Name: 柚皮素溶液的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习制备柚皮素溶液用于药理学药物筛选研究，采用DMSO、Tween 80和生理盐水混合溶解法。该方法操作简便、成本低廉，适用于评估抗糖尿病和骨质疏松效应的体内实验研究。

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本工作得到国家自然科学基金（81973607 和 81573992）的资助。

所描述的研究符合美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的要求，并经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准。进行实验时，出于安全考虑，必须穿戴实验服、一次性丁腈手套和护目镜。
1. 溶剂的制备及柚皮素用量的估算 体内 应用
<ol>
	<li>配制以下溶剂：Tween-80（终浓度范围：0.5%–1%）、DMSO、甘油（终浓度范围：15%–20%）、乙醇（肌肉注射时终浓度为12%）22，以及0.9% PS。</li>
	<li>根据剂量、小鼠数量和注射频率估算所需柚皮素的量。
	<ol>
		<li>订购10只小鼠（C57BL/6，雄性，5周龄，SPF级），每周给予柚皮素5天，持续8周。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。 
		注意：腹腔注射所需剂量为 20 mg/kg b.w.23.</li>
		<li>根据以下计算称取160 mg柚皮素：20 mg/kg × 0.02 kg/只 × 10只 × 5天/周 × 8周 = 160 mg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算待注射柚皮素的浓度 体内.
	<ol>
		<li>根据小鼠体重准备推荐体积。每只小鼠给予的柚皮素推荐剂量为体重的1%（0.3 mL）。本实验中，每只小鼠使用0.2 mL。</li>
		<li>计算总体积：0.2 mL/只 × 10只 × 5天/周 × 8周 = 80 mL。</li>
		<li>计算柚皮素储备液的浓度：160 mg / 80 mL 溶剂 = 2 mg/mL。</li>
		<li>计算每日所需体积：每只小鼠 0.2 mL × 10 只小鼠 = 2 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶解
<ol>
	<li>乙醇溶液
	<ol>
		<li>配制2 mg/mL的柚皮素溶液：称取3.52 mg柚皮素，加入2.0 mL离心管中。 
		注意：为达到 2 mg/mL 的浓度，所需总体积为 1760 µL（计算：3.52 mg/1760 µL = 2 mg/mL）。</li>
		<li>快速离心（2000 × g） g 30 秒）以使柚皮素粉末沉降至管底（图1A).</li>
		<li>向离心管中加入8.8 µL的100%乙醇，以配制相对于所需总体积的0.5%（v/v）溶液2柚皮素不能完全溶解图1B).</li>
		<li>继续向管中加入 79.2 µL 的 100% 乙醇，以配制相对于所需总体积的 5% (v/v) 溶液（计算公式：(79.2 µL + 8.8 µL) / 1760 µL × 100% = 5%）。柚皮素未完全溶解图1B).</li>
		<li>向步骤 2.1.4 中所述含有 5% 乙醇的试管中加入 1672 µL 的 0.9% PS。这将形成一种乳剂（图1D）。离心（2000 × g） g 30秒）以检查柚皮素是否完全溶解于溶液中。未溶解的柚皮素会在溶液中形成白色沉淀。图1E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DMSO 溶液
	<ol>
		<li>配制2 mg/mL的柚皮素溶液：称取3.95 mg柚皮素，加入2.0 mL离心管中。 
		&#8203;注意：为达到 2 mg/mL 的浓度，所需总体积为 1975 µL（计算过程：3.95 mg/1975 µL = 2 mg/mL）。</li>
		<li>快速离心（2000 × g） g 30 秒）以使柚皮素粉末沉降至管底。</li>
		<li>向管中加入 9.8 µL DMSO，配制 0.5% (v/v) 溶液（计算：9.8 µL / 1975 µL × 100% = 0.5%）。柚皮素完全溶解。图2A).</li>
		<li>加入88.2 µL DMSO至离心管中，配制相对于所需总体积的5% (v/v) 溶液（计算公式：(88.2 µL + 9.8 µL) / 1975 µL × 100% = 5%）。柚皮素完全溶解图2B).</li>
		<li>向步骤 2.2.4 中制备的溶液中加入 1877 µL 0.9% PS（体积分数为 95%）。将形成乳液（图1C）。离心（2000 × g） g 30秒）以检查柚皮素是否完全溶解于溶液中。未溶解的柚皮素会在溶液中形成白色沉淀。图1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tween-80 和 DMSO 溶液
	<ol>
		<li>配制2 mg/mL的柚皮素溶液：称取6.69 mg柚皮素，加入5.0 mL离心管中。 
		&#8203;注意：为达到终浓度 2 mg/mL，所需溶液总体积为 3345 µL（计算过程：6.69 mg/3345 µL = 2 mg/mL）。</li>
		<li>快速离心（2000 × g） g 30秒）使柚皮素粉末沉降至管底。</li>
		<li>加入117.7 µL DMSO，以制备相对于总体积的3.5%（v/v）溶液（计算：117.7 µL / 3345 µL × 100% = 3.5%）。柚皮素完全溶解。图3A)</li>
