Name: 开发用于快速定量检测小分子化合物的横向流动免疫色谱带 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习制备胶体金纳米颗粒并组装免疫色谱试纸条的方法，用于快速定量检测小分子化合物。本方案详细展示了氯金酸与柠檬酸钠合成、抗体偶联及试纸条组装的关键步骤，为诊断检测研究提供可靠的技术参考。

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本工作得到中央部门所属高等院校基本科研业务费专项资金的资助。感谢北京中医药大学经典方剂基础研究团队的支持。

本研究中进行的所有操作均经北京中医药大学伦理审查委员会批准（批准编号：2017BZYYL00120）。
1. 胶体金的制备与表征
注意：在胶体金合成过程中，由于胶体金容易吸附在容器内壁，并易受杂质影响而发生沉淀，因此用于合成和储存胶体金的容器应彻底清洗并用酸液浸泡（40 mL 蒸馏水、360 mL 浓硫酸、20 g 重铬酸钾）或进行表面钝化处理。本实验采用柠檬酸还原法合成胶体金。
<ol>
	<li>打开磁力搅拌器，将烧瓶（250 mL）放置在搅拌器上。</li>
	<li>分别配制4%的氯金酸溶液和1%的柠檬酸钠溶液。</li>
	<li>向圆底烧瓶中加入120 mL蒸馏水，并在恒温磁力搅拌器上加热至沸腾。</li>
	<li>保持沸腾状态，迅速加入0.5 mL的4%氯金酸溶液和5 mL的1%柠檬酸钠溶液。</li>
	<li>观察溶液颜色变化。淡黄色的氯金酸溶液在数分钟内变为酒红色。</li>
	<li>继续加热10分钟，直至溶液由无色变为透明的酒红色。</li>
	<li>关闭恒温磁力搅拌器电源，冷却至室温，将混合液转移至洁净的容器中，于4 °C保存。</li>
	<li>采用紫外光谱法和透射电镜（TEM）成像测定金纳米颗粒（AuNPs）的尺寸和形貌。 
	&#8203;注意：通过调整柠檬酸钠与氯金酸的比例，可获得适用于不同应用的多种尺寸的胶体金颗粒。</li>
</ol>
2. AuNPs-mAb 偶联物的合成
注意：由于抗体通过静电吸附与胶体金结合，蛋白质和胶体金表面的电荷直接影响结合强度；因此，缓冲液的pH值是影响抗体-胶体金结合物稳定性的关键因素。本方案以SSD和抗SSD单克隆抗体为例进行说明。
<ol>
	<li>偶联 pH 值的评估
	<ol>
		<li>向八支试管中各加入 100 μL NaCl 溶液（10% m/v）。</li>
		<li>用 0.1 M K2CO3 将金纳米颗粒（AuNP）溶液的 pH 值分别调节至 5、6、7、8、9、10、11 和 12。</li>
		<li>向含有 NaCl 的八支试管中各加入 100 μL 胶体金溶液（pH 已调节至 5–12）。</li>
		<li>混合后静置数分钟，观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。</li>
		<li>选择 K2CO3 添加量最少且溶液颜色稳定的 pH 值，作为制备 AuNP-单克隆抗体（mAb）偶联物的最佳 pH 值。 
		&#8203;注意：请勿使用 pH 计，因为探针可能被 AuNPs 损坏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体用量的评估
	<ol>
		<li>向八支试管中各加入 100 μL NaCl 溶液（10% m/v）。</li>
		<li>向每支试管中加入 100 μL 最佳 pH 值的胶体金溶液。</li>
		<li>向上述八支试管中分别加入单克隆抗体溶液（蛋白浓度为 0.1 mg/mL–3.2 mg/mL）。</li>
		<li>混合后静置数分钟，观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。</li>
		<li>选择单克隆抗体浓度最低且溶液颜色稳定的抗体用量，作为制备 AuNP-mAb 偶联物的最佳抗体用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备重悬缓冲液：加入 1 M Tris-HCl（pH 8.8）、1%（w/v）BSA、0.5%（v/v）Tween 20 和 1%（v/v）PEG 20000，充分混匀。</li>
	<li>AuNP-mAb 偶联物的合成
	<ol>
		<li>取 10 mL 胶体金溶液，用 0.1 M K2CO3 将溶液调节至最佳 pH 值。</li>
		<li>缓慢加入适当浓度的 SSD 单克隆抗体（mAbs），在室温下振荡反应 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 83 × g（1,000 rpm）离心 10 分钟，弃去沉淀（其中含有杂质或已沉淀的胶体金）。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 8,330 × g（10,000 rpm）离心 30 分钟，弃去上清液，沉淀即为胶体金-mAb 偶联物。</li>
		<li>加入重悬缓冲液以重新分散沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 条带的组装
注意：对于后续的流动免疫测定，膜材料的选择和预处理将直接影响检测结果，需进行考察。免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜、吸收垫和聚氯乙烯（PVC）板组成（图1）。应使用体视显微镜对膜材料进行检查和评估，以排除不均匀性。
<ol>
	<li>将NC膜粘贴在PVC板上，距离板的吸水端边缘2 cm处。</li>
	<li>将SSD-BSA（2 mg/mL）溶液以滴加方式加至NC膜上（距上边缘2 cm处），作为检测线（宽度1 mm）；再将羊抗小鼠IgG（1.5 mg/mL）溶液以滴加方式加至NC膜上（距下边缘2 cm处），作为质控线（宽度1 mm）。注意控制蛋白添加量。</li>
	<li>将吸水垫贴于PVC板上NC膜的上方，并与NC膜重叠2 mm。</li>
	<li>将玻璃纤维膜浸入AuNPs-mAb偶联物溶液中，随后置于37 °C恒温培养箱中干燥。</li>
	<li>将玻璃纤维膜裁剪为长5 cm、宽2 cm，作为偶联物垫。</li>
	<li>将预处理后的偶联物垫粘贴在NC膜下方，与NC膜重叠长度为0.1 cm。 
	NOTE: 玻璃纤维膜具有较强的蛋白质结合与释放能力。</li>
	<li>将融合3膜裁剪为长1.8 cm、宽3.5 cm，作为样品垫。</li>
	<li>将样品垫粘贴在PVC板上，并与偶联物垫重叠2 mm。</li>
	<li>使用切条机将组装好的纸板切割成宽度为3.5 mm的试纸条，并通过批量覆膜系统进行压合。</li>
	<li>最后，将试纸条装入外壳中，密封于含干燥剂的铝箔袋内，避光保存。此时免疫层析试纸条（ICSs）已组装完成。 
	&#8203;NOTE: 上述为实验室操作流程；在生产过程中，使用喷金设备和划膜仪进行喷金及T线、C线的包被。</li>
</ol>
4. 定量检测
<ol>
	<li>将50 µL样品溶液滴加到样品孔中，观察层析过程。 
	注意：由于吸水垫产生的毛细作用，样品溶液会向试纸条的另一端迁移。当样品溶液到达结合垫时，样品中的SSD（抗原）会与预载在垫上的AuNPs-mAb发生反应。当溶液继续迁移并到达检测线（T线）时，未结合SSD的AuNPs-mAb可被SSD-BSA（抗原-载体蛋白偶联物）特异性捕获，从而在T线上呈现红色。随后，溶液迁移至质控线（C线），此处AuNPs-mAb会被区域内的羊抗小鼠IgG捕获，从而在C线上呈现红色。</li>
	<li>使用便携式试纸条读取仪分析试纸条。仪器可提供检测线与质控线的信号比值（T/C）。</li>
	<li>评估ICS检测的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。 
	注意：在定性检测中，仅出现一条红色质控线表示结果为阳性（质控线）；出现两条红色线（检测线和质控线）表示结果为阴性。若质控线未出现，则该检测结果视为无效。</li>
</ol>

