过该缝隙。通过稳定而温和的压力迫使线虫（C. elegans）通过狭窄缝隙，可使虫体破裂，将其内容物释放到周围的缓冲液中。更换更小尺寸的碳化钨球可进一步缩小缝隙，从而破碎刚释放出的细胞，使细胞核游离进入缓冲液。随后通过多次离心步骤，将细胞核与其他细胞碎片分离，从而获得纯净的核提取物。相比Dounce匀浆器，Balch匀浆器具有多项优势：该系统可处理大量线虫，使单次实验即可获得较大量的活性蛋白；碳化钨球与不锈钢块经过精密加工，可在多个样品间实现一致的研磨效果；厚重的钢块可作为散热片，均匀地将热量从研磨腔导出，防止蛋白变性。
分离后，在将核提取物用于任何生物化学实验之前，必须验证其转录活性。传统上，转录活性通过使用放射性标记的核苷酸来追踪和可视化新合成的RNA进行测定。然而，放射性标记可能带来操作负担，因其在使用和处置过程中需要采取特殊防护措施。6技术进步使得研究人员如今能够采用危害更小或更简便的方法，通过定量实时荧光PCR（qRT-PCR）等技术来检测极微量的RNA。7. 本文所述方案介绍了一种从四龄幼虫（L4）中分离活性核提取物的方法 秀丽隐杆线虫 并可视化转录活性在其中的 体外 系统.

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;耗材与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 8联管 &amp;amp; 平板盖片，透明</td><td>Genesee Scientific</td><td>&amp;nbsp;24-706</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 单个 PCR 管</td><td>Genesee Scientific</td><td>&amp;nbsp;24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 无菌微量离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% 绝对分子级乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇，Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&amp;nbsp;V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR 国际公司</td><td>&amp;nbsp;89130-898</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Tritech Research</td><td>&amp;nbsp;T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>&amp;nbsp;28-103</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 塑料注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Norm-Ject 注射器</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 真空滤杯，0.22 &amp;micro;m PES，Stericup Millipore Express Plus</td><td>默克生命科学</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清移液管</td><td>VWR 国际公司</td><td>&amp;nbsp;89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>VWR 国际</td><td>&amp;nbsp;89130-896</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，Criterion</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;C7432</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>德文特科学</td><td>&amp;nbsp;CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>酒精检测标记物</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto蛋白胨</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;90000-264</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt;</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>默克生命科学</td><td>&amp;nbsp;C4901</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;C8667</td><td></td></tr><tr><td>对照DNA模板克隆引物，正向5′&amp;rsquo;- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>对照DNA模板克隆引物，正向5′&amp;rsquo;- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;15508-013</td><td></td></tr><tr><td>DNA凝胶染料，SYBR safe</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA分子量标准混合物，O&amp;rsquo;基因尺</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;SM1173</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA上样缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;FERR1161</td><td></td></tr><tr><td>DNase，Baseline-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&amp;nbsp;DB0715K</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; OP50 菌株</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A38</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 核提取物体外转录系统，HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&amp;nbsp;E3110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES溶液，1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 37%</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;P0662</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸盐漂白剂</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;L3022</td><td></td></tr><tr><td>二氯化镁</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;M7506</td><td></td></tr><tr><td>中等重量称量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，Vista Vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>分子级水，Hypure</td><td>Hyclone 实验室</td><td>&amp;nbsp;SH30538</td><td></td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR系统，含预混液A的FailSafe</td><td>Lucigen</td><td>&amp;nbsp;FS99100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克生命科学</td><td>&amp;nbsp;P39111</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;P3786</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;P0662</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂，Halt 单次使用混合液 100x</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>蛋白定量试剂盒，Qubit</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;Q33211</td><td></td></tr><tr><td>逆转录试剂盒，Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒 RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>应用生物系统公司</td><td>&amp;nbsp;N8080119</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;1-09137</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器，孔径0.2 &amp;micro;m 聚醚砜膜</td><td>VWR 国际公司</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR International</td><td>&amp;nbsp;200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>转录引物，上游 5&amp;rsquo;- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转录引物，反向 5&amp;rsquo;-cgg cca aag cgg tcg gac agt-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&amp;nbsp;P2287</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;deg;C孵箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C型冰箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 冷冻箱</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch匀浆器，isobiotec细胞匀浆器</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>离心机，Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>离心机，VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜，Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统，iBright FL1500</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;A44241</td><td></td></tr><tr><td>凝胶系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机，Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-1000 XLS+，Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-10 XLS+，Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-200 XLS+，Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-20 XLS+，Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>摇床平台</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler，Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