		<li>向步骤 2.3.3 中制备的溶液中加入 117.7 µL Tween 80，使 Tween 80 和 DMSO 的终浓度均为 3.5%（v/v）。观察柚皮素完全溶解。图3B)</li>
		<li>将步骤 2.3.4 中制备的溶液缓慢加入含有 3109.6 µL 0.9% PS（v/v，93%）的 5.0 mL 离心管中，充分振荡，得到外观澄清的柚皮素溶液（图 3C).</li>
		<li>将2.3.5步骤中配制的溶液在室温（RT）下静置2小时。溶液仍澄清，无可见沉淀物。图3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柚皮素溶液的制备 在体 给药
	<ol>
		<li>根据步骤1.2.2，称取160 mg柚皮素（160 mg / 2 mg/mL = 80 mL）。</li>
		<li>加入2.8 mL DMSO，配制成3.5%（v/v）的溶液（计算：2.8 mL / 80 mL × 100% = 3.5%）</li>
		<li>然后，向2.4.2步骤中配制的溶液加入2.8 mL吐温80，使吐温80终浓度为3.5%（v/v），DMSO终浓度为3.5%（v/v）。</li>
		<li>将步骤2.4.3中配制的溶液分装至四个试管中，每管1.4 mL [(2.8 mL + 2.8 mL) / 4 = 1.4 mL]。</li>
		<li>将 18.6 mL 的 0.9% PS 分装至五个 15 mL 离心管中。</li>
		<li>将步骤2.4.3（储备液）和2.4.5中制备的溶液在4 °C下保存（2.8 mL + 2.8 mL + 18.6 mL × 4 = 80 mL）。</li>
		<li>取140 µL储备液（步骤2.4.3），与1860 µL 0.9%生理盐水混合，配制供一日使用的2 mL柚皮素溶液。</li>
		<li>使用 0.2 µm 滤膜过滤溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 柚皮素溶液给药
<ol>
	<li>抓取与固定
	<ol>
		<li>打开笼盖前，用70-75%酒精喷洒笼体和双手。抓住小鼠尾根部，将其提起并放置于坚固的表面上，轻轻向后固定其尾部。</li>
		<li>用左手拇指和食指捏住小鼠耳后颈部的皮肤皱褶，并将尾巴置于无名指与小指之间。保持小鼠仰卧位，后部略微抬高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射
	<ol>
		<li>抓住小鼠背部皮肤，使腹部皮肤绷紧。</li>
		<li>将针头（胰岛素注射器）以10°角刺入腹壁，进针部位选择腹部右下或左下象限，以避免损伤膀胱、肝脏或其他内脏器官。</li>
		<li>将针头沿皮下向前（头侧方向）推进3-5 mm，然后以45°角插入腹腔。</li>
		<li>当针头穿过腹壁且阻力消失后，进行回抽以确认无液体回流。随后缓慢推注药液。</li>
		<li>注射完成后，缓慢拔出针头并轻微旋转，以防止药液外漏。推荐注射体积为50-100 µL/10 g。</li>
		<li>将剩余的柚皮素（Naringenin）弃置于生物危害废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 血糖检测
注意：注射前1天以及注射后1个月和2个月检测血糖。
<ol>
	<li>在进行血糖检测前，将小鼠禁食15小时，可继续提供饮水。</li>
	<li>打开试纸瓶并标记日期。试纸开启后需在3个月内使用完毕。储存温度为2–30 °C。每次取出试纸后应立即拧紧瓶盖，防止受潮。</li>
	<li>将动物放入诱导室中。开启麻醉机，异氟烷浓度设为4%，氧气流速为4 L/min进行诱导麻醉。待动物完全麻醉后，改用鼻罩维持麻醉，异氟烷浓度调至1.5%，氧气流速为0.4 L/min。</li>
	<li>用浸有70%–75%酒精的棉球或棉签擦拭小鼠尾部。</li>
	<li>从尾部最低点开始，使用25G针头刺破侧尾静脉，轻轻挤压以挤出一滴血液。</li>
	<li>用纸巾擦去第一滴血液。</li>
	<li>再次挤出一滴血液，并将其接触血糖试纸边缘以完成采样。</li>
	<li>读取并记录血糖仪上显示的结果。</li>
	<li>为止血，用无菌纱布轻压小鼠尾部，并用75%酒精擦拭穿刺部位。</li>
	<li>如需采集更多样本，可采用类似方法沿尾部向近头端方向移动取血。</li>
</ol>
5. TRAP 染色
<ol>
	<li>载玻片制备
	<ol>
		<li>每周对小鼠进行一次空腹血糖检测。当血糖水平 ≥ 11.1 mmol/L 时（表明Ⅱ型糖尿病小鼠模型建立成功）24），使用CO₂处死小鼠2，随后进行颈椎脱位，并采集腰椎第4节th-6th （L4-L6）（禁食血糖检测期间不实施安乐死）。</li>
		<li>用4%多聚甲醛固定L4-L6样本24小时（确保多聚甲醛的体积足以完全浸没样本） &#62;组织体积20倍的水量），然后用自来水持续流动冲洗2小时。</li>
		<li>将样本浸入10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，在室温下静置脱钙2周，直至样本软化。确保脱钙液体积为组织/样本体积的20–30倍。每隔一天更换一次EDTA溶液。</li>
		<li>使用脱水机对样品进行脱水。
		<ol>
			<li>将标本放入组织处理包埋盒中，用铅笔编号。</li>
			<li>将脱水程序设置如下：75% 乙醇 2 h，85% 乙醇 1 h，95% 乙醇 1 h，95% 乙醇 2 h，无水乙醇（I）2 h，无水乙醇（II）2 h，无水乙醇（III）2 h，二甲苯（I）1 h，二甲苯（II）1 h，二甲苯（III）1 h，石蜡（I）2 h，石蜡（II）2 h，室温进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样本包埋于石蜡中。
