Name: 在体内卡诺哈布德炎电子神经元微管动力学和方向评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解利用荧光标记EBP蛋白在秀丽隐杆线虫PLM神经元中进行活体微管成像的技术。该方法可实时观察微管动态变化，评估其方向性与生长行为，为神经发育和再生研究提供重要工具。

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我们感谢 Yishi Jin 和 Andrew Chisholm 对本研究的初始支持以及所提供的菌株。实验所用大肠杆菌菌株 OP50 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）商业购得。我们还感谢 Dharmendra Puri 在实验流程标准化方面所做的工作。本研究得到了印度生物技术部资助的国家脑研究中心核心经费、DBT/惠康信托印度联盟早期职业资助（项目编号：IA/E/18/1/504331，授予 S.D.）、惠康信托-DBT 印度联盟中期资助（项目编号：IA/I/13/1/500874，授予 A.G.-R）以及印度科学与工程研究委员会（SERB：CRG/2019/002194，授予 A.G.-R）资助项目的资助。

1. 报告基因菌株：培养与保藏
注意：为了测量 PLM 神经元中微管的动力学和取向，我们使用了在触觉神经元特异性启动子 mec-4（juIs338 等位基因）驱动下表达 EBP-2::GFP 的线虫品系18,25,26。该品系采用标准的线虫培养与维持方法27。
<ol>
	<li>制备线虫生长培养基（3.0 g/L 氯化钠、2.5 g/L 蛋白胨、20.0 g/L 琼脂、10 mg/L 胆固醇（由10 mg/mL 储备液稀释）），加水溶解后高压灭菌。</li>
	<li>将培养基混合物短暂冷却10–15分钟，然后加入1 mM 氯化钙、1 mM 硫酸镁和25.0 mM 磷酸二氢钾（pH 6.0）。</li>
	<li>使用无菌分液器将约9 mL培养基倒入60 mm培养皿中，室温下无菌环境中静置一天，随后于4 °C保存。</li>
	<li>制备50 mL LB液体培养基（5.0 g/L 氯化钠、10.0 g/L Bacto-Tryptone），高压灭菌并冷却后，接种单个大肠杆菌（Escherichia coli OP50菌株）菌落。</li>
	<li>在37 °C下培养细菌12小时。将冷藏的NGM平板恢复至室温用于接种，使用无菌玻璃涂布棒将OP50菌液均匀涂布于NGM平板表面。</li>
	<li>将接种后的NGM平板置于37 °C培养12小时，以形成用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养的细菌菌苔。这些平板可存放于20 °C培养箱中，待后续使用。</li>
	<li>在已接种细菌的NGM平板上培养转基因品系。</li>
	<li>将铂金丝接种环在火焰上灭菌，挑取20–25只产卵期成年雌雄同体个体，转移至新接种的培养皿中。</li>
	<li>转移后，将培养皿置于20 °C培养箱中1小时，随后移除成虫。此时培养皿中将含有发育同步的卵。</li>
	<li>将含有卵的培养皿继续置于20 °C培养箱中培养，直至线虫发育至目标阶段，本实验中为产卵后43.5小时的L4幼虫阶段。如需更多个体，可同时培养多块平板以避免过度拥挤。</li>
	<li>在目标发育阶段，可将线虫置于载玻片上进行EBP-2::GFP彗星结构的显微成像。</li>
</ol>
2. 样品制备：用于成像EBP-2彗星的线虫固定
注意：为了实现对 PLM 神经元中 EBP 斑点的活体观察，我们将线虫置于琼脂糖垫上，以最大限度减少其活动性，同时不损害神经元的生理状态。在多种固定方法中，我们选择了 commercially readily available 的 0.1 µm 聚苯乙烯微球溶液。我们详细说明了专门用于 EBP-2::GFP 观察的制片步骤。
<ol>
	<li>在5 mL玻璃试管中，将0.2 g琼脂糖溶于2 mL 1× M9缓冲液（0.02 M KH2PO4、0.02 M Na2HPO4、0.008 M NaCl、0.02 M NH4Cl）中，用火焰加热制备10%琼脂糖溶液。该试管可轻松放入加热块中，使琼脂糖保持熔融状态直至使用。</li>
	<li>使用宽口滴管，将约100 µL熔融琼脂糖滴加至一块尺寸为35 mm × 25 mm的洁净载玻片上。</li>
