优化离 体 视网膜电图的设置和条件，以研究小眼睛和大眼睛的视网膜功能
2022年6月27日
对现有多电极阵列或膜片钳设备的修改使 离体 视网膜电图更广泛地使用。记录和维持离体光反应的改进方法有助于研究健康视网膜、眼病动物模型和人类供 体 视网膜中的感光器和ON双极细胞功能。
该协议展示了在离体ERG中维持视网膜功能所需的条件，特别是由ON双极细胞产生的极其敏感的B波。使用离体ERG，我们可以以高信噪比测量不同类型的视网膜神经元的功能，同时允许轻松引入药物。该方法特别适合量化药物对视网膜功能和疾病的疗效。
首先，通过将离体ERG样品支架通过头级连接到差分放大器来转换多电极阵列设置。放大器必须插入多电极阵列系统接口板的模拟输入。使用多电极阵列的记录软件记录和存储来自离体ERG的输入数据。
将差分放大器的增益设置为100，并根据数字化仪规格增加额外的10倍电压放大。将低通滤波器设置为 100 赫兹。或者，要转换膜片钳设置，可通过上级将离体ERG样品支架连接到差分放大器，差分放大器必须连接到膜片钳放大器的头级。
使用膜片钳系统软件和数字化仪记录和存储来自离体ERG的输入数据。设置参数，如前所示。将具有适当波长的LED连接到显微镜。
要控制光刺激，请使用由数字化仪的模拟输出控制的LED驱动器。使用记录软件控制LED，该软件将触发光刺激。然后，使用光电二极管在标本支架中视网膜的位置校准LED的光输出。
如有必要，插入中性密度滤光片以调暗光路中的光强度。要准备电极，请将氯化银颗粒电极插入螺纹诱饵连接器中。用热胶填充诱饵连接器的内部，然后从无螺纹侧将一个两毫米的插座插入热胶中。
将 EP-1 电极的银线焊接到两毫米插座上。用螺纹上的O形圈将完成的电极拧入离体ERG样品支架的电极端口中。对于大眼睛，包括人类供体眼睛，清洁眼球中剩余的结缔组织并去除眼前段和晶状体。
使用手术刀从角膜缘切开约三毫米。将弯曲的解剖剪刀插入切口并沿着角膜缘切割，用晶状体去除眼睛的前部。获取视网膜标本进行离体视网膜电图检查，并用三到六毫米的一次性活检打孔。
要将组织安装在标本支架上，请将标本支架的下半部分放入一个大的培养皿中，并用含氧的 Ames'培养基填充它，使标本支架的圆顶刚刚被淹没。用细镊子小心地抓住视网膜的边缘，并将视网膜转移到离体标本支架的圆顶上，感光器面朝上。从艾姆斯溶液中取出标本支架，注意视网膜保持在原位。
完全干燥试样支架的板，以最大程度地减少噪声、电串扰和信号分流。然后用四个螺钉组装试样支架的两半并连接灌注管路。驱动样品支架下半部分的电极，并将阳极电缆连接到视网膜内侧，将阴极电缆连接到感光器侧。
每分钟至少用一毫升含氧的 Ames'培养基灌注标本支架 10 到 20 分钟，以使轻微反应稳定下来。离体ERG能够记录来自小鼠视网膜的感光器和ON双极细胞光反应。记录来自人类供体视网膜的光感受器反应是可能的，死后眼球摘除延迟长达5小时，ON双极细胞反应延迟不到20分钟。
在理想条件下，两种细胞类型的反应幅度和动力学随着时间的推移相对稳定，但在将视网膜安装在标本支架上40至45分钟后显示出缓慢下降。样品支架中的温度降低大大降低了光感受器和ON双极细胞的动力学。然而，它降低了B波的振幅，但没有降低A波的振幅。
相反，减慢灌注速率降低了光受体和ON双极细胞反应的振幅，但不影响A波或B波的隐含时间。停止灌注10分钟，然后再灌注导致ON双极细胞功能完全丧失，光感受器反应保留。足够的灌注速度和生理温度对于获得稳定的反应至关重要，特别是从离体ERG中的ON双极细胞。
该协议允许深入探索人类黄斑和外围光感受器功能的差异，回答以前只能在非人类灵长类动物中进行的问题。
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概述
本研究提出了一种增强离体视网膜电图（ERG）记录方法的协议，以研究视网膜神经元功能。该方法聚焦于ON-双极细胞和光感受器功能，使用各种设置，提供了对健康和疾病状态下药理学对视网膜影响的见解。
研究的关键组成部分
科学领域
- 电生理学
- 神经科学
- 视网膜生物学
背景
- 在离体环境中有效记录视网膜功能的挑战。
- ON-双极细胞和光感受器在视网膜健康和疾病中的重要性。
- 需要可靠的方法来量化药理学干预。
- 现有技术通常缺乏可及性和精确性。
研究目的
- 使用改进的设备改善视网膜光反应的记录。
- 促进光感受器和ON-双极细胞功能的分析。
- 评估视网膜细胞的药理学反应。
使用的方法
- 该协议采用离体ERG，使用多电极阵列或膜片钳系统。
- 小鼠视网膜和人类供体视网膜被用作生物模型。
- 每个设置包括关键的放大和过滤参数，以确保准确的记录。
- 强调实验过程中维持温度和灌流率的重要性。
- 使用光电二极管校准光输出对于受控刺激至关重要。
主要结果
- 增强的方法允许从光感受器和ON-双极细胞进行稳定的记录。
- 反应保持一致，在延长安装时间后观察到轻微下降。
- 温度和灌流速率显著影响反应幅度，特别是B波。
- 发现阐明了人类视网膜区域之间光感受器功能的差异。
结论
- 本研究展示了一种可靠的方法来探索视网膜神经元功能。
- 改进的可及性允许进行相关于视网膜健康的高级药理学研究。
- 这些发现增强了对神经元机制和视网膜疾病潜在干预的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