		<ol>
			<li>将石蜡加入石蜡包埋仪的蜡盘中，加热至 60 °C。将已脱水的标本浸入其中，至少浸泡 2 h。</li>
			<li>将组织包埋盒放入包埋盒托盘中并预热。</li>
			<li>向石蜡储存器中加入石蜡，并加热至 60 °C。</li>
			<li>2小时后，将组织包埋盒和标本一同转移至工作区域。从石蜡储存器中倒入预热的石蜡至组织包埋盒中。将标本放入石蜡中，确保石蜡完全覆盖组织，然后立即把包埋盒移至冰镇平台上。</li>
			<li>使用切片机将石蜡包埋的样品切成5-6 µm的切片。在40 °C温水中展开切片，时间少于10秒。将切片转移至经APS（氨基硅烷）包被的载玻片上。室温下干燥1小时，随后将载玻片置于60 °C烘箱中过夜。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TRAP试剂的制备
	<ol>
		<li>配制基础储备孵育液：将9.2 g无水乙酸钠、11.4 g L-(+)酒石酸和2.8 mL冰醋酸溶于1000 mL蒸馏水中。调节pH至4.7–5.0，室温保存，可存放长达6个月。</li>
		<li>配制萘酚醚溶液：将0.1 g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于5 mL乙二醇单乙基醚中，4 °C保存，可使用长达5周。</li>
		<li>配制亚硝酸钠溶液：将1 g亚硝酸钠溶解于25 mL蒸馏水中。4 °C保存。</li>
		<li>配制品红染料：将1 g碱性品红加入20 mL 2N HCl（83 mL盐酸溶于417 mL水中）。使用磁力搅拌器溶解碱性品红，过滤后使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TRAP 染色
	<ol>
		<li>将50 mL碱性储存孵育液加入两个Coplin染色缸中，置于37 °C烘箱内孵育2 h。</li>
		<li>取一个考普林罐，加入0.5 mL萘酚醚溶液。</li>
		<li>将载玻片放入考普林瓶中，在 37 °C 下孵育 1 小时。 
		注意：每组至少准备三张载玻片。</li>
		<li>孵育时间结束前几分钟，加入1 mL亚硝酸钠溶液和1 mL副品红染料，轻轻混匀30秒，静置2分钟。</li>
		<li>将步骤 5.2.2 中配制的溶液加入另一只含有碱性储备液的预热 Coplin 罐中。充分混匀溶液，然后将步骤 5.3.3 中 Coplin 罐内的载玻片插入其中。</li>
		<li>室温孵育15-20分钟。</li>
		<li>在另一个 Coplin 瓶中用 200 mL PBS 冲洗切片，持续 5 分钟。</li>
		<li>在Coplin染色缸中用100%苏木精对切片进行复染，持续30秒。</li>
		<li>用85%、95%和100%酒精（各200 mL）对切片进行脱水，每步2分钟，随后用二甲苯（200 mL）处理，每次2分钟，重复3次。每一步均使用考普林瓶进行。</li>
		<li>用树脂将切片固定在盖玻片上，注意避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. ELISA
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>从鼠的股骨和胫骨上剥离软组织，用纱布清洁骨骼。</li>
		<li>将骨样品放入1 mL 微量离心管中，并将样品管储存于 -80 °C。 
		注意：样品也可储存于液氮罐中，但储存时间不得超过6个月。</li>
		<li>称取骨样品质量，按1:10的比例加入0.9% PS进行稀释。例如，将0.1 g骨样品用1 mL PS稀释。</li>
		<li>向管中加入3 mm氧化锆珠，以70 Hz频率研磨样品3次，每次30秒，中间间隔20秒。</li>
		<li>在4 °C、12,000 × g 条件下离心5分钟，收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ELISA检测试剂盒 
	注意：按照试剂盒制造商提供的检测方案进行ELISA操作。
	<ol>
		<li>向相应孔中分别加入100 µL标准品、空白对照和样品的稀释液，在37 °C孵育90分钟。</li>
		<li>倾去各孔中的液体，每孔加入100 µL生物素化检测抗体工作液，在37 °C孵育1小时。</li>
		<li>倾去溶液，每孔加入350 µL洗涤缓冲液，浸泡1分钟，重复洗涤3次。</li>
		<li>每孔加入100 µL HRP结合物工作液，在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>倾去溶液，按步骤6.2.3所述方法重复洗涤5次。</li>
		<li>每孔加入90 µL底物试剂，在37 °C避光孵育15分钟。</li>
		<li>每孔加入50 µL终止液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值。</li>
	<li>标准曲线绘制
	<ol>
		<li>以系列稀释的标准品蛋白浓度为横坐标，对应的平均吸光度值为纵坐标作图。</li>
		<li>连接各点绘制最佳拟合曲线，使用合适的计算机软件（如电子表格程序）生成标准曲线方程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将各样品的吸光度值代入标准曲线方程，计算出相应样品的浓度。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

