利用双荧光探针比率显微镜测量巨胞饮体的pH值、氧化还原化学状态及降解能力

该方案可实现对单个巨胞饮体腔内多种过程及生化参数的实时评估。这些方法可用于巨胞饮作用细胞生物学领域的药物发现。该方案的优势在于能够揭示细胞水平和细胞器水平的异质性。

在检测前一天，将 Raw264.7 细胞以每孔 100 微升中含 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于黑色侧壁的玻璃底 96 孔板中。在检测当天，检查各孔细胞是否至少达到 70% 汇合度。随后用 37 摄氏度预热的 100 微升 HBSS 洗涤所有孔。

接下来，向每个孔中加入 100 µL 含有 0.025 mg/mL TMR 标记的 70 kDa 右旋糖酐和 0.025 mg/mL 荧光素标记的 70 kDa 右旋糖酐的 HBSS，然后将细胞在 37°C 下孵育 15 分钟。孵育结束后，从孵箱中取出培养板，用 100 µL HBSS 洗涤细胞 6 次。最后一次洗涤后，向细胞中加入 100 µL 预热的 HBSS，然后将培养板置于配备加热载物台和培养室的显微镜上。

根据需要调整TMR和荧光素的激发和发射参数后，依次在每孔之间交替两种荧光染料，采集每孔的图像。首次采集后，检查整个培养板的所有孔是否均保持在焦平面内，随后以1至15分钟的时间间隔持续采集各孔图像，直至达到所需时长。在图像采集过程中，使用10摩尔盐酸或10摩尔氢氧化钾，将50毫升含25毫摩尔HEPES缓冲的富钾溶液的pH值调节至7.5。

然后将含有25毫摩尔MES缓冲液的350毫升高钾溶液分别调节pH至6.5、5.5和5.0。图像采集完成后，移除含有细胞的96孔板中的HBSS，加入pH为7.5的高钾溶液，随后加入尼日霉素，使其终浓度为10微克/毫升。

将培养板重新放回显微镜上，并使用与之前相同的采集参数获取每个孔的图像。为检测巨胞饮泡内的氧化事件，需在检测前一天按照之前所述方法将RAW264.7细胞接种于96孔板中。然后在检测当天，用100 µL预热至37 °C的HBSS缓冲液洗涤所有孔。

接下来，向每个孔中加入 100 µL 含有 0.025 mg/mL TMR 标记的 70 kDa 右旋糖酐和 0.025 mg/mL H2DCFDA 标记的 70 kDa 右旋糖酐的 HBSS，然后将细胞在 37°C 下孵育 15 分钟。从孵育箱中取出板后，用 100 µL HBSS 洗涤细胞 6 次。最后一次洗涤后，向每个孔中加入 100 µL HBSS，并将板置于显微镜下。

根据需要调整TMR和H2DCFDA的激发和发射参数后，按照此前所示方法，每隔1至15分钟对每个孔采集图像。为测量巨胞饮泡内的蛋白质消化，在检测前一天接种RAW264.7细胞，操作如前所述。然后在检测当天，用100微升在37摄氏度预温的HBSS洗涤所有孔。

随后，向每孔加入100 µL含0.025 mg/mL TMR标记的70 kDa葡聚糖和0.2 mg/mL BODIPY标记的卵清蛋白的HBSS溶液。然后将培养板在37°C孵育15分钟。从孵箱中取出细胞后，用100 µL HBSS洗涤6次。

最后一次洗涤后，向每个孔中加入 100 微升 HBSS，然后将培养板置于显微镜下。根据需要调整 TMR 和 BODIPY 的激发和发射参数，按照之前所示的方法，以 1 至 15 分钟的间隔采集每个孔的图像。在测量巨胞饮泡中的 pH 值、氧化事件或蛋白质降解时，由于存在葡聚糖加载阶段，该阶段持续时间因所用细胞类型而异，因此在该时间段内无法检测酸化动力学变化。

在测量大胞饮体pH值时，荧光素与TMR的比值会逐渐减小，并在采集开始后的15分钟内达到平台期。该平台期对应的pH值约为5，与溶酶体的pH值大致相符。每次采集结束时，均进行原位校准。

在 pH 7.5 的校准缓冲液中，荧光素与 TMR 的比值应最大，并随着校准缓冲液酸性增强而逐渐减小。这可用于生成校准曲线。在测量大胞饮体内的氧化事件时，H2DCFDA 与 TMR 的比值将逐渐增大，并在活化的 RAW264.7 细胞中前 20 至 30 分钟内可能达到平台期。

在检测大胞饮体蛋白消化时，随着卵清蛋白被消化，会逐渐释放出强烈的荧光素信号。在 RAW264.7 细胞中，来自消化后的 BODIPY 标记卵清蛋白的荧光增加将在前 30 分钟内达到平台期。由于大胞饮作用在稳态中的作用及其在癌症病理学中的新发现意义，目前正掀起一场大胞饮作用研究的复兴。

这些方法为研究巨胞饮作用在这些领域中的贡献提供了工具箱。