	<li>在琼脂糖仍处于熔融状态时，用另一块载玻片压住液滴，使琼脂糖在两块载玻片之间形成一层薄膜。琼脂糖约在30秒内凝固，形成厚度约为0.5–1.0 mm的凝胶膜。</li>
	<li>琼脂糖凝固后，用非惯用手握住底部载玻片，惯用手握住顶部载玻片。固定底部载玻片，翻转顶部载玻片，使琼脂糖垫粘附于其中一块载玻片上。</li>
	<li>若形成的琼脂糖垫大于盖玻片尺寸（18 mm × 18 mm），则修剪其边缘至所需尺寸，以确保盖玻片能正确放置。这些琼脂糖垫仅供立即使用，不应储存。</li>
	<li>目视检查琼脂糖垫表面是否光滑、湿润且适合封片。若琼脂糖垫暴露于空气中而变干，其表面会出现皱褶。在此情况下，应按照本节步骤2–6重新制备新鲜琼脂糖垫。</li>
	<li>在琼脂糖垫上加入2 µL浓度为0.1 µm的聚苯乙烯微球溶液，作为封片介质。</li>
	<li>使用铂金丝挑取3–4条线虫，转移至未接种细菌的NGM平板上。此步骤可去除附着于线虫表面的细菌，避免其在封片过程中干扰固定效果。</li>
	<li>待线虫爬离表面细菌后，用铂金丝重新挑取并将其悬浮于琼脂糖垫上的聚苯乙烯微球液滴中。</li>
	<li>小心地将一块18 mm × 18 mm的盖玻片覆盖在线虫上。为防止封片后线虫内脏外溢，盖玻片放置后不得移动。</li>
	<li>将制备好的玻片安装至显微镜上进行成像。</li>
</ol>
3. 成像设置与采集
注意：据观察，EBP 彗星在哺乳动物以及 C. elegans 的 PLM 神经元中的移动速度约为 0.22 µm/s16,18。为了根据奈奎斯特准则28对时间序列成像中的事件进行最佳采样，所需的空间和时间尺度分别为 0.09 µm 和 0.43 s。为防止光毒性或光漂白，我们采用了转盘式显微成像（Spinning Disk）采集方式。我们将在下方描述成像装置及采集参数设置。
<ol>
	<li>使用配备转盘单元和相机的倒置显微镜拍摄图像。按照制造商的说明开启设备。</li>
	<li>启动控制该设备的软件。</li>
	<li>由于使用的是倒置显微镜，将载有样本的载玻片放置在载物台上，选用低倍物镜（5x 或 10x），并使盖玻片朝下。</li>
	<li>将光路设置为目视或可见光模式，透射光使用卤素灯照明，反射光使用汞弧灯照明。</li>
	<li>在明场模式下对焦并使目标线虫位于视野中央。</li>
	<li>滴加浸油，将放大倍数切换至 63x（1.4NA/油），并在明场下重新对焦线虫尾部以观察 PLM 神经元。</li>
	<li>短暂开启汞弧灯的荧光照明以重新对焦 PLM 神经元。在光路中插入正确的反射镜组（AF488），用于 GFP 的观察。</li>
	<li>通过将光路导向相机，将显微镜设置为相机采集模式。 
	注意：通过显微镜的薄膜晶体管（TFT）屏幕控制上述步骤 4–7 可加快操作速度，并避免样本不必要的光照暴露。也可通过软件控制照明和反射镜组。</li>
	<li>在软件界面中，当 PLM 神经元已在视野中对焦后，选择 488 nm 激光，激光功率设为 30%，相机曝光时间为 300 ms，电子倍增（EM）增益值设为 70。根据报告基因的表达情况，可适当调整这些参数。将这些设置保存为配置文件，以便后续成像实验使用。</li>
	<li>通道 选项卡用于存储各个具有特定照明和相机设置的通道轨道。高亮显示的轨道可用于实时预览；若要采集图像，则需勾选相应轨道。为在工作区中实时观察线虫尾部，应高亮显示明场（DIC）通道。样本应在工作区的实时成像窗口中完成对焦和居中。</li>
	<li>高亮显示 488 nm 激光激发通道，以便在实时成像窗口中快速对焦 PLM 神经元。对焦完成后，按照下一步所述设置时间序列参数，开始时间序列采集。</li>
	<li>使用 488 nm 激光照明，设置一个持续 2 分钟的时间序列实验，帧间无时间间隔。为保持图像采集的时间尺度一致性，仅采集 GFP 荧光信号。</li>
	<li>点击开始实验 选项卡启动采集。使用 63x 物镜时，空间分辨率为 0.21 µm，相机以 0.09 µm 的像素尺寸进行采样。以 3.3 帧/秒的速度采集延时图像，以充分采样目标事件。该延时图像共包含在 2 分钟内采集的 396 个时间帧。采集完成后，将图像保存为默认&#160;格式，后续可通过默认软件&#160;或 ImageJ 进行访问。</li>
</ol>
4. 观察与分析
<ol>
	<li>在默认软件中预览延时成像采集结果，或通过 Image J 的 Bioformats 插件打开图像。 