植物化学物质溶液的制备是其应用的基础 体内在此方案中，通过使用不同溶剂（如乙醇、DMSO、Tween 80 和 0.9% PS）演示了柚皮素溶液的制备。溶液需在室温下静置数小时，以观察其是否完全溶解，并在使用前进行过滤。 体内.
溶剂的选择是本实验方案中的关键步骤。溶解化合物时有多种溶剂可供选择，其中乙醇、DMSO 和 PS 是最常用的溶剂。乙醇因其高度极性的特性，能够形成氢键，从而溶解极性和非极性物质，因此可溶解许多水不溶性化合物。此外，乙醇的浓度可能影响植物化学&#160;化合物的性质。例如，75 wt.% 的乙醇/水溶剂被认为是最适合提取多酚、获得最高产率并具有最强抗氧化性能的溶剂26。另一项研究发现，在 150 °C 条件下，乙醇浓度可降低至 32.5%，仍能使多酚提取物表现出抗氧化活性27。然而，高浓度的乙醇可能引起神经毒性和肝毒性28。在行为学评估中，常使用浓度范围为 8%–32% v/v 的...

随着越来越多的研究关注植物化学成分在药物筛选中的应用，配制植物化学成分溶液以评估其最佳效应的方法值得重视。诸多方面，如溶解方法、剂量和浓度&#160;在制备该化合物时需予以考虑1.
基于溶剂的溶解方法广泛用于有机化合物的制备1。常用的溶剂包括水、油、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醇、甲酸、吐温、甘油等2。尽管在通过灌胃给药时允许存在未溶解物质的混悬液，但静脉给药时必须确保溶质完全溶解。由于油溶液、混悬液和乳剂可能引起毛细血管栓塞，建议采用水溶液来制备化合物，尤其是在进行静脉、肌肉和腹腔注射时3。
有效剂量范围因化合物而异，甚至使用同一种化合物治疗不同疾病时其有效剂量范围也有所不同。有效剂量、安全剂量及其浓度的确定依赖于文献资料和预实验结果4。本文以柚皮素化合物的制备为例进行说明。
柚皮素（4,5,7-三羟基黄烷酮）是一种多酚类化合物，因其具有保肝5、抗糖尿病6、抗炎7和抗氧化活性8而被广泛研究用于疾病治疗。体内应用中，通常采用口服方式给予柚皮素。既往研究报道，将柚皮素溶解于0.5%-1%羧甲基纤维素、0.5%甲基纤维素、0.01% DMSO或生理盐水（PS）中，以50-100 mg/kg的剂量通过灌胃给药9,10,11,12。此外，也有研究报道将柚皮素以3%（wt/wt）的比例添加至饲料中，供动物口服摄入，剂量为3.6 g/kg/d13,14。另有研究采用乙醇（0.5% v/v）、生理盐水（PS）或DMSO溶解柚皮素，用于腹腔注射，剂量为10-50 mg/kg15,16,17,18。在一项关于颞叶癫痫的研究中，小鼠接受了悬浮于含0.25%羧甲基纤维素的生理盐水中的柚皮素注射19。尽管这些研究报道了使用不同溶剂配制柚皮素溶液的方法，但尚未详细报告溶解状态及动物反应等进一步信息。
本方案介绍了一种用于糖尿病诱导的骨质疏松症体内应用的柚皮素溶液制备方法。注射液的制备包括溶剂与化合物的准备、剂量估算、溶解过程及过滤步骤。剂量的确定基于文献研究和预实验，通过连续3天每日注射后监测小鼠反应，并根据小鼠行为调整剂量。最终选定的浓度（20 mg/kg 体重）在高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型中，每周腹腔注射5次，持续8周20,21。通过血糖检测、显微CT、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估柚皮素在糖尿病性骨质疏松中的作用。
总体观察发现，浓度范围为40–400 mg/mL的柚皮素在乙醇、DMSO或5%（乙醇或DMSO）加95% PS（v/v）中均未完全溶解。然而，柚皮素在含有3.52% DMSO、3.52% Tween 80和92.96% PS的混合溶剂中可完全溶解。该详细操作步骤将有助于研究人员制备用于注射的化合物溶液 体内 应用

