使用双氟比度显微镜测量巨无素体的pH值、重度化学和降解能力

我们描述了测量活细胞中单个巨细胞体中的pH值、氧化事件和蛋白质消化的方案。强调双氟比显微镜及其提供的优势，而不是基于人群的技术。

此协议允许对单个宏皮诺体流明内的各种过程和生化参数进行实时评估。这些方法可用于巨脊细胞增多症细胞生物学中的药物发现。此协议提供了在细胞和细胞器水平上揭示异质性的优势。

一天前，测定种子Raw264.7细胞的密度为每井100微升细胞的5倍，在玻璃底96井板中，有黑色侧面。在检测当天检查油井是否至少70%的汇流。然后用100微升HBSS清洗所有油井，预制在37摄氏度。

接下来，在每口井中加入100微升HBSS，每毫升含有0.025毫克TMR标记为70千达尔顿德克斯特拉和每毫升标有70千达尔顿德克斯特兰的荧光素0.025毫克，然后在37摄氏度下孵育细胞15分钟。孵化完成后，从孵化器中取出板，用100微升HBSS洗细胞6次。最后一次洗涤后，将100微升预热HBSS加入细胞，然后将板放在具有加热阶段和腔室的显微镜上。

根据需要调整 TMR 和荧光素的激发和排放参数后，从每口井之间的两个荧光片之间交替获取图像。第一次收购后，检查所有油井是否在整个板块中保持聚焦，然后以所需的时间长度以 1 到 15 分钟的间隔获取每口油井的图像。在图像采集过程中，使用 10 摩尔盐酸或 10 摩尔氢氧化钾，将富含钾溶液的 50 毫升阿利奎特的 pH 值调整为 7.5。

然后调整用25毫摩尔MES缓冲的富钾溶液350毫升的pH值到pH值6.5，pH 5.5和pH5.0。图像采集完成后，从含有细胞的 96 井板中取出 HBSS，并在 pH 7.5 中加入富含钾的溶液。然后加入尼日尔辛，最终浓度为每毫升10微克。

将板放回显微镜上，使用与之前相同的采集设置获取每口井的图像。为了测量巨细胞素中的氧化事件，在检测前一天，将RAW264.7细胞种子在96井盘中，如前所述。然后在检测当天用100微升HBSS预制到37摄氏度的油井清洗所有水井。

接下来，在每口井中加入100微升HBSS，每毫升含有0.025毫克TMR标记为70千达尔顿德克斯特拉和每毫升标记为70千达尔顿德克斯特兰的0.025毫克，然后在37摄氏度下孵育细胞15分钟。从孵化器中取出板后，用 100 微升 HBSS 洗涤细胞六次。最后一次清洗后，在每口井中加入100微升HBSS，并将板放在显微镜上。

根据需要调整 TMR 和 H2DCFDA 的激励和排放参数后，以之前演示的 1 到 15 分钟间隔获取每口井的图像。为了测量巨细胞子中的蛋白质消化，在检测前一天播种RAW264.7细胞，如前所述。然后在检测当天，用100微升HBSS预制在37摄氏度下清洗所有油井。

接下来，在每口井中加入100微升HBSS，每毫升TMR含有0.025毫克，每毫升标有70千达尔顿德克斯特兰，每毫升标有椭圆形布明0.2毫克。然后在37摄氏度下孵育盘子15分钟。从孵化器中取出细胞后，用100微升HBSS洗6次。

最后一次清洗后，在每口井中加入100微升HBSS，然后将板放在显微镜上。根据需要调整 TMR 和 BODIPY 的激励和排放参数后，以前所示的一到 15 分钟间隔获取每口井的图像。在测量巨皮诺体中的pH值、氧化事件或蛋白质降解时，酸化的动态无法测量一定的时间段，而排毒性加载阶段因所使用的细胞类型而异。

测量巨氨糖体pH值时，荧光素与TMR的比率将逐渐变小，并在采集后的15分钟内趋于稳定。此高原对应于大约 5 的 pH 值，大致匹配溶酶体的 pH 值。每次收购结束时，都会进行原地校准。

荧光素与TMR比率应在pH 7.5校准缓冲区内最大，并且随着校准缓冲器的酸性增加而逐渐变小。这允许生成校准曲线。在测量宏皮诺体内的氧化事件时，H2DCFDA 与 TMR 的比例将逐渐扩大，并很可能在激活的 RAW264.7 细胞的前 20 到 30 分钟内稳定下来。

在测量巨皮诺骨蛋白消化时，随着椭圆蛋白的消化，一个逐渐强烈的荧光素信号将被释放。在RAW264.7细胞中，从被消化的BODIPY标记的椭圆形布明中释放出来的荧光增加，将在前30分钟内稳定下来。随着这种新兴的作用，在平衡和它新发现的相关癌症病理学，复兴巨脊细胞增多的研究目前正在进行。

这些方法提供了一个工具箱，用于探索巨脊细胞增多对这些研究领域的贡献。