<ol><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-based+lateral+flow+immunochromatographic+strip+with+nanoparticles+as+reporters+for+detection%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).</li>
<li>Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune+chromatographic+assay+for+rapid+and+simultaneous+detection+of+levonorgestrel+and+methylprednisolone+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples.</a> Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).</li>
<li>Lai, J. J., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lateral-flow+immunoassay+%28LFIA%29+diagnostics+via+biomarker+enrichment+for+mHealth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth.</a> Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).</li>
<li>Zhang, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal+gold-based+lateral-flow+immunoassay+for+the+rapid+simultaneous+detection+of+clenbuterol+and+ractopamine+in+swine+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).</li>
<li>Kranthi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal-gold+based+lateral-flow+immunoassay+kit+for+%27quality-control%27+assessment+of+pyrethroid+and+endosulfan+formulations+in+a+novel+single+strip+format%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format.</a> Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).</li>
<li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immunochromatographic+strip+for+rapid+detection+of+capsid+protein+antigen+p27+of+avian+leukosis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus.</a> Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).</li>
<li>Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , US20040184954A1 (2003).</li>
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<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibody-Europium+Conjugate-Based+Lateral+Flow+Time-Resolved+Fluoroimmunoassay+for+Quantitative+Determination+of+T-2+Toxin+in+Cereals+and+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed.</a> Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).</li>
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<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+double+antibody+sandwich-lateral+flow+immunoassay+for+the+rapid+and+simple+detection+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).</li>
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<li>Song, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescent+lateral-flow+immunoassay+for+hepatitis+B+virus+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping.</a> Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+GsRerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Application+of+a+Rapid+IgM-IgG+Combined+Antibody+Test+for+SARS-CoV-2+Infection+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).</li>
<li>Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+application+value+analysis+of+the+2019-coronary+virus+disease+was+analyzed+by+the+whole+blood+Sars-COV+2+specific+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Science+Edition%22%5BJournal%5D)">The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection.</a> Natural Science Edition. 42, (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Monoclonal+Antibodies+Against+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products.</a> Journal of Visualized Experiments. , e57116(2019).</li>
<li>Sai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+and+Immunoaffinity+Column+Chromatography+for+Saikosaponin+d+Using+an+Anti-Saikosaponin+d+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody.</a> Planta Medica. 82, 432-439 (2016).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+Immunochromatographic+Strip+Test+for+Rapid+and+Quantitative+Detection+of+Saikosaponin+d%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d.</a> Molecules. 23 (2), 338(2018).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+Puerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们介绍了一种针对天然产物衍生小分子的单克隆抗体（mAb）制备方案。文中概述了该方法的关键步骤及注意事项，并以小分子SSD为例展示了该方案的应用价值。代表性数据展示了示例谱图、透射电子显微镜（TEM）图像、定量结果以及方法学验证。因此，我们证明了本文所采用的胶体金制备、AuNP-单克隆抗体偶联及试纸条组装策略，可成功构建一种新型免疫分析方法，用于快速检测目标分子。
免疫层析试纸条操作简便，反应迅速。仅需50 μL样本，5分钟内即可完成检测。相比之下，同为免疫分析方法的ELISA则需要数小时，包括多次洗涤和长时间孵育。多次洗涤和较长的孵育时间可有效去除样本基质的非特异性反应，通过提高信号值来改善信噪比和灵敏度。这意味着层析纸条的抗干扰能力及其优化技术是本研究需要解决的关键问题。技术优化可通过多种途径实现：选择合适的样本垫和结合物垫材料；适当增加样本垫的长度，以有效提升样本的预处理能力；采用高pH、高离子强度和高缓冲容量的材料预处理条件，避免生物样本pH值对抗原-抗体反应等干扰因素的影响。由于&#34;三高&#34;条件可能干扰抗体的结合，应综合考虑这一因素。
<p...