<table><tbody><tr><td>1.5 mL&amp;nbsp; 微管</td><td>Corning Science (Wujiang) Co.</td><td>23218392</td><td>盛装液体</td></tr><tr><td>自动脱水机</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA ASP 300S</td><td>样本脱水</td></tr><tr><td>血糖试纸</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson (China) Medical Equipment Co.</td><td>4130392</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>MIULAB</td><td>小型离心机</td><td>离心溶液</td></tr><tr><td>脱水机</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA&amp;nbsp; ASP300S</td><td>脱水</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.</td><td>E918BA0041</td><td>共溶剂</td></tr><tr><td>ELISA 检测试剂盒</td><td>Elabscience Biotechnology Co.,Ltd</td><td>小鼠 COL1（I 型胶原）ELISA 试剂盒：E-EL-M0325c&lt;br/&gt; 小鼠 CTX I ELISA 试剂盒：E-EL-M0366c&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 小鼠 PICP ELISA 试剂盒：E-EL-M0231c&lt;br/&gt; 小鼠 PINP ELISA 试剂盒：E-EL-M0233c</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>共溶剂</td></tr><tr><td>乙二醇单乙醚</td><td>Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.</td><td>A501118-0500</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009617</td><td>脱钙</td></tr><tr><td>滤器</td><td>Merck Millpore LTD.</td><td>Millex-GP, 0.22 &amp;micro;m</td><td>过滤溶液</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>血糖仪</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson (China) Medical Equipment Co.</td><td>One Touch Ultra Vue</td><td>序列号：COJJG8GW</td></tr><tr><td>研磨仪</td><td>上海净信实验技术</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>D005</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>上海康他瑞医疗设备有限公司</td><td>0.33 mm x 13 mm, RW LB</td><td>腹腔注射</td></tr><tr><td>L-(+) 酒石酸</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>100220008</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>sz61</td><td>观察</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.</td><td>LEICA RM 2135</td><td>切片</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>杭州米优仪器有限公司</td><td>&amp;nbsp;Mini-6KC</td><td>离心</td></tr><tr><td>萘酚 AS-BI 磷酸盐</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>BCBS3419</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>柚皮素</td><td>江苏永健医药有限公司</td><td>102764</td><td>溶质</td></tr><tr><td>石蜡包埋机</td><td>Leica Microsystems (Shanghai) Co.</td><td>LEICA&amp;nbsp; EG 1150 H, LEICA&amp;nbsp; EG 1150 C</td><td>包埋&amp;nbsp;样本</td></tr><tr><td>副品红碱</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E112BA0045</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>移液器</td><td>eppendorf</td><td>2&amp;ndash;20 &amp;micro;L, 100&amp;ndash;1000 &amp;micro;L, 20&amp;ndash;200 &amp;micro;L</td><td>&amp;nbsp; 转移液体</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek Instruments USA, Inc.</td><td>BioTek CYTATION 3 成像读板仪</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>树脂</td><td>上海泱阳仪器有限公司</td><td>中性树胶</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>生理盐水（0.9 PS）</td><td>Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd</td><td>A6E1323</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>无水乙酸钠</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>Merck-1.06268.0250 | 250g</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10020018</td><td>TRAP 染色</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.</td><td>E819BA0006</td><td>乳化剂</td></tr><tr><td>氧化锆珠</td><td>上海净信实验技术</td><td>11079125z 454g</td><td>研磨</td></tr></tbody></table>

