用于小分子化合物快速定量检测的侧向流动免疫层析试纸条的开发

该方法描述了胶体金的制备及免疫层析试纸条的组装。首先，采用氯金酸和柠檬酸钠合成胶体金。将柠檬酸钠加入氯金酸溶液中，煮沸，以获得适当粒径的胶体金。

合成胶体金抗体结合物。离心后，将胶体金颗粒溶解于适当溶液中，随后重悬以获得胶体金溶液。将玻璃纤维膜浸入该结合物溶液中，以制备结合垫。

将人工抗原和二抗分别滴加在硝酸纤维素膜上作为检测线（T线）和质控线（C线）。将硝酸纤维素膜、吸收膜、样品垫和玻璃纤维膜依次贴附到PVC板上。将组装好的板条切割成宽度为3.5毫米的试纸条。

分别配制足量的百分之一氯金酸溶液和1%柠檬酸钠溶液。打开磁力搅拌器，将烧瓶置于搅拌器上。向圆底烧瓶中加入120毫升蒸馏水，并在恒温磁力搅拌器上加热至沸腾。

保持沸腾，迅速加入0.5毫升1%的氯金酸和5毫升1%的柠檬酸钠。继续加热5到10分钟。观察溶液颜色由浅黄色变为酒红色。

关闭恒温磁力搅拌器的电源，冷却至室温，然后将混合物转移至洁净的瓶子中。在4°C下保存。金纳米颗粒表现出丁达尔效应。

通过紫外光谱法和透射电子显微镜成像确定金纳米颗粒的尺寸和形态。向8支试管中各加入100微升氯化钠溶液。使用0.1摩尔/升碳酸钾将胶体金溶液的pH值调节至5至12。

向含有氯化钠的八支试管中各加入100微升胶体金溶液。混匀后静置数分钟。观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。

选择添加碳酸钾量最少且溶液颜色稳定的 pH 值，作为制备偶联物的最适 pH 值。采用相同方法，观察颜色变化，并记录仍保持红色的试管。

选择单克隆抗体浓度最低且溶液颜色稳定的抗体用量作为最佳单抗用量。取10毫升胶体金溶液，用0.1摩尔/升碳酸钾将溶液调节至最佳pH值。缓慢加入适当浓度的SSd单克隆抗体，在室温下振荡30分钟。

在4°C条件下，以2000 RPM转速离心混合物20分钟。去除含有沉淀的胶体金杂质。再以10,000 RPM转速离心混合物40分钟。

弃去上清液，沉淀物为胶体金-单克隆抗体结合物。加入Tris盐酸、BSA、Tween 20和PEG 20,000，充分混匀以制备重悬缓冲液。

加入重悬缓冲液并解离沉淀。膜材料条，包括玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜和PVC板。该膜材料需通过无菌显微镜进行追踪和评估，以消除不均一性。

首先，将NC膜放置在PVC板上，距板的截断端边缘2厘米处。其次，在NC膜上距上边缘2厘米处滴加2毫克/毫升的SSd-BSA作为检测线，并在距下边缘2厘米处滴加1.5毫克/毫升的胶体金抗小鼠IgG作为质控线。将吸收垫贴在PVC板上NC膜的上方，并与NC膜重叠2毫米。

将玻璃纤维膜裁剪至长5厘米、宽2厘米，用作结合垫。将玻璃纤维膜浸入金纳米颗粒-单克隆抗体结合物溶液中，浸泡一段时间，使金纳米颗粒-单克隆抗体充分吸附。

将大尺寸膜在37度的培养箱中干燥。将预处理的结合垫贴在NC膜下方，与NC膜的重叠长度应为0.1厘米。将Fusion3膜裁剪成1.8厘米长、3.5厘米宽，用作样品垫。

然后，将样品垫放置在PVC板上，并与结合垫重叠两毫米。使用切条机将纸板裁切成3.5毫米宽的条状，再通过批量压合系统进行压合组装。最后，将试纸条装入外壳中。

将它们密封在含有干燥剂的铝箔袋中，并避光保存。此时，免疫层析试纸条已组装完成。向样品孔中滴加50微升样品溶液，以观察层析过程。

接下来，使用便携式试纸条读取仪分析试纸条。该仪器可提供检测线与质控线的比值。评估免疫层析试纸条检测的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。

制备的胶体金溶液进行了检测。透射电子显微镜分析显示，颗粒呈多面体形，分布均匀，平均直径为14纳米。高分辨率透射电子显微镜图像显示，金纳米颗粒具有连续的条纹图案，条纹间距为0.117纳米。

紫外-可见吸收光谱表明，通过改变柠檬酸钠与氯金酸的比例，可以获得不同粒径的胶体金颗粒。在定量实验中，使用便携式ICS读数仪扫描柴胡皂苷D检测结果的试纸条。通过将柴胡皂苷D的不同浓度与其对应的吸光度相关联，绘制出标准曲线。

经过方法学研究后，该方法可用于小分子化合物的定量和半定性检测。本实验流程包括胶体金的制备、金纳米颗粒-单克隆抗体结合物的合成、试纸条的组装以及方法学研究。本研究提供了用于快速定量检测小分子的免疫层析试纸条开发的详细操作方案。

观看完本视频后，希望您能够充分掌握免疫层析试纸条的制备方法。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。