	注意：我们已在 Image J 中描述了图像分析的过程。</li>
	<li>在 ImageJ 中安装 Bioformats 插件。
	<ol>
		<li>或者，将默认&#160;格式文件导出为 .tif 格式，以确保与 ImageJ 的兼容性。ZEN2 中的导出功能会将图像的每一帧保存为独立的 .tif 文件。我们避免使用此方法，以防止生成大量文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 ImageJ 的“Bioformats”插件直接以 '.czi' 格式打开图像。图像将以多图像堆栈形式打开。如果使用默认软件的&#34;导出”功能，则需在 ImageJ 中使用以下工作流程将图像重新构建成多图像堆栈：ImageJ 程序 &#62; 图像菜单 &#62; 堆栈子菜单 &#62; 图像合成为堆栈。</li>
	<li>使用图像窗口左下角的播放 图标将图像以视频形式预览。在 PLM 神经元的胞体及突起中，可观察到明亮且可移动的点状结构即为彗星状信号。若彗星状信号清晰可见，则继续执行步骤 8；否则，请执行本节中的步骤 5–7。</li>
	<li>使用查找表（LUT）将图像的颜色配置转换为灰度图像：ImageJ 程序 &#62; 图像菜单 &#62; 查找表子菜单 &#62; 选择灰度。</li>
	<li>反转图像的 LUT 配置以方便观察：ImageJ 程序 &#62; 图像菜单 &#62; 查找表子菜单 &#62; 反转 LUT。</li>
	<li>调整图像的亮度和对比度以清晰观察彗星状信号：ImageJ 程序 &#62; 图像菜单 &#62; 调整子菜单 &#62; 亮度/对比度。
	<ol>
		<li>移动最小值、最大值、亮度和对比度滑块，以实现图像中强度的合适缩放。我们对彗星状信号清晰可辨的图像进行了量化分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ImageJ 的基础版本在启动时会显示一系列工具图标。找到并右键单击带有线条图标的工具以打开下拉菜单，选择分段线。在感兴趣区域（ROI）上绘制分段线，其起点应位于神经元胞体上或附近。
	<ol>
		<li>为便于后续分析，通过 ROI 管理器保存已绘制的分段线 ROI，操作流程如下：ImageJ &#62; 分析 &#62; 工具 &#62; ROI 管理器 &#62; 在图像中选择已绘制的轨迹，点击 ROI 管理器窗口中的添加 &#62; 点击 ROI 管理器窗口中的更多 &#62; 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生成明场图（kymograph）之前，由于空间和时间尺度不同，需移除标尺以获得以像素为单位的测量值，操作如下： 
	ImageJ &#62; 分析 &#62; 设置标尺 &#62; 点击清除标尺 &#62; 确定。</li>
	<li>使用图像 &#62; 堆栈下拉菜单中的重新切片 功能生成明场图。明场图是将分段 ROI 随时间变化的可视化表示，其中横轴代表距离，纵轴代表时间。对角线轨迹代表移动的彗星状信号。通常，明场图会继承原图像的颜色配置；否则，可按照前述步骤 5–6 所述方法指定颜色配置，以便于观察对角线轨迹。</li>
	<li>使用直线工具的下拉菜单中的直线功能（参见本节步骤 9），在每条对角线轨迹上绘制直线，并将其添加至 ROI 管理器中。</li>
	<li>在分析 选项卡下，进入设置测量值 ，选择平均强度和边界矩形参数以用于测量轨迹。</li>
	<li>在 ROI 管理器窗口中，点击测量，将弹出结果窗口，显示 ROI 的平均强度、线迹的 X 和 Y 坐标、宽度、高度、角度和长度。该窗口可保存为 .csv 格式，随后导入数据分析程序中进行处理。</li>
	<li>在电子表格程序中，结果窗口将以行列分布的形式打开。相关数值包括轨迹的宽度、高度和角度。宽度表示轨迹的位移，高度表示持续时间，角度表示运动方向向量。由于宽度和高度值以像素为单位，需分别乘以空间和时间标尺，以获得标准可测参数。</li>
	<li>由于明场图左侧靠近细胞体，可根据角度将彗星状信号分类为正端向外或负端向外（即分别远离或朝向细胞体）。将角度在 1° 至 -89° 范围内的归类为正端向外，-91° 至 -179° 范围内的归类为负端向外。将多个明场图的数据汇总至电子表格中进行研究，并进行统计学表示。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

