从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子_F420 用于分析聚谷氨酸尾部长度

针对纯培养物和环境样品中_F420 尾长的液相色谱分离和分析，优化了从纯培养物中提取辅因子_F420 的方法。

辅因子F420在许多原核生物的一级和二级代谢中起着重要作用。在环境样品中测量这种分子可以更深入地了解其患病率和功能。该技术能够分析难处理样品材料（如污泥和土壤）中的辅因子。

因此，材料的裂解和分析前的预纯是中心步骤。该协议包括样品制备过程中的不同步骤。在开始样品处理之前，必须很好地计划和准备这些步骤。

例如，新鲜缓冲液的制备很重要。要开始样品裂解，将五克样品放入50毫升锥形管中。然后向样品中加入5毫升2X裂解缓冲液，并用蒸馏水将体积调至10毫升，达到每毫升0.5克的最终浓度。

涡旋稀释的样品20秒，然后在121摄氏度下高压灭菌30分钟。对于干燥的样品，如森林土壤，在高压灭菌后用蒸馏水将最终体积提高到20毫升，并再次涡旋稀释的样品20秒，如图所示。样品冷却后，将样品裂解物以11， 000×g离心五分钟，并收集上清液。

准备一个装满100毫克弱阴离子混合模式聚合物吸附剂的5毫升固相萃取或SPE色谱柱，用三毫升甲醇调节阴离子交换器。然后，用三毫升蒸馏水平衡阴离子交换器。将离心裂解液中多达9毫升的上清液加载到SPE柱上。

用5毫升25毫摩尔乙酸氨和5毫升甲醇依次洗涤色谱柱中的杂质。洗涤后，用一毫升洗脱缓冲液洗脱辅因子F420。将烘箱预设为40摄氏度，并将荧光检测器设置为420纳米消光波长和470纳米发射波长。

接下来，使用孔径为0.22微米的PTFE过滤器将SPE中洗脱的样品过滤到HPLC小瓶中。将50微升过滤样品注入HPLC系统，并使用手稿中描述的流动相组合通过梯度模式分离辅因子F420。分析辅因子F420的组成和浓度。

通过显微镜验证了产甲烷菌纯培养物的生长。在相差显微镜中，可见产甲烷菌的聚集物，当辅因子F420被紫外光激发时，它们会发出蓝色光。分析不同体积嗜热膜炎培养物SPE后回收辅因子F420的峰面积。

高压灭菌分解策略实现了最高的峰面积，使用压力-温度处理得出了最大的提取效率。对环境样品中尾长分布的分析揭示了环境样品中辅因子F420总浓度和F420尾长分布的差异。应用此过程时，请注意完全收集洗脱缓冲液的总体积或记录确切的流经体积。

该技术为在土壤和污泥等更复杂的样品中探索辅因子F420铺平了道路，并能够更深入地了解该分子的生态影响。