Name: 从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子F420 用于分析聚谷氨酸尾部长度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 学习从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子F420的方法，通过液相色谱分析聚谷氨酸尾部长度。该技术优化了样品裂解和预纯化步骤，为研究原核生物代谢提供了可靠的实验方案。

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我们衷心感谢 Colin Jackson 教授在纯化辅因子 F420 方面提供的支持。本研究得到了蒂罗尔科学基金（TWF）和因斯布鲁克大学（Publikationsfonds）的资助。我们非常感谢 GPS、HK、SB、GG 和 HB 提供的支持。

注意：辅因子 F420 的提取与分析包括三个步骤：样品裂解、通过固相萃取（SPE）对辅因子进行预纯化，以及通过荧光检测的离子配对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）检测辅因子。在开始之前，请按照表1中的说明准备材料和试剂。
1. 样品裂解
<ol>
	<li>将最多 5 g 样品加入适当的管中（例如 50 mL 锥形管）。</li>
	<li>向样品中加入 5 mL 裂解缓冲液（2× 储存液，表 1）。</li>
	<li>用蒸馏水定容至终体积 10 mL，使终浓度达到 0.5 g·mL-1。</li>
	<li>将稀释后的样品涡旋振荡 20 秒。</li>
	<li>在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。</li>
	<li>对于森林土壤等干燥样品，高压灭菌后用蒸馏水定容至终体积 20 mL，并涡旋振荡稀释后的样品。 
	&#8203;注意：高压灭菌过程中温度升高可能导致管子破裂。</li>
</ol>
2. 通过固相萃取（SPE）对辅因子 F420 进行预纯化
注意：固相萃取（SPE）的所有步骤均在室温下进行
<ol>
	<li>将样品冷却至室温。</li>
	<li>将灭菌后的样品在11,000 x g条件下离心5分钟 g.</li>
	<li>准备填充有100 mg弱阴离子混合模式聚合物吸附剂的5 mL固相萃取柱。</li>
	<li>用3 mL甲醇（平衡溶液）平衡阴离子交换剂 表1).</li>
	<li>用 3 mL 蒸馏水（平衡溶液）平衡阴离子交换剂， 表1).</li>
	<li>将离心后裂解液的上清液最多9.0 mL上样至固相萃取柱（SPE柱）。</li>
	<li>用 5 mL 25 mM 醋酸铵（SPE 洗涤液 1）洗去杂质， 表1).</li>
	<li>洗去&#160;用5 mL甲醇（SPE洗涤液2）洗去杂质， 表1).</li>
	<li>洗脱辅因子 F420 在1.0 mL洗脱缓冲液中（表1). 
	注意：请现配洗脱缓冲液。由于施加的真空及洗脱缓冲液较高的蒸气压，不同样品间的洗脱体积可能存在差异。为确保所有样品最终体积一致，建议在洗脱前后称量收集管重量，计算实际洗脱体积，并通过添加洗脱缓冲液补足体积差异。</li>
</ol>
3. 辅因子 F420 的检测
<ol>
	<li>将烘箱温度设置为 40 °C，荧光检测器设置为激发波长 420 nm、发射波长 470 nm。使用流动相 A 和 B（表 1）以梯度模式实现分离：0–3 分钟：26% B；3–24 分钟：26%–50% B；24–25 分钟：50% B；25–27 分钟：50%–26% B；27–35 分钟：26% B，流速为 0.75 mL·min-1。 
	注意：在进样前，需用至少 3 倍柱体积的 74% 流动相 A 和 26% 流动相 B（表 1）冲洗色谱柱，以确保色谱柱条件充分平衡。
	<ol>
		<li>使用孔径为 0.22 µm 的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜将固相萃取（SPE）洗脱液过滤至高效液相色谱（HPLC）小瓶中。 
		注意：推荐使用孔径为 0.22 µm 的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜。</li>
		<li>将 50 µL 洗脱样品注入高效液相色谱（HPLC）系统，用于分析辅因子 F420 的组成和浓度。 
		注意：由于本实验方案未使用定量标准品，样品及变体需通过峰面积进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
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<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
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<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
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<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对于产甲烷纯培养物中辅因子 F420 的评估，可通过显微观察来可视化相关微生物的生长与活性（荧光显微镜）（图1）。对于来自自然环境的样品，由于其他荧光微生物、有机和无机颗粒的干扰，使用显微镜检测或定量 F420 的应用受到限制。在此情况下，提取 F420 并随后采用高效液相色谱法（HPLC）进行荧光分析（如先前所述5），不仅可提供辅因子 F420 的总浓度信息，还可获得其多谷氨酸侧链长度的分布情况。
对于辅因子 F420 的提取，压力-温度处理被证明具有很高的效率（图2），且与先前的研究结果一致5,27,33。通过该方法并结...

