从生物膜中的Pseudomonas aeruginosa分离总RNA以检测基因表达

摘要

本方案介绍了一种从 铜绿假单胞菌 用于高通量测序的腔室载片上培养的生物膜。

摘要

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性细菌病原体，可导致囊性纤维化（CF）患者呼吸道感染。P. aeruginosa 以其形成生物膜的能力而闻名，这些生物膜由胞外多糖基质保护。该基质使微生物对外界因素（包括抗生素治疗）具有更强的耐受性。目前用于研究生物膜生长的最常见方法是在微量滴定板或带腔载玻片中进行培养。这些系统的优点在于可同时测试多种生长条件，但其缺点是产生的生物膜量较少，难以用于RNA提取。本文旨在提供一份详细、逐步的操作方案，介绍如何从小量生物膜中提取出足够质量和数量的总RNA，以满足高通量测序的要求。该方案可用于研究这些生物膜系统中的基因表达情况。

引言

大多数慢性细菌感染，例如囊性纤维化（CF）患者中的肺部感染以及与假体相关的感染，其特征均为细菌在生物膜内生长。生物膜¹是指被主要由多糖组成的基质包裹的细菌群落²。生物膜内的细菌可能生长缓慢、代谢不活跃，并处于厌氧或缺氧环境中。由于抗生素渗透性降低、药物外排泵表达增加以及细胞分裂减少等因素，生物膜对抗生素具有更强的耐药性³。由于上述及其他原因，生物膜具有重要的研究价值。

为了准确研究囊性纤维化（CF）患者中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等持续性感染，体外实验必须真实反映生物膜形成过程中的生长条件。in vitro。一种常见且高通量的方法是在腔室载玻片或微孔板中培养细菌，并通过共聚焦显微镜监测生物膜的形成⁴。已知，细菌从浮游状态（自由漂浮）向生物膜生活方式转变的关键调控因子是第二信使环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）⁵。环二鸟苷酸水平的升高可增强特定基因的表达，从而促进生物膜的生长。小非编码调控RNA和群体感应也在生物膜形成的调控中发挥重要作用⁵。通过测序提取的细菌RNA来检测生物膜基因表达具有挑战性。例如，P. ae....

方案

采集和处理人类受试者的痰液样本需经研究伦理委员会（REB）批准。本研究已获得病童医院的批准（REB#1000019444）。采集和储存人类受试者的痰液样本必须获得研究伦理委员会（REB）的批准。这些研究已获得病童医院REB#1000058579的批准。

1. 生物膜形成

1. 培养 铜绿假单胞菌 从囊性纤维化（CF）患者痰液样本中分离的菌株，在Luria Broth（LB）琼脂平板上于37 °C培养获得 °C 培养箱中过夜培养。
   注意：正确的划线分离技术对于获得单个细菌菌落至关重要。在旋转培养皿的同时进行划线，可充分稀释细菌细胞，从而使其形成单个菌落。
   1. 使用接种环在新鲜LB平板的顶端以锯齿形模式划线接种细菌，直至大约 ¼ 平板的表面被覆盖。
   2. 将培养板旋转约60°取一个新的接种环，将其穿过划线区域并进入平板的第二个洁净区域，重复进行之字形划线。
   3. 用新的接种环在平板的第三个区域重复步骤 1.1.2。盖上盖子，并在放入培养箱时将平板倒置。
2. 使用无菌接种环从琼脂平板（含单一细菌菌株）上挑取单个细菌菌落，接种至装有5 mL无菌LB培养基的培养管中。每次使用新的接种环，从同一平板上再接种另外两管各含5 mL LB培养基的培养管。
3. 对不同的细菌菌株重复相同的接种程序。在37℃下....