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本和快速检测的有用工具。以硝酸纤维素膜作为载体，胶体金作为免疫层析快速诊断试剂的标记物，是目前最常用的即时检测（point of care testing, POCT）方法，其检测项目范围广泛。该技术最初应用于妊娠监测，现已扩展至凝血状态1,2、心肌损伤3、兽医学4、农药残留5、传染病6以及药物浓度的检测。可检测的样本类型也更多样，包括尿液、唾液、全血、血清及其他体液7,8,9。
近年来，已开发出多种用于检测疾病诊断中生物标志物的新颖分析方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（UPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）和酶联免疫吸附测定法（ELISA），这些方法具有高灵敏度、高准确性、可靠性和特异性。然而，这些方法需要复杂的仪器设备、繁琐的前处理步骤以及耗时的检测过程9。因此，迫切需要开发一种更快速、便捷的即时诊断策略，以实现药物活性成分的自我检测和实时监测10,11。
免疫层析试纸条（ICS）因其使用简便而广受欢迎，尤其适用于常规检测，无需专业人员或复杂的仪器设备12。换句话说，未经特殊培训的人员也可操作试纸条或自测试剂13。检测结果可在5分钟内获得，因此可用于现场检查14。此外，根据我们的计算，试纸条的成本可低于1元人民币15，意味着其推广成本较低16。因此，ICS是一种相对准确、操作简单且成本低廉的一次性检测装置。基于胶体金的ICS17,18也已应用于新冠病毒的快速检测。
免疫层析法（ICS）的原理可分为夹心法 ICS 和竞争法 ICS。图 1A 为夹心法 ICS 的示意图，主要用于检测蛋白质等大分子物质，包括肿瘤标志物、炎症因子和人绒毛膜促性腺激素（HCG，早期妊娠抗原）。该方法采用针对抗原不同表位的一对抗体，其中捕获抗体被干燥固定在硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线，标记抗体干燥在结合垫上，二抗则作为质控线。
图1B 是竞争性免疫层析检测（ICS）的示意图，主要用于检测小分子物质（截留分子量 < 2000 Da）。包被抗原固定在硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线，标记抗体则干燥于结合垫上。检测过程中，在毛细作用下，样本与标记抗体流经检测线，包被抗原与样本中的游离抗原竞争结合标记抗体，进而在检测线上形成红色显色反应。
最近，我们描述了针对天然产物的单克隆抗体的制备方法19。在本研究中，我们基于已制备的抗SSD单克隆抗体（mA20）开发了一种新型侧向流动免疫分析法，用于快速、现场检测。结果表明，免疫层析检测法是检测天然产物衍生化合物的一种不可或缺且便捷的工具。
<img alt="侧向层析检测示意图，显示标记单克隆抗体、捕获单克隆抗体；抗原-抗体结合过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62754/62754fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1 免疫层析检测的示意图 (A) 夹心型免疫层析试纸条。(B) 间接竞争型免疫层析试纸条。本图改编自 Zhang et al., 201821。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62754/62754fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>氯金酸溶液 (HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>天津福晨化学试剂厂</td><td>JY-SJ102</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430645</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 ELISA 板</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>国药集团</td><td>H5072</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维膜</td><td>洁益</td><td>XQ-Y6</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG 抗体</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Millipore</td><td>millipore 180</td><td></td></tr><tr><td>卵白蛋白</td><td>北京博德瑞</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG20000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>半硬质 PVC 片材</td><td>洁益</td><td>JY-C104</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>北京化工厂</td><td>C1034</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>国药集团化学试剂</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 吸头 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Solarbio</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