柚皮素溶液的制备用于 在体 内 应用

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

化合物（植物化学物）溶液的配制是在药物筛选等研究应用前常被忽视但至关重要的步骤。化合物的完全溶解对其安全使用和获得相对稳定的结果十分关键。本文以柚皮素溶液的配制及其在高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型中的腹腔注射为例，展示了一种标准操作流程。使用少量柚皮素（3.52–6.69 mg）测试其在乙醇、二甲基亚砜（DMSO）以及DMSO联合吐温80溶于生理盐水（PS）中的溶解情况。通过观察溶液颜色及离心（2000 × g）后是否有沉淀生成来判断化合物是否完全溶解。 g 30秒），或在室温（RT）下静置2小时。获得稳定的化合物/植物化学物质溶液后，根据实验需求确定该化合物的最终浓度/用量 体内 可先用溶剂（不含PS）配制储备液，再根据需要稀释或与PS混合。通过检测小鼠血糖水平、骨量（显微CT）及骨吸收速率（TRAP染色与ELISA），评估柚皮素的抗糖尿病性骨质疏松作用（腹腔注射剂量为20 mg/kg体重，2 mg/mL）。该技术适用于需要详细有机物/植物化学溶液配制方案的研究人员。

高脂饮食喂养并经STZ诱导的糖尿病小鼠在STZ处理后0至8周内，其体重较对照组有所下降。在第4周时，柚皮素治疗组小鼠的体重减轻程度显著低于未治疗小鼠（STZ组）。对照组和STZ组均给予相同体积的PS（表1）。糖尿病小鼠在STZ诱导后1个月内血糖水平显著升高，随后自发性下降至建模后2个月时的水平。柚皮素治疗在1个月和2个月时分别使血糖水平降低51.8%和34.8%（表2）。STZ诱导的糖尿病小鼠出现骨量减少，表现为骨体积/组织体积（BV/TV）下降30.97%和骨小梁数量（Tb.N）减少11.4%。这两个参数的变化表明，柚皮素治疗显著缓解了骨丢失（表3）。在高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病小鼠中，破骨细胞活性（以N.oc/Tb.Ar，即每单位骨小梁面积的破骨细胞数量表示）有所升高，尽管对照组与疾病模型组之间未达到统计学显著性。柚皮素治疗显著降低了破骨细胞活性，如图4和表4所示。糖尿病动物中I型胶原C端端肽（CTIX）和I型前胶原N端前肽（PINP）...

此处方案介绍了柚皮素溶液的配制方法 体内 腹腔注射。柚皮素完全溶解于二甲基亚砜、吐温80和生理盐水的混合液中。通过血糖检测、抗酒石酸酸性磷酸酶染色和酶联免疫吸附测定评估柚皮素的抗糖尿病性骨质疏松作用。

化合物（植物化学成分）溶液的配制是在药物筛选等研究应用前常被忽视但至关重要的步骤。

随着越来越多的研究关注植物化学成分在药物筛选中的应用，以制备植物化学成分溶液来评估其最佳效果，我注意到本方案具有操作简便、成本低廉的优势。该方案将有助于从事药理学药物筛选的研究人员。我们建议在初步实验中使用少量植物化学成分，以考虑消耗成本。其次，建议使用胰岛素注射器而非普通注射器。为配制浓度为 2 毫克/毫升的柚皮素乙醇溶液，称取 3.52 毫克柚皮素粉末，加入 2 毫升离心管中。短暂离心使粉末沉降至管底。随后，向管中加入 8.8 微升 100% 乙醇，以制备 0.5% 的溶液。然后向管中加入79.2 µL的100%乙醇，配制5%溶液。接着，向含有5%溶液的管中加入1.672 mL的0.9%生理盐水，即可形成乳剂。