在体内卡诺哈布德炎电子神经元微管动力学和方向评估
2021年11月20日
提出了一种使用荧光标记的末端结合蛋白对 体内 动态微管进行成像的协议。我们描述了标记、图像和分析 C.elegans后脊柱（PLM）神经元中的动态微管的方法。
该过程的目的是评估体内的微管组织和动力学。神经元是具有不同轴突、树突和突触区室的极化细胞，由其底层细胞骨架维持。微管形成神经元细胞骨架的大部分，动力学和方向决定了神经元发育和成熟过程中的关键事件。
微管由α和β微管蛋白异源二聚体组成，并且具有固有的极化，具有高度动态的正端和稳定的负极。在正端聚合过程中，末端结合蛋白的多分子复合物与原丝瞬时结合并促进微管蛋白二聚体的组装。这项技术将帮助我们可视化体内的神经微管。
使用这种技术，可以确定秀丽隐杆线虫神经元发育和再生过程中动态微管的方向和其他参数。我们通常使用这个报告器来可视化感觉神经元中的微管动力学。然而，人们可以在其他细胞类型（如肌肉和皮肤）中表达这种报告器，以可视化这些细胞中的动态微管。
荧光标记的末端结合蛋白，如EBP到GFP，在这里显示为彗星。这些彗星的动力学与伴随的微管生长相关，并且是衡量微管动力学和方向的关键指标。为了在特定细胞类型中观察这些彗星，具有EBP-2和GFP DNA的转基因在特定的启动子下表达。
对于PLM神经元中的表达，该转基因在助推子下表达。这些转基因蠕虫可以在体视显微镜下观察，并在分类或安装之前设置荧光。为了安装蠕虫以成像EBP彗星，我们在M9缓冲区中制造了10%Argos。
并在载玻片上滴一滴。另一张幻灯片用于将液滴压入固化成垫的薄膜中。我们使用0.1微米的聚苯乙烯珠作为安装介质，将一些蠕虫捡起并重新悬浮在珠子溶液中。
一个盖玻片被挖走以固定蠕虫并进行成像。安装的可以在任何荧光显微镜上使用相机进行成像，以进行高分辨率成像。该装置配备了旋转磁盘单元，可加快采集速度并减少光漂白和光毒性。
幻灯片保持在舞台上，并使用明场照明聚焦和居中蠕虫的场。5X或10X等低倍率物镜可用于此目的。蠕虫可以使用相同的照明在高倍率物镜（如63X）下重新聚焦。
该目标为彗星的成像提供了最佳的空间分辨率。PLM神经元的固定居中是在荧光照射下完成的，以防止过度的光照和脾气的光漂白。对于图像采集，我们使用异地发送软件。
在明场通道中使用实时成像配置，我们将蠕虫的尾部区域聚焦，并将其居中在视场中。接下来是使用具有488纳米激发光的光成像配置对PNM神经元进行聚焦。对于延时采集，会创建一个实验设置，其中曝光时间、延时持续时间和帧之间的间隔定义了成像的时间技能。
对于定量测量，EBP彗星的一些电影将在Image J上进行分析，这是一个开源软件。采集的延时摄影以多图像线的形式打开，可以作为电影预览。在这种特殊的延时过程中，可以在细胞体中，PLM神经元的前后过程中看到彗星。
远离细胞体的彗星被归类为正端输出，而那些向细胞体移动的彗星被归类为负端输出。为了开始分析，在感兴趣的区域上绘制一条分段线，在本例中是PLM神经元的内部过程。该线段使用图像的网片功能转换为运动记录仪。
运动记录仪是一种距离时间图像，其对角线折痕代表移动的彗星。可以在这些迹线上绘制直线段，并使用分析菜单设置测量参数。这些参数可以在数据分析程序（如Excel）中转换为标准可测量的数量和单位。
迹线的宽度对应于生长长度。高点代表生长持续时间，折痕的角度给出了彗星的方向。这些彗星可以进一步分为正端输出和负端输出，以找到微管的相对方向。
EBTA GFP的转基因表达可以适应于观察各种细胞环境中的微管动力学，例如新的再生。为了观察区域额定轴突中的微管动力学，使用飞秒激光对轴突进行损伤，这可以精确地切断轴突而不会造成巨大的附带损害。受伤后，蠕虫可以恢复到播种的发动机板上，以便以后观察。
PLM神经元显示出强大的外显神经再生，最早可以在损伤后六小时观察到。为了防止光毒性对再生新权利，在旋转的圆盘显微镜中进行实时成像。再生轴突的延时采集可以在以后转换为用于分析彗星的运动记录仪。
然后，彗星的距离持续时间和方向可以从微管方向和动力学的角度来解释。我的关键方向和动力学是民用细胞过程的关键决定因素，如细胞分裂，迁移和细胞结构的维持。虽然有许多工具可用于测量微管动力学，但体内测量可能具有挑战性。
自花序、光毒性、过度表达伪影和报告强度可变是评估微管动力学的实时观察过程中遇到的一些困难。通过使用具有低浓度脱位DNA和低照明成像的集成转基因技术，本研究已经解决了减轻其中一些挑战的方法。这里描述的成像和分析模块可以扩展到其他基于微管的报告基因和蛋白质转运。
这不仅适用于C.elegance神经元，而且可以应用于其他细胞类型和模型系统。
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概述
本研究提出了一种使用荧光标记的末端结合蛋白EBP在秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中进行动态微管体内成像的协议。该协议旨在可视化微管动力学，使研究人员能够评估神经元发育和再生过程中这些细胞骨架结构的方向和行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞骨架动力学
- 荧光成像
背景
- 微管对神经元结构和功能至关重要，影响发育和成熟。
- 它们由α和β微管蛋白组成，表现出对神经元过程至关重要的动态行为。
- 末端结合蛋白在促进微管组装和动力学方面起着关键作用。
研究目的
- 开发一种可视化体内微管动力学的方法。
- 分析秀丽隐杆线虫神经元发育和再生过程中微管的行为。
- 适应该技术以用于神经元以外的各种细胞类型。
使用的方法
- 使用带旋转光盘单元的荧光显微镜进行成像。
- 秀丽隐杆线虫作为生物模型，重点关注PLM神经元。
- 利用GFP融合的EBP-2的转基因表达进行标记。
- 使用聚苯乙烯珠将虫体固定，并在荧光显微镜下观察。
- 使用ImageJ进行时间轴成像和分析，以进行微管动力学的定量测量。
主要结果
- 观察到的彗星代表动态微管，其移动被归类为正端向外或负端向外。
- 该方法能够评估微管的生长方向、持续时间和动力学，特别是在轴突损伤后。
- 观察结果表明轴突具有强大的再生能力，并且微管定向模式明确。
结论
- 本研究促进了神经元中微管动力学的可视化和分析，增进了对发育和损伤反应过程中神经元行为的理解。