活性分离 秀丽隐杆线虫 核提取物制备与重组 体外 转录

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

秀丽隐杆线虫 自1963年引入以来，一直是生物学研究的重要模式系统。然而 秀丽隐杆线虫 在利用其核提取物进行生物反应的生化研究中尚未得到充分利用，例如 体外 转录和DNA复制。使用该方法的一个重大障碍是 秀丽隐杆线虫 在生化研究中，一个关键挑战是在不损害核提取物活性的前提下破坏线虫厚实的外角质层。尽管已有多种方法用于破坏角质层，例如Dounce匀浆或超声处理，但这些方法常导致蛋白质不稳定。目前尚无从幼虫或成虫中分离具有活性的核蛋白的成熟方案。 秀丽隐杆线虫 用于 体外 反应。在此，本方案详细描述了四龄幼虫的匀浆化过程 秀丽隐杆线虫 使用Balch匀浆器。Balch匀浆器利用压力将动物缓慢挤过狭窄缝隙，从而在此过程中破坏角质层。Balch匀浆器结构均一、加工精密，可在不同实验间实现动物样品均一且可重复的研磨。将Balch匀浆器获得的匀浆液进行分级分离，可得到具有功能活性的核提取物，可用于 体外 检测转录活性的方法 秀丽隐杆线虫.

按照上述步骤操作应可获得具有功能的核提取物(图 1)，若研磨或洗涤步骤出现偏差，可能导致活性不佳或得率低下。若成功获得具有功能的C. elegans核提取物，则将其加入前述的体外检测体系后，可转录DNA模板上CMV启动子下游的区域。所产生的RNA转录本可通过常规方法从核蛋白和DNA模板中纯化出来。在无DNA模板的情况下，逆转录及后续PCR产物只能来源于核提取物所转录的RNA。PCR产物可在琼脂糖凝胶上进行观察，DNA条带的强度可反映核蛋白与RNA分离的质量。条带信号微弱可能是由于核提取物因加热失活或缓冲液配制不当所致。条带信号过强则可能源于DNA污染，原因包括RNA纯化不充分或DNase消化不完全。稳定且成功的核提取应产生强度相近的条带，且转录和PCR的阴性对照均应无可见的PCR产物(图 2)。
...

此处，我们介绍一种从4龄幼虫阶段分离活性核提取物的详细方案 秀丽隐杆线虫 并可视化转录活性在其中的活动 体外 系统

自1963年被引入以来，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）一直是生物研究中的重要模式生物系统。然而，C. elegans 尚未得到充分……

