穿梭箱实验作为成年斑马鱼学习与记忆研究中认知评估的关联学习工具

穿梭箱实验可重复地追踪斑马鱼在遭受钝力创伤或任何其他类型脑损伤后认知功能障碍的发展及恢复情况。穿梭箱实验能够相对简便、快速且可靠地测量斑马鱼短期和长期记忆中的联想学习能力。首先，准备穿梭箱：取一个30.5 × 19 × 7.5厘米的凝胶电泳箱，在其两侧各以45度角添加一块5 × 19厘米的水族级有机玻璃板进行改造。

然后在水箱上标记中点位置，以判断斑马鱼何时游过水箱中央。在穿梭箱中加入 800 毫升系统用水后，将两到三条斑马鱼放入盛有系统用水的暂养水箱中。将水箱置于即将进行穿梭箱实验的暗室中。

接下来，在暗室中，将一条鱼放置于穿梭箱的中央。固定盖子，并将电极连接至电源。鱼应在黑暗环境中适应一段时间。

关闭所有灯光，让斑马鱼在穿梭箱中适应15分钟。当斑马鱼自由探索水箱时，可视为已完成适应。在斑马鱼成功适应后，手动将一个800流明、红光镜头的手电筒置于斑马鱼所在侧的凝胶箱壁附近约两厘米处照射。

如果鱼停留在铂丝附近休息，则不要开始试验。将光刺激直接照射在鱼身上，并手动跟随鱼的任何横向移动，以确保光刺激持续可见。持续提供光刺激，直到满足以下成功或失败试验的任一条件为止。

如果斑马鱼在光照暴露后15秒内越过水箱的中点，则视为试验成功。一旦斑马鱼越过中点，立即停止光照刺激。如果试验失败，使用电泳电源对鱼施加20毫伏至1安培的负电刺激，以开启2秒、关闭2秒的模式交替进行，持续15秒，最多施加4次电击，或直至斑马鱼越过盒子的中点为止。

然后同时终止光照和负性刺激。在训练开始前，需确保斑马鱼已成功适应穿梭箱环境，方法是将鱼置于黑暗条件下静置15分钟。随后，手动将一个800流明、配备红透镜的手电筒置于靠近斑马鱼所在侧凝胶箱壁约两厘米处，进行照射。

将光刺激直接照射在鱼体上，并随着鱼的侧向移动同步移动光源，以确保持续观察到刺激效果。在光照鱼体的同时，同步施加20毫伏至1安培的有害电击刺激，每次持续2秒，间隔2秒，循环15秒，最多施加四次电击，或直至鱼游过实验箱的中点位置。一旦达到该条件，立即终止光照和有害刺激。

重复25次。完成后，让鱼在黑暗条件下再次适应15分钟。在初始测试阶段，先在穿梭箱中成功适应15分钟，然后仅施加光照刺激，持续最多15秒，并记录其反应。

如果鱼类在光照刺激开始后15秒内穿过穿梭箱的中点，则视为试验成功，并在鱼类穿过中点时立即停止光照刺激。如果鱼类在光照刺激开始15秒后仍未穿过穿梭箱的中点，则视为试验失败，并在15秒后停止光照刺激。在初始测试期间，若尝试失败，不要施加有害刺激。

在初始测试期结束后立即进行短期记忆测试。诱导产生严重的脑损伤，并在测试前等待四小时。随后将鱼在穿梭箱中适应15分钟。

通过仅施加光刺激最多15秒来评估短期记忆，记录在光关闭前斑马鱼是否越过实验箱的中点位置：若越过中点则视为通过试验，若在15秒内未越过中点则视为未通过试验。重复上述步骤25次，每次试验之间间隔30秒，并记录成功与失败的试验次数。在初次测试后的第四天进行长期记忆测试。

诱导创伤性脑损伤，然后等待四小时再进行测试，接着将鱼在穿梭箱中适应15分钟。通过仅施加光刺激最多15秒来评估长期记忆，记录鱼是否在光关闭前穿过箱子的中点位置，若穿过则视为通过试验，若在15秒内未穿过中点则视为未通过试验。重复上述操作25次，每次试验之间间隔30秒，并记录成功和失败的试验次数。

用于认知评估的学习与记忆范式的教学概述如图所示。八个月（年轻成年）、18个月（中年成年）和24个月（老年成年）的未受损鱼类在学习避免红光行为时，所需的训练次数相似。在采用重度钝性创伤性脑损伤模型（STBI）后，不同年龄的鱼类在伤后1至5天内掌握该检测所需的训练次数也相似。

在发生STBI后的第一天，所有年龄段的鱼类学会该行为所需的试验次数相似，且显著多于未受损的对照组。未受损的鱼类能够快速掌握穿梭箱任务，大约经过17次试验即可连续完成五次成功的试验；而在经历一次轻度脑损伤（即轻度TBI）后一天，鱼类学会该行为所需的试验次数显著增加。该缺陷在经历两次轻度TBI后进一步加重，并在经历三次轻度TBI损伤后更加显著。

未受损的鱼类在即时记忆和延迟记忆的成功试验百分比差异上，相较于初始测试阶段仅有轻微上升。在经历一次轻度创伤性脑损伤（TBI）后，鱼类与未受损鱼类相比，表现出显著且即时的记忆功能缺陷。随着损伤次数增加，这种趋势持续存在，在经历两次和三次轻度TBI后，记忆缺陷进一步加重。

施加不利刺激的时机至关重要。将不利刺激与光刺激配对并同时撤除，可强化二者之间的关联，这是该实验范式的关键所在。该检测方法能够快速评估复杂的关联学习能力，可用于研究发育、衰老及环境因素对认知功能障碍的影响。