- 研究结果对探索各种生物环境中的神经元机制和可塑性具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding microtubule dynamics in neurons provides critical insights into axonal integrity and regeneration, which are central to neurodegenerative disease mechanisms and neuroprotective target validation. This in vivo assay enables quantitative assessment of cytoskeletal behavior, supporting early-stage hypothesis testing in neuronal health and repair pathways. The approach offers a scalable, genetically tractable system for de-risking targets involved in cytoskeletal regulation and neuronal resilience.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule orientation and dynamics as functional readouts for target engagement in neuronal models.
- Operational Value: Provides a quantitative, imaging-based assay to assess compound effects on axonal microtubule behavior in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative readouts of microtubule growth direction and dynamics via comet analysis in kymographs.
- Operational Value: Establishes a standardized, adaptable platform for live imaging that can be applied across genetic backgrounds and neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking microtubule dynamics to axonal regeneration outcomes following injury.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of repair processes, enabling predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional cytoskeletal readouts that inform target validation and lead optimization in neuroscience programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microtubule-regulating targets through direct visualization of plus-end dynamics in axons.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable outputs (comet trajectory, orientation) for compound screening in neuronal models.
- Analytics: Generates measurable parameters (growth velocity, duration, direction) from kymograph analysis to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects dynamic microtubule behavior to regenerative capacity, supporting continuity from hit identification to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The transgenic reporter system can be redeployed across cell types and disease models, enhancing platform sustainability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking molecular perturbations to functional cytoskeletal outcomes in neurons.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging protocols with minimal variability through controlled mounting and low-phototoxicity acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based biomarkers of axonal health and regenerative potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in cytoskeletal stability and neuronal repair mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic C. elegans handling, fluorescence microscopy, and kymograph-based image analysis.
- Dependent on spinning disk confocal or equivalent high-speed, low-phototoxicity imaging systems for longitudinal studies.
- Necessitates standardization of promoter-driven expression and mounting protocols across labs for reproducible comet detection.
- Adaptation to other cell types requires validation of promoter specificity and microtubule reporter compatibility.
- Practical limitations include potential overexpression artifacts and photobleaching, mitigated by low-expression transgenes and controlled illumination.