该方案填补了秀丽隐杆线虫（C.elegans）生化研究中的技术空白，拓展了其作为模式生物的应用价值。此技术既简单又可靠，能够稳定地分离出具有功能活性的秀丽隐杆线虫核提取物。首先，将同步化的L1期线虫接种于10个含有大肠杆菌OP50的150毫米线虫生长培养基平板上，在20摄氏度条件下培养48小时，直至线虫发育至L4期。配制好低渗和高渗缓冲液后，用70%乙醇充满Balch匀浆器的研磨腔以进行清洗。随后用去离子水冲洗研磨腔，以去除残留的乙醇。将碳化钨球放入研磨腔中。用盖子封闭 Balch 匀浆器筒的两端，并用提供的拇指螺丝固定盖子。然后按照文本稿件中的描述，每份样品准备 5 毫升完全低渗缓冲液和高渗缓冲液。接下来，用无菌的 2 毫升注射器吸取 1 毫升完全低渗缓冲液，轻轻冲洗 Balch 匀浆器的研磨腔，使约 500 微升的完全低渗缓冲液留在腔内。将冲洗后的匀浆器置于冰上，冷却30分钟。用M9缓冲液收集喂养充分的L4期动物至15毫升锥形管中，在1,000 × g离心3分钟。弃去上清液，并继续洗涤动物沉淀，直至上清液澄清。随后用 3 毫升冷的低渗缓冲液洗涤动物样品，并如前所述再次离心。去除上清液中的低渗缓冲液后，向动物沉淀中加入 1 毫升完全低渗缓冲液，将动物悬液转移至一个新的无菌 2 毫升注射器中。为在冰上匀浆动物样品，轻轻推动注射器使动物样品通过装有钨球的 Balch 匀浆器研磨腔。然后将动物样本重新收集到注射器中，重复此操作30次。经过30次匀浆循环后，从Balch匀浆器中收集尽可能多的动物悬液，并将注射器尖端朝下置于1.7毫升微量离心管中保存。取出钨珠，并用去离子水清洗研磨腔。干燥后将球放回相应标记的试管中。然后将直径为7.9880毫米、间隙为12微米的钨球插入研磨室，并重新密封匀浆器。再次用1毫升冰冻的完全低渗缓冲液冲洗研磨室。按所示方法研磨悬浮液25次。将动物悬浮液转移至一支洁净的1.7毫升离心管中，并将悬浮液置于冰上保存。通过离心沉淀动物体及碎片。用移液器将40微升上清液转移至标记为输入组分的离心管中，并将该组分置于冰上保存。将剩余的上清液转移至一个新的1.7毫升离心管中，注意不要扰动沉淀，然后离心以沉淀细胞核。随后，将上清液（不要扰动已沉淀的细胞核）转移至另一个标记为胞质组分的新1.7毫升离心管中。为洗涤细胞核沉淀，向沉淀中加入500微升完全低渗缓冲液，重悬沉淀，并在4摄氏度下以4,000 × g离心5分钟。离心结束后，将细胞核沉淀重悬于500微升新鲜的完全低渗缓冲液中，再次按上述条件离心样品。然后将沉淀溶解于40微升完全高渗缓冲液中。将核悬液转移至新标记为“核组分”的1.7毫升离心管中，置于冰上保存。使用荧光定量试剂盒测定三个组分的蛋白质浓度。将核组分分装至含有6微克核蛋白的单次使用离心管中，于干冰与乙醇混合物中快速冷冻。将样品储存在零下80摄氏度，直至进一步使用。代表性凝胶图像显示了使用CMV启动子DNA模板时，秀丽隐杆线虫L4幼虫核提取物的转录产物。成功分离出有活性的核蛋白后，在体外转录中产生一条132个碱基对的条带；而分离不成功则导致条带微弱或无条带出现。请务必清楚标记完整的缓冲液。不合适的缓冲液可能损害核蛋白的功能。同时，保持匀浆器处于冰冻状态，以防止蛋白质变性。开发这一技术使研究人员能够测量秀丽隐杆线虫（C.elegans）在应激条件下的RNA转录速率，结果表明该动物的转录速率会随环境条件的变化而改变。

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

本文介绍了一种从雄性 C. elegans...

分离与 体外 激活 秀丽隐杆线虫 精子

本方案描述了用于Entamoeba histolytica...

体外 tRNA 甲基化实验：使用溶组织内阿米巴 DNA 和 tRNA 甲基转移酶 Dnmt2 (Ehmeth) 酶

采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C.

使用微阵列和实时 PCR 确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱

本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。...

研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

本方案描述了如何研究细胞命运转换过程中的细胞活动 体内秀丽隐杆线虫利用转基因动物，通过热激启动子驱动神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 的过表达，并结合RNAi介导的染色质调控因子 LIN-53 的耗竭，可观察到生殖细胞向神经元的重编程过程 体内.<br...

在 C. elegans 中应用 RNAi 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本文介绍了一种从同一样本中同时分离 RNA、DNA...

Caenorhabditis elegans 中的核酸与蛋白质联合提取

本文介绍一种从转基因生物中简单分离表达绿色荧光蛋白的特定活神经元细胞群的实验方案 秀丽隐杆线虫 线条.

从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

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本文介绍了一种使用市售组织试剂盒从一个或少数几个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

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本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans...

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫

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活性分离秀丽隐杆线虫核提取物制备与重组体外转录

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