F420 是一种广泛存在但常被忽视的辅因子，在生物体的初级和次级代谢过程中作为必需的双电子氢化物载体发挥作用 古菌 和 细菌1,2. F420 是一种5-脱氮黄素，结构上与黄素类似，其化学和生物学性质更接近于NAD+ 或 NADP+由于异咯嗪环5号位的氮被碳取代，它成为一种强还原剂，因此表现出-340 mV的低标准氧化还原电位1,3. F420 包含一个5-脱氮黄素环和一个2-磷酸-L-乳酸连接基团（F420-0)。可在该分子上连接一个含有 n+1 个谷氨酸单体的寡聚谷氨酸链（F420-n+14.
长期以来，辅因子 F420 仅被认为存在于古菌（Archaea）和放线菌（Actinobacteria）中。这一观点现已基本被推翻。近期研究表明，F420 广泛分布于多种栖息环境（如土壤、湖泊和人类肠道）中的变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）以及可能的厚壁菌门（Firmicutes）等需氧和厌氧生物中1,5。2019年，Braga 等人6发现，变形菌Paraburkholderia rhizoxinica 能够产生一种独特的 F420 衍生物，其侧链为3-磷酸甘油酸而非2-磷酸乳酸，这种衍生物可能在多种生境中广泛存在。在古菌（Archaea）域内，F420 已在多个进化分支中被发现，包括产甲烷菌7、甲烷氧化菌8,9 和硫酸盐还原菌10，并推测其也可在奇古菌门（Thaumarchaeota）中合成11。&#160;F420 最为人熟知的是作为氢营养型和甲基营养型产甲烷过程中必需的氧化还原辅酶。其还原形式（F420H2）可作为电子供体，用于还原亚甲基四氢甲烷蝶呤（methylene-H4MPT，Mer）和亚甲基-H4MPT12,13。此外，F420H2 还可在含有细胞色素的产甲烷菌中作为非依赖氢气的电子传递链中的电子载体12,14。同时，F420 的氧化形式在420 nm激发光下会发出特征性的蓝绿色荧光，便于在显微镜下检测产甲烷菌（图1）。由于其具有较低的氧化还原电位，F420 能够实现以下功能：（i）介导多种原本难以还原或有毒的有机化合物的外源性还原；（ii）在链霉菌属（Actinobacteria 门）中参与四环素和林可酰胺类抗生素或植物毒素的合成；（iii）在分枝杆菌（Actinobacteria 门）中增强对氧化应激、亚硝化应激或其他不利条件的耐受性1,5,15,16,17,18,19,20,21,22。因此，依赖 F420 的氧化还原酶在工业、制药领域以及污染环境的生物修复中具有广阔的应用前景1,23。尽管已有上述新发现，F420 辅因子在放线菌（Actinobacteria）或其他细菌门类中的确切功能仍知之甚少。
F420 的生物合成至少存在三条途径2,6,24。最初，该合成途径分为5-脱氮黄素的生物合成和2-磷酸乳酸代谢两个分支。F420 分子的活性部分由FO合成酶催化合成，其底物为酪氨酸和5-氨基-6-核糖基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮，产物为处于黄素单核苷酸水平的发色团FO。在目前公认的乳酸代谢分支中，L-乳酸由L-乳酸激酶（CofB）催化磷酸化生成2-磷酸-L-乳酸；随后，2-磷酸-L-乳酸在2-磷酸-L-乳酸鸟苷酰转移酶（CofC）的作用下发生鸟苷酰化，生成L-乳酰-2-二磷酸-5'-鸟苷。下一步，2-磷酸-L-乳酸转移酶（CofD）将L-乳酰-2-二磷酸-5'-鸟苷与FO连接，形成F420-02。最后，F420-0:ɣ-谷氨酰配体酶（CofE）将谷氨酸单体连接到F420-0上，生成最终的辅因子6，其连接的谷氨酸数量可变23,25。不同生物体中所连接的谷氨酸残基数表现出不同的模式，产甲烷菌中的谷氨酸链较短，而分枝杆菌中的链较长2,25,26。通常，产甲烷菌的侧链长度为2至3个谷氨酸残基，在乙酸裂解型产甲烷菌Methanosarcina sp.中最多可达5个；而Mycobacterium sp.中的侧链长度则为5至7个谷氨酸残基2,25,26,27。然而，最近的研究表明，长链F420与F420依赖性氧化还原酶的结合亲和力高于短链F420；此外，结合后的长链F420可提高酶对底物的亲和力，但会降低其催化转换速率23。
辅因子 F420 的检测通常基于其荧光特性。因此，常采用反相（RP）-HPLC27,28 分离其寡谷氨酸衍生物。最近，Ney 等人成功地使用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，针对带负电荷的谷氨酸侧链，有效增强了在 RP-HLPC 上的分离效果5。本文介绍了一种不仅适用于纯培养物，也适用于多种环境样品（如土壤和消化池污泥）中辅因子 F420 的样品制备、后续裂解、提取、纯化、分离及定量方法。