多年来，微管动力学一直是细胞骨架研究领域的关键关注点。微管经历成核和灾变，并伴随着持续的动态不稳定性过程44,45,46,47。这些信息大部分是通过体外实验获得的，例如通过光散射检测游离与聚合微管蛋白，以及利用荧光标记微管蛋白进行微管生长实验等48。尽管在较薄的细胞中可以实现对荧光和非荧光微管的活体观察，但在体内测量微管动力学仍具有挑战性。
利用这种转基因品系，也可对其他触觉神经元（如PVM、ALM和AVM）的微管取向进行评估。此处描述的成像和分析方法可适用于具有适当报告基因转基因的其他C. elegans神经元类型，但不同神经元之间彗星状信号动态的变异性是预期存在的49...

神经元具有复杂的结构，包含树突、胞体、轴突和突触等特化区室。神经元细胞骨架由微管、微丝和神经丝构成，其独特的组织形式在结构和功能上支持着神经元的不同区室1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。多年来，微管的组织方式被确认为决定神经元极性和功能的关键因素。在神经元发育或再生过程中发生结构重塑时，微管的动力学行为和取向决定了各种神经元区室的身份特征、极性运输、生长及发育过程7。因此，必须在活体条件下评估微管的动力学行为和取向，以与神经元的重塑过程建立关联。
微管由α和β微管蛋白异源二聚体的原纤维组成，具有动态的正端和相对稳定的负端11,12. 加端复合物及相关末端结合蛋白的发现为评估微管组织提供了研究平台13末端结合蛋白（EBP）会瞬时结合到微管的生长正端，其结合动力学与微管原纤维的生长相关。14,15由于加端复合物与微管频繁地结合和解离，GFP标记的EBP的点扩散函数表现为一个 &#34;彗星&#34; 在延时电影中15,16. 自从在哺乳动物神经元中首次观察到这一现象以来16，已利用荧光蛋白标记的末端结合蛋白在不同模式系统和神经元类型中测定微管动力学17,18,19,20,21,22,23.
由于其简单的神经系统和透明的身体， 秀丽隐杆线虫 已被证明是研究发育和再生过程中神经元重塑的优良模型系统 体内. 本文描述了在触觉神经元发育与再生过程中标记、成像和分析微管动态及生长的方法 秀丽隐杆线虫 利用基因编码的 EBP-2::GFP，我们对 PLM 神经元中的微管进行了成像，从而能够确定该神经元两种不同神经突中微管的极性24该方法可观察并量化EBP彗星结构，以评估不同细胞环境中的微管动态。例如，可通过本方案检测轴突切断后启动轴突再生的微管行为局部变化。该检测方法可适用于多种细胞类型和遗传背景下，研究微管动态在各种细胞过程中的调控机制。

