建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

我们今天介绍的技术能够分析脊髓神经元活动，该活动受神经元内在因素以及周围星形胶质细胞影响。该技术可稳定地生成具有脊髓特异性的功能性人源神经元和人源星形胶质细胞，并采用可量化、可重复的功能性输出指标。本技术可用于研究脊髓特异性神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症，可使用来自散发性或遗传性疾病的患者神经元进行相关研究。

首先，检查人iPSC培养板，观察是否具有足够密集的克隆，且克隆中心出现散在的白色区域。随后开始进行细胞包装，在培养板底部外表面用记号笔绘制网格线，以帮助准确覆盖整个培养板。在超净台内使用10倍放大倍率的相差显微镜，通过200微升移液器枪头手动刮除已分化的克隆，使其脱离。

接下来，用 PBS 清洗平板两次。然后加入 5 mL 预先在 37°C 下温育的组织解离蛋白酶。将细胞在 37°C 下孵育 4 至 7 分钟，直至克隆边缘开始变圆，再进行克隆从培养板上的剥离操作。

小心吸除消化用蛋白酶，并用 PBS 轻轻冲洗培养板两次，注意不要使细胞集落脱落。向培养板中加入 5 mL 预热的人诱导多能干细胞（iPSC）培养基。然后用 5 mL 移液器枪头从上至下前后刮擦整个培养板表面，同时将细胞集落刮起并破碎成较小的细胞团块。

将人iPSC诱导分化为神经前体细胞。当人iPSC形成单层且融合度达到90%时，按照文中的描述开始分化。第12天经胰蛋白酶处理后，若细胞未悬浮，可使用1000微升移液器枪头将神经诱导培养基以环形方式吹打至细胞表面，使其覆盖整个培养区域，从而机械性地分离细胞。

如果神经前体细胞培养物已被冷冻，则将其解冻。按照文稿中所述进行培养基更换和PBS洗涤后，更换为含有0.02微摩尔阿糖胞苷的运动神经元分化培养基，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养48小时，此时胶质定向前体细胞作为单个增殖的扁平细胞出现在处于有丝分裂后阶段的运动神经元前体细胞下方，并在细胞簇中聚集。随后，按照文稿中所述进行培养基更换。

在铺板当天或前一天，开始包被24孔MEA板。首先将PLO溶于水或PBS中进行稀释，然后向每个孔中加入15至20微升PLO，使液体在孔中央形成液滴，覆盖电极区域，注意移液枪头不要损伤电极。向孔周围的腔室中加入水，以确保足够的湿度。

将PLO在37摄氏度孵育1至2小时。然后使用塑料微量移液器吸头，尽可能吸除PLO溶液，注意不要触碰电极。接着用250微升水洗涤孔板三次。

使用移液枪枪头尽可能吸除水分，并在打开盖子的情况下让表面干燥。接着，加入15至20微升稀释后的层粘连蛋白，以覆盖每个电极阵列。向湿度槽中加入水并盖上盖子后，在37摄氏度下孵育至少两小时，最长可过夜。

铺板当天，用 PBS 将运动神经元和星形胶质细胞培养物冲洗一次后，加入 0.05% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育约五分钟以使细胞脱落。将细胞收集至含有胰蛋白酶抑制剂的 15 毫升锥形管中，并用培养基或缓冲液冲洗培养板，以确保所有细胞均被收集。

通过离心沉淀细胞。然后使用1000微升移液器，用含有20微摩尔ROCK抑制剂的共培养基重悬运动神经元和星形胶质细胞，制备成1毫升单细胞悬液。使用血细胞计数板对运动神经元和星形胶质细胞进行计数。

计数的同时，将细胞悬液置于四摄氏度的泡沫塑料架上。取一毫升两种细胞悬液，于300 × g 离心五分钟。计算所需体积，并重悬细胞沉淀。

按相等比例混合所需体积的神经元和星形胶质细胞悬液，轻轻吹打两次，充分混匀。随后吸除每孔中的层粘连蛋白，并将10 µL最终混合的细胞悬液转移至各孔，形成覆盖电极阵列的小液滴。将细胞液滴在37°C条件下静置孵育20至30分钟，使细胞在孔板上形成初始贴附。

然后将含有ROCK抑制剂的250微升预热共培养基沿每个孔的孔壁缓慢加入，并在每个孔的对侧孔壁同样加入相同体积的培养基，将培养板置于37°C孵育24至36小时。次日，观察培养板中是否有碎片或死亡细胞。如有需要，更换为新鲜的含ROCK抑制剂的共培养基。

否则，从共培养第二天开始，使用不含ROCK抑制剂的共培养基，每周进行两次半量换液。进行记录时，应从共培养第一天后尽快开始，将温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。然后将培养板转移至记录仪器，平衡至少五分钟后再开始记录。根据实验设计，每隔一天或每周记录一次基线活性，每次持续1至15分钟。

为了研究靶向神经元或星形胶质细胞的化合物的瞬时电生理效应，需移除培养板盖，但保持仪器盖关闭，记录至少一分钟的基础电活动。在不停止电生理记录的情况下，手动打开仪器盖，用适当的药物溶剂置换25微升培养基。然后手动关闭盖子，并根据需要继续记录数分钟。

同样，测试目标药物。在本方案中，hiPSCs 以非融合集落的形式进行培养和传代。通过抑制 BMP 和 TGF-β 通路的双重 SMAD 抑制来启动神经发生。

由此产生的神经上皮干细胞分裂并形成多层上皮结构。早期暴露于神经元生长因子和促胶质生成的睫状神经营养因子，产生了一群混合的前体细胞。神经元从这群混合前体细胞中自发出现。

通过激活JAK-STAT通路，促胶质细胞转换诱导了星形胶质细胞的分化。经Notch抑制剂处理并分化的运动神经元细胞表现出脊髓特性，这由高水平的胆碱乙酰转移酶表达所支持。在体外培养第90天，人iPSC来源的星形胶质细胞表现出成熟表型，表现为S100β和GFAP的表达，而其脊髓区域特性则由Hb9的表达所支持。

共培养的细胞自发地重新排列，星形胶质细胞在底部形成一层滋养层，而神经元在顶部连接成网络。单独培养时，神经元会聚集形成大的细胞簇；而将人iPSC来源的运动神经元与人iPSC来源的星形胶质细胞共培养，则形成了均匀分布的单层结构。人iPSC来源的星形胶质细胞促进了人iPSC来源运动神经元的电生理成熟，共培养体系中神经元的放电和簇状放电活动显著增强即证明了这一点。

根据我们的经验，干细胞培养和早期神经前体细胞分化是最具挑战性且对技术误差最为敏感的步骤。在此阶段，相关技术操作必须保持高度的一致性和准确性，容错空间极小。本文所述的共培养技术也可应用于其他细胞类型特异性的模型中。