<table><tbody><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备梯度模块、柱温箱和荧光检测器的生物相容性高效液相色谱系统</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>高效液相色谱系统</td></tr><tr><td>可离心50 mL &amp;ldquo;Falcon&amp;rdquo; 管（11,000 rcf）的离心机及转子，以及相应的离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱柱：Gemini NX C18，5 &amp;mu;m，150 × 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>高效液相色谱柱</td></tr><tr><td>用于高效液相色谱分析前去除颗粒物的聚四氟乙烯滤膜（孔径0.22 &amp;micro;m）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>固相萃取用填料：Strata-X-AW 33 &amp;mu;m，弱阴离子混合模式聚合物吸附剂</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>弱阴离子混合模式聚合物吸附剂</td></tr><tr><td>用于固相萃取的真空 manifold 装置及相应的收集管</td><td></td><td></td><td>固相萃取设备</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子 f420 以分析多谷氨酸尾链长度

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

辅因子 F420 作为氢负离子载体，在多种细菌和古菌类群的初级与次级代谢中发挥核心作用。该辅因子最著名的功能是在产甲烷过程中促进热力学上难以进行的反应。由于不同生物体中其多谷氨酸侧链的长度存在差异，因此对侧链长度的分析可能成为区分和表征不同类群及代谢途径的有力工具。本文所述方案描述了辅因子 F420 的提取及其检测方法的优化，该方法采用固相萃取联合高效液相色谱分析，无需依赖培养或分子生物学手段。该方法已应用于获取土壤、厌氧污泥及纯培养物中微生物群落辅因子 F420 表达的额外信息，并通过加标实验进行了验证。研究成功获得了在可控的产甲烷纯培养物以及厌氧消化污泥和土壤等环境样品中，氢营养型和乙酸裂解型产甲烷菌不同的 F420 侧链长度分布图谱。

Methanosarcina thermophila 和 Methanoculleus thermophilus 均为嗜热产甲烷古菌（Archaea），其纯培养物在适宜培养基中按先前所述方法进行培养29,30。Methanosarcina thermophila 以甲醇作为能源物质，而 Methanoculleus thermophilus 则在 H2/CO2 气氛下生长。通过显微镜观察检测其生长情况，并通过气相色谱法测定甲烷（CH4）含量以评估其活性，方法如前所述31。纯培养物用于按照本方案提取辅因子 F420。此外，还于2020年秋季采集了多种环境样品，包括中温型沼气反应器污泥样品（奥地利采尔尔市污水处理厂；有关污泥参数的详细信息请参见文献32）、...