结果

该方法的总体概述见图1。我们此前曾使用8孔腔载玻片培养P. aeruginosa生物膜，并在不同时间点通过共聚焦显微镜观察其经抗生素处理后的变化^12,13。本方法可用于直接从该系统中培养的生物膜提取总RNA，以研究处理后的基因表达变化。本方案已针对P. aeruginosa进行优化，但也可轻松适用于其他细菌种类。

从少量生物膜中提取足量且高质量的RNA用于rRNA去除和高通量测序具有挑战性。通过本方案，成功从17株不同的P. aeruginosa生物膜分离株中各取三份平行样本提取了总RNA，共计51个独立样本。提取RNA的产量高低情况如表1所示。RNA浓度范围为3.4 ng/µL（最低）至49.6 ng/µL（最高），平均浓度为14 ng/µL，中位数为13.7 ng/µL。当完整RNA浓度低于10 ng/µL时，被视为.......

讨论

已成功从17种不同的细菌生物膜样本中（每种三份）提取总RNA，共获得51个样本。将其中49个RNA文库混合后成功进行了测序。总体而言，尽管超过一半的样本被认为是丰度较低且质量次优，但该结果仍以96%的成功率验证了我们的质量标准^34,35,36,37。

意义
本RNA提取方案的独特之处在于，详细阐述了如何从在腔室载玻片中生长的少量生物膜中提取RNA。在8孔腔室载玻片中培养生物膜是一种有效的系统，可用于通过共聚焦显微镜研究外源添加因子对生物膜的影响，或微生物相互作用对生物膜形成的影响^12,13,42。为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	生物分子自动电泳仪
Agilent RNA 6000 pico试剂盒	Agilent	5067-1513	高灵敏度RNA电泳芯片，用于生成RIN值
DNA/RNA裂解缓冲液	Zymo Research	D7001-1-50	以硫氰酸胍和N-月桂酰肌氨酸为基础的裂解缓冲液，作为核酸纯化试剂盒的组成部分出售
DNA/RNA预处理缓冲液	Zymo Research	D7010-2-10	用于DNA和RNA纯化的盐酸胍和乙醇缓冲液
DNA/RNA保护剂	Zymo Research	R1100-50	DNA和RNA保存/保护试剂
DNA/RNA洗涤缓冲液	Zymo Research	D7010-3-6	用于DNA和RNA纯化的盐和乙醇缓冲液
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	高通量测序仪
MGIEasy RNA定向文库制备试剂盒	MGI	1000006386	从总RNA制备适用于MGI高通量测序平台的文库
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	高能量、高通量细胞破碎仪
NEBNext rRNA去除试剂盒（细菌）	New England Biolabs	E7850X	高效且特异性地去除细菌rRNA（5S、16S、23S）
Nunc Lab-Tek II腔室载玻片系统	Thermo Fisher Scientific	154534	8孔腔室载玻片，带可拆卸小室
Qubit荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33238	用于DNA、RNA和蛋白质的荧光定量仪
Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32852	高灵敏度荧光法定量RNA浓度
Spin-Away过滤柱	Zymo Research	C1006-50-F	基于二氧化硅的离心柱，主要用于结合或去除基因组DNA
无菌接种环，1 µL	Sarstedt	86.1567.050	无菌、一次性接种环，用于微生物操作
ZR BashingBead裂解管	Zymo Research	S6003-50	2 mL管，内含0.1 mm和0.5 mm珠粒裂解基质，用于均质化生物样本
Zymo Spin IIICG纯化柱	Zymo Research	C1006-50-G	基于二氧化硅的离心柱，用于DNA和RNA纯化
Zymo-Spin III-HRC过滤柱	Zymo Research	C1058-50	去除多酚类化合物、腐殖酸/富里酸、单宁、黑色素等抑制物
Zymobiomics DNA/RNA小量提取试剂盒	Zymo Research	R2002	DNA和RNA联合提取试剂盒
Zymobiomics HRC预处理溶液	Zymo Research	D4300-7-30	与Zymo-Spin III-HRC过滤柱配合使用，以去除PCR抑制物