<table><tbody><tr><td>CZ18975 线虫品系</td><td>Yishi Jin 实验室</td><td>CZ18975</td><td>由 Anindya Ghosh-Roy 构建</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>盖玻片（18 mm × 18 mm）</td><td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>带加热模块的干浴器</td><td>Neolab</td><td></td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>载玻片（35 mm × 25 mm）</td><td>Blue Star</td><td></td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球溶液（4.55 × 10¹³ 粒子/mL，水相介质含极少量表面活性剂）</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>试管</td><td></td><td></td><td>线虫封片</td></tr><tr><td>OP50 细菌品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td><td>OP50</td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>吸管/毛细管</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>铂金丝</td><td></td><td></td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>带荧光附件的体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>线虫操作</td></tr><tr><td>0.3% 氯化钠</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>0.25% 蛋白胨</td><td>T M Media</td><td>1506</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>10 mg/mL 胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>1 mM 氯化钙二水合物</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>1 mM 硫酸镁七水合物</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>2% 琼脂</td><td>T M Media</td><td>1202</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>25 mM 磷酸二氢钾（一碱式）</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>线虫生长培养基</td></tr><tr><td>0.1 M 磷酸二氢钾（一碱式）</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1× M9 缓冲液</td></tr><tr><td>0.04 M 氯化钠</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>1× M9 缓冲液</td></tr><tr><td>0.1 M 氯化铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>21405</td><td>1× M9 缓冲液</td></tr><tr><td>0.2 M 磷酸氢二钠七水合物（二碱式）</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1× M9 缓冲液</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Borosil</td><td></td><td>缓冲液储存</td></tr><tr><td>488 nm 激光器</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>5× 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>63× 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>相机</td><td>Photometrics</td><td>Evolve 512 Delta</td><td>成像</td></tr><tr><td>转盘共聚焦系统计算机</td><td>HP</td><td>Intel &amp;reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td><td>成像</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>成像</td></tr><tr><td>卤素灯</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>汞弧灯</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>转盘共聚焦单元</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>成像</td></tr><tr><td>ZEN2 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>Image J（Fiji 版本）</td><td></td><td></td><td>图像分析与处理</td></tr><tr><td>Adobe Creative Cloud</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像分析与处理</td></tr><tr><td>图像分析计算机系统</td><td>Dell</td><td>Intel &amp;reg; Core &amp;trade; i7-9700 CPU 3.00GHz</td><td>图像处理/展示</td></tr></tbody></table>

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

在神经元中，微管的取向是识别轴突和树突的关键指标：轴突的微管呈正端朝外，而树突的微管通常具有混合取向。本文描述了标记、成像和分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）触觉神经元发育与再生过程中微管动态行为及生长的方法。利用基因编码的微管末端荧光报告系统，我们对轴突内的微管进行了成像。该方案可用于量化在轴突切断后启动轴突再生过程中微管行为的局部变化。本检测方法可适用于其他类型的神经元和不同遗传背景，以研究微管动态在多种细胞过程中的调控机制。

作为一个代表性示例，我们描述了在PLM神经元的稳态轴突和再生轴突中对EBP彗星结构的活体观察。PLM神经元位于线虫尾部，具有一条向前延伸并形成突触的长轴突以及一条较短的向后突起。这些神经元紧邻表皮沿前后方向生长，负责介导线虫对轻触刺激的感觉。由于其结构简单，且易于进行成像和显微手术操作，PLM神经元已被广泛用于研究微管细胞骨架29、轴突运输30,31、再生能力19,32、神经元极性24,33,34、行为与衰老35,36，以及其他多种神经元过程。本研究利用在<...