然后离心该试管以检查柚皮素是否已完全溶解于溶液中。溶液中可能出现未溶解的柚皮素白色沉淀。接下来，为制备二毫克每毫升的柚皮素DMSO溶液，称取3.95毫克柚皮素粉末，并将其加入一个二毫升的离心管中。短暂离心后，向离心管中加入 9.8 毫升 DMSO，配制 8.5% 溶液。然后向管中加入 88.2 微升 DMSO，配制 5% 溶液。接着，向溶液中加入 1.877 毫升 0.9% 生理盐水。这将形成乳状液。离心溶液以检查柚皮素是否完全溶解。溶液中可能出现含有未溶解柚皮素的白色沉淀。接下来，为了在Tween 80和DMSO中配制2毫克/毫升的柚皮素溶液，称取6.69毫克柚皮素粉末，加入一个5毫升离心管中。短暂离心，然后加入117.7微升DMSO，配制成3.5%的溶液。随后向该溶液中加入117.7微升Tween 80，使最终浓度为3.5% Tween 80和3.5% DMSO。将此溶液缓慢加入另一含有 3109.6 微升 0.9% 生理盐水的 5 毫升离心管中，充分振荡，以获得澄清的柚皮素溶液。两小时后，溶液应保持澄清，无可见沉淀物。给予柚皮素溶液时，用手指捏住一只五周龄 C57BL/6 雄性小鼠尾部根部，将其置于固体表面上，并轻柔地向后固定其尾巴。接下来，用左手拇指和食指捏住小鼠耳后颈部的皮肤皱褶，并将尾巴置于小指与无名指之间。保持小鼠仰卧姿势，使其后端略微抬高。注射柚皮素溶液时，捏住小鼠背部的皮肤，使腹部皮肤绷紧。然后以10度角将针头刺入腹部右下象限或左下象限，以避免刺中膀胱、肝脏或其他内脏器官。将针头在皮下向前（头侧方向）推进3至5毫米，随后以45度角插入腹腔。当针头穿过腹壁后，缓慢推注溶液。注射完毕后，边缓慢拔出针头边轻微旋转，以防止液体渗漏。进行血糖检测时，打开试纸盒并标记日期。用25号针头在尾静脉侧壁刺一个小孔，挤出一滴血液。用纸巾擦去第一滴血后，再挤出一滴血，并将其收集在试纸条的边缘。读取并记录血糖仪上显示的结果。与对照组小鼠相比，高脂饮食喂养并经链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠在链脲佐菌素处理后第0至第8周体重下降。在第4周时，柚皮素处理小鼠的体重减轻显著高于未处理小鼠。糖尿病小鼠在链脲佐菌素诱导后一个月内血糖水平显著升高。两个月后，血糖水平自动下降至两个月前观察到的水平。相比之下，与链脲佐菌素（STZ）组相比，柚皮素处理组在一个月时使血糖水平降低了51.8%，两个月时降低了34.8%。与对照组相比，链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠表现出骨量减少，表现为骨体积占组织体积的比率以及小梁数量的下降。与此同时，柚皮素处理显著缓解了骨量流失。糖尿病小鼠的破骨细胞活性（以每单位小梁骨面积的破骨细胞数量表示）有所升高，但对照组与疾病模型组之间未观察到统计学上的显著差异。此处展示了对照组和链脲佐菌素诱导小鼠的小梁骨及破骨细胞的TRAP染色结果。柚皮素处理显著降低了破骨细胞活性。在糖尿病动物中，I型胶原C端端肽升高了68.09%，I型前胶原N端前肽升高了204.88%，表明骨吸收速率显著增加。然而，柚皮素处理显著降低了这两项骨吸收速率指标。因此，准确移液具有挑战性。剪断吸头末端可使移液更简便且更准确。或者，可将所需体积换算为质量，后续操作更为简便。每次膀胱葡萄糖实验前，所有动物的禁食时间在整个实验过程中必须保持一致。