针对从纯培养物中提取辅因子 F420 的方法进行了优化，用于在纯培养和环境样品中对 F420 尾链长度进行液相色谱分离与分析。

从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子 F420 以分析多谷氨酸尾链长度

辅因子 F420 在多种细菌和古菌类群的初级与次级代谢中作为氢负离子载体发挥核心作用。该辅因子是……

辅因子F420在许多原核生物的初级和次级代谢中起着重要作用。在环境样品中检测该分子有助于更深入地理解其分布和功能。该技术能够对污泥和土壤等复杂样品材料中的辅因子进行分析。因此，材料的裂解及分析前的预纯化是关键步骤。该方案包含样品制备过程中的多个步骤，这些步骤必须在开始样品处理之前进行周密的规划和充分的准备。例如，新鲜缓冲液的配制非常重要。开始样品裂解时，将五克样品放入一个50毫升的锥形管中。然后向样品中加入5毫升2倍浓度的裂解缓冲液，并加入蒸馏水至总体积为10毫升，使最终浓度达到每毫升0.5克。将稀释后的样品涡旋振荡20秒，随后在121摄氏度下高压灭菌30分钟。对于森林土壤等干燥样品，高压灭菌后用蒸馏水定容至20毫升，并如示范所示再次将稀释样品涡旋振荡20秒。待样品冷却后，在11,000 × g条件下离心裂解液5分钟，并收集上清液。准备一个5毫升固相萃取（SPE）柱，内含100毫克弱阴离子混合模式聚合物吸附剂，先用3毫升甲醇对阴离子交换剂进行活化。然后用3毫升蒸馏水平衡阴离子交换剂。将离心后裂解液的上清液最多9毫升上样至SPE柱中。依次用 5 毫升 25 毫摩尔的醋酸铵和 5 毫升甲醇洗涤柱中的杂质。洗涤后，用 1 毫升洗脱缓冲液洗脱辅因子 F420。将烘箱预设为 40 摄氏度，并将荧光检测器设置为激发波长 420 纳米、发射波长 470 纳米。接下来，使用孔径为0.22微米的PTFE滤膜将固相萃取（SPE）洗脱的样品过滤至高效液相色谱（HPLC）小瓶中。取50微升过滤后的样品注入HPLC系统，按照文中所述的流动相组合，采用梯度洗脱模式分离辅因子F420。分析辅因子F420的组成及浓度。通过显微镜检查验证了产甲烷菌纯培养物的生长情况。在相差显微镜下可见产甲烷菌的聚集体，当辅因子F420被紫外光激发时会发出蓝光。分析了不同体积的热嗜甲烷鬃毛菌（Methanoculleus thermophilus）培养物经固相萃取（SPE）后回收的辅因子F420的峰面积。高压灭菌裂解法获得了最高的峰面积，表明在压力-温度处理条件下提取效率达到最大。对辅因子F420尾链长度分布的分析揭示了环境样品中纯甲烷菌培养物中辅因子F420的总浓度以及F420尾链长度分布的差异。应用该方法时，应注意完全收集洗脱缓冲液的总体积，或准确记录穿流液的体积。该技术为在土壤和污泥等更复杂样品中探索辅因子 F420 铺平了道路，并有助于深入理解该分子的生态影响。

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环境

从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子F420 用于分析聚谷氨酸尾部长度

我们描述了一种简单的方案，用于鉴定与ATP门控P2X2受体全长C末端结合的脑蛋白。将该方法拓展并系统地应用于所有P2X受体，有望加深对P2X受体信号转导机制的理解。...

蛋白质组学鉴定与P2X2配体门控阳离子通道相互作用的蛋白质

为了符合蛋白质组学实验最低信息标准（MIAPE）指南，对真菌物种进行蛋白质组学分析所需的蛋白质提取必须实现高度标准化。我们提供了一个视频方案，其中包含在毒素诱导及从Fusarium...

用于蛋白质组学研究的Fusarium spp.培养物毒素诱导与蛋白质提取

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

磷脂脂肪酸可提供有关土壤微生物群落结构的信息。本文介绍了从土壤样品中提取磷脂的单相氯仿混合物提取方法、利用固相萃取柱对提取的脂质进行分离纯化的方法，以及通过甲醇解反应生成脂肪酸甲酯，随后采用毛细管气相色谱法对脂肪酸甲酯进行分析。...

土壤中微生物磷脂脂肪酸的提取与分析

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。...

一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

本文介绍了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的实验方案，可缩短样品前处理时间，并实现对样品量有限的样本进行多组学质谱分析。...

用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文描述了含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达与纯化方法，并以实例进行了说明（包括在E.

富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达、纯化、结晶及酶活性检测

本方案描述了从生物基质中提取非蛋白质氨基酸的方法 通过 三氯乙酸（TCA）蛋白沉淀及酸水解后，采用液相色谱-串联质谱法进行分析。...

从蓝细菌中提取非蛋白氨基酸用于液相色谱-串联质谱分析

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使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

本方案描述了一种两相酸-溶剂萃取法，用于从少量小鼠粪便样本中分离短链脂肪酸，且无需进行衍生化处理。...

采用双相酸-溶剂法从小鼠粪便中提取短链脂肪酸

学习从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子F420的方法，通过液相色谱分析聚谷氨酸尾部长度。该技术优化了样品裂解和预纯化步骤，为研究原核生物代谢提供了可靠的实验方案。

从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子 F₄₂₀ 以分析多谷氨酸尾链长度

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