用于小分子化合物快速定量检测的侧向流动免疫层析试纸条的开发

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本自我诊断的有用工具，已高效应用于毒素、生理指标和临床生物标志物的检测。在本方案中，我们详细描述了开发一种快速、灵敏且定量的侧向流动免疫分析方法的步骤（以金纳米颗粒作为标记物，单克隆抗体作为探针）。该流程包括胶体金的制备与表征、AuNP-单克隆抗体偶联物的合成、免疫层析试纸条的组装，以及检测方法的系统研究。结果表明，最终的试纸条可进一步用于小分子的快速便捷自我诊断，可能为生理和生物学指标的快速精确分析提供一种替代工具。

胶体金的表征 
制备的胶体金溶液呈深红葡萄酒色。采用透射电子显微镜（TEM）分析来确定金纳米颗粒（AuNPs）的形貌和形状。图2A- D). 图2A 和 图2B 表明颗粒呈多面体形貌且分布均匀。AuNPs 的平均直径约为 14 nm（图2C）。AuNPs 的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像如图所示 图 2D 和 图2E单个金纳米颗粒（AuNP）的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图像显示连续的晶格条纹，间距为0.117 nm。五种金溶胶溶液的紫外-可见吸收峰分别为518 nm、521 nm、524 nm、534 nm和540 nm，表明随着柠檬酸钠用量的减少，颗粒尺寸略...

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本自我诊断的实用工具，已有效应用于毒素、...