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医学

柚皮素溶液的制备

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)2 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物...

使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基

关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

采用氧化铜纳米颗粒（CuO-NPs）处理生产性渗滤液（PBW），并在培养的人源细胞中评估其细胞毒性。本实验方案的目的是将天然环境样品整合到细胞培养体系中，以评估经CuO-NP处理后毒性变化情况。...

氧化铜纳米颗粒去除铀中痕量元素 原位 回收渗出液及其对细胞活力的影响

本手稿介绍了利用新型基因编码的一氧化氮（NO•）探针（geNOps）结合荧光显微镜实时监测单细胞内NO•动态变化的实验方案。通过将geNOps与化学钙离子（Ca2+）传感器结合，实现了对单个内皮细胞水平上由Ca2+触发的NO•生成过程的可视化观测。...

应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

在此，我们介绍二仙汤（EXD）的制备方法，包括四个步骤——浸泡、煎煮、过滤和浓缩，并演示将含有制备好的EXD的血清给予大鼠的操作。这些方法适用于 体内 和 体外...

中药制备：二仙汤及含二仙汤血清的制备 在体 内 和 体外 实验

本文介绍了一种用于合成与表征具有活性氧（ROS）清除功能的氧化铈纳米颗粒（nanoceria）的实验方案。 体内，通过共聚焦显微镜对植物组织中的纳米氧化铈进行成像，以及 体内...

植物活性氧的催化清除 体内 通过阴离子型氧化铈纳米颗粒

本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。...

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

本方案详细描述了使用近红外二区光学成像设备对小鼠进行实时近红外二区荧光成像的操作过程。...

一种用于血管与肿瘤成像的高亮度近红外二区荧光探针

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。...

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。...

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

学习制备柚皮素溶液用于药理学药物筛选研究，采用DMSO、Tween 80和生理盐水混合溶解法。该方法操作简便、成本低廉，适用于评估抗糖尿病和骨质疏松效应的体内实验研究。

柚皮素溶液的制备用于在体内应用

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柚皮素溶液的制备用于 在体 内 应用

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