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

在神经元中，微管方向是鉴定轴突和树突的关键指标：轴突具有正端朝外的微管，而树突通常具有混合方向的微管……

本实验的目的是在活体条件下评估微管的组织结构和动态行为。神经元是具有极性的细胞，其轴突、树突和突触等不同区室由细胞骨架维持。微管构成了神经元细胞骨架的主体，其动态特性和取向决定了神经元发育与成熟过程中的关键事件。微管由α和β微管蛋白异源二聚体组成，具有固有的极性，其正端高度动态，而负端则较为稳定。在正端发生聚合时，一类多分子复合物——末端结合蛋白会短暂地与原纤维结合，并促进微管蛋白二聚体的组装。该技术将有助于我们在活体条件下观察神经微管的结构。利用该技术，可以在秀丽隐杆线虫（C.elegans）神经元发育和再生过程中确定动态微管的方向及其他参数。我们通常使用该报告基因来可视化感觉神经元中的微管动态。然而，也可在其他细胞类型（如肌肉和皮肤细胞）中表达该报告基因，以观察这些细胞中动态微管的行为。荧光标记的末端结合蛋白（如此处的EBP与GFP），呈现为彗星状结构。这些彗星状结构的动态行为与微管的同步生长相关，是评估微管动态性和取向的关键指标。为了在特定细胞类型中观察这些彗星状结构，需在特定启动子驱动下表达含有EBP-2和GFP基因的转基因。为了在PLM神经元中表达，该转基因在make for启动子的驱动下表达。可在解剖显微镜下观察这些转基因线虫的荧光信号，以便在分选或制片前进行检测。为了制备用于成像EBP彗星的线虫样本，我们使用M9缓冲液配制10% Argos溶液。在载玻片上滴加一滴溶液，再用另一张载玻片将液滴压成薄膜，该薄膜会固化形成垫片。我们使用0.1微米的聚苯乙烯微珠作为封固介质，挑取少量线虫并重新悬浮于微珠溶液中。将盖玻片轻轻压下以固定线虫，随后进行成像。固定好的样品可在配备相机的任何荧光显微镜上进行高分辨率成像。该系统配备转盘装置，可实现更快的图像采集，并减少光漂白和光毒性。将载玻片置于载物台上，使用明场照明对焦并居中观察线虫视野。此步骤可使用5X或10X等低倍物镜。随后可切换至63X等高倍物镜，并采用相同照明方式重新对焦线虫。该物镜可为彗星成像提供最佳的空间分辨率。在荧光照明下对 PLM 神经元进行固定居中定位，以避免 prum 受到过度光照和光漂白。图像采集使用远程站点的 send 软件进行。使用明场通道的活体成像配置，我们聚焦于线虫的尾部区域，并将其置于视野中央。随后，采用488纳米激发光的明场成像配置对PNM神经元进行聚焦。对于延时成像实验，需设置曝光时间、延时总时长以及帧间间隔，这些参数共同决定了成像的时间分辨率。对于定量测量，需使用开源软件 Image J 分析部分 EBP 彗星图像。获取的时间序列图像将以多图像序列的形式打开，可预览为动态视频。在此特定的时间序列中，可在 PLM 神经元的胞体、前突和后突中观察到彗星状结构。远离细胞体运动的彗星状结构被归类为正端朝外，而朝向细胞体运动的则被归类为负端朝外。分析开始时，在感兴趣区域上绘制一条分段

in-vivo-assessment-microtubule-dynamics-orientation-caenorhabditis

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在体内卡诺哈布德炎电子神经元微管动力学和方向评估

来源：Doser, R., 等. 体内神经元钙处理的亚细胞成像. J. Vis. Exp. (2023)本视频展示了对转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内...

体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突和细胞内运输的良好模型。在此，我描述了一种实验方案 体内 轴突内运输与鞭毛内运输的记录与分析 秀丽隐杆线虫.

用于分析神经元内细胞内运输的 Caenorhabditis elegans 固定方法

本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis...

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

该方法提供了一种将光遗传学与基因编码的钙离子传感器相结合的技术，用于成像模式生物 C. elegans...

在体钙成像技术在 C. elegans 体壁肌肉中的应用

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本文展示了如何使用七分评分系统，对 C. elegans...

量化多巴胺能神经元形态改变与变性水平 秀丽隐杆线虫

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

本文描述了优化荧光显微镜成像参数的方法，以在活体线虫中以单神经元分辨率观察内源性标记货物的轴突运输过程。...

在活体Caenorhabditis elegans中通过荧光显微镜优化内源性货物轴突运输的可视化

了解利用荧光标记EBP蛋白在秀丽隐杆线虫PLM神经元中进行活体微管成像的技术。该方法可实时观察微管动态变化，评估其方向性与生长行为，为神经发育和再生研究提供重要工具。

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

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