该方法描述了胶体金的制备及免疫层析试纸条的组装。首先，采用氯金酸和柠檬酸钠合成胶体金。将柠檬酸钠加入氯金酸溶液中，煮沸，以获得适当粒径的胶体金。合成胶体金抗体结合物。离心后，将胶体金颗粒溶解于适当溶液中，随后重悬以获得胶体金溶液。将玻璃纤维膜浸入该结合物溶液中，以制备结合垫。将人工抗原和二抗分别滴加在硝酸纤维素膜上作为检测线（T线）和质控线（C线）。将硝酸纤维素膜、吸收膜、样品垫和玻璃纤维膜依次贴附到PVC板上。将组装好的板条切割成宽度为3.5毫米的试纸条。分别配制足量的百分之一氯金酸溶液和1%柠檬酸钠溶液。打开磁力搅拌器，将烧瓶置于搅拌器上。向圆底烧瓶中加入120毫升蒸馏水，并在恒温磁力搅拌器上加热至沸腾。保持沸腾，迅速加入0.5毫升1%的氯金酸和5毫升1%的柠檬酸钠。继续加热5到10分钟。观察溶液颜色由浅黄色变为酒红色。关闭恒温磁力搅拌器的电源，冷却至室温，然后将混合物转移至洁净的瓶子中。在4°C下保存。金纳米颗粒表现出丁达尔效应。通过紫外光谱法和透射电子显微镜成像确定金纳米颗粒的尺寸和形态。向8支试管中各加入100微升氯化钠溶液。使用0.1摩尔/升碳酸钾将胶体金溶液的pH值调节至5至12。向含有氯化钠的八支试管中各加入100微升胶体金溶液。混匀后静置数分钟。观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。选择添加碳酸钾量最少且溶液颜色稳定的 pH 值，作为制备偶联物的最适 pH 值。采用相同方法，观察颜色变化，并记录仍保持红色的试管。选择单克隆抗体浓度最低且溶液颜色稳定的抗体用量作为最佳单抗用量。取10毫升胶体金溶液，用0.1摩尔/升碳酸钾将溶液调节至最佳pH值。缓慢加入适当浓度的SSd单克隆抗体，在室温下振荡30分钟。在4°C条件下，以2000 RPM转速离心混合物20分钟。去除含有沉淀的胶体金杂质。再以10,000 RPM转速离心混合物40分钟。弃去上清液，沉淀物为胶体金-单克隆抗体结合物。加入Tris盐酸、BSA、Tween 20和PEG 20,000，充分混匀以制备重悬缓冲液。加入重悬缓冲液并解离沉淀。膜材料条，包括玻璃纤维素膜、聚酯纤维素膜和PVC板。该膜材料需通过无菌显微镜进行追踪和评估，以消除不均一性。首先，将NC膜放置在PVC板上，距板的截断端边缘2厘米处。其次，在NC膜上距上边缘2厘米处滴加2毫克/毫升的SSd-BSA作为检测线，并在距下边缘2厘米处滴加1.5毫克/毫升的胶体金抗小鼠IgG作为质控线。将吸收垫贴在PVC板上NC膜的上方，并与NC膜重叠2毫米。将玻璃纤维膜裁剪至长5厘米、宽2厘米，用作结合垫。将玻璃纤维膜浸入金纳米颗粒-单克隆抗体结合物溶液中，浸泡一段时间，使金纳米颗粒-单克隆抗体充分吸附。将大尺寸膜在37度的培养箱中干燥。将预处理的结合垫贴在NC膜下方，与NC膜的重叠长度应为0.1厘米。将Fusion3膜裁剪成1.8厘米长、3.5厘米宽，用作样品垫。然后，将样品垫放置在PVC板上，并与结合垫重叠两毫米。使用切条机将纸板裁切成3.5毫米宽的条状，再通过批量压合系统进行压合组装。最后，将试纸条装入外壳中。将它们密封在含有干燥剂的铝箔袋中，并避光保存。此时，免疫层析试纸条已组装完成。向样品孔中滴加50微升样品溶液，以观察层析过程。接下来，使用便携式试纸条读取仪分析试纸条。该仪器可提供检测线与质控线的比值。评估免疫层析试纸条检测的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。制备的胶体金溶液进行了检测。透射电子显微镜分析显示，颗粒呈多面体形，分布均匀，平均直径为14纳米。高分辨率透射电子显微镜图像显示，金纳米颗粒具有连续的条纹图案，条纹间距为0.117纳米。紫外-可见吸收光谱表明，通过改变柠檬酸钠与氯金酸的比例，可以获得不同粒径的胶体金颗粒。在定量实验中，使用便携式ICS读数仪扫描柴胡皂苷D检测结果的试纸条。通过将柴胡皂苷D的不同浓度与其对应的吸光度相关联，绘制出标准曲线。经过方法学研究后，该方法可用于小分子化合物的定量和半定性检测。本实验流程包括胶体金的制备、金纳米颗粒-单克隆抗体结合物的合成、试纸条的组装以及方法学研究。本研究提供了用于快速定量检测小分子的免疫层析试纸条开发的详细操作方案。观看完本视频后，希望您能够充分掌握免疫层析试纸条的制备方法。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附测定法的开发与验证：用于人干扰素-α

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