自动化高通量细菌黏附宿主细胞检测

该方法可快速、高通量地检测细菌对宿主细胞的黏附。与传统的平板计数法相比，该方法减少了定量黏附细菌所需的人工操作时间。该技术具有自动化、节省时间且高度可重复的优点。

该方法也广泛适用于大多数宿主细胞。此方法操作十分简便，但在初次试验时，必须优化感染复数以及宿主细菌共孵育时间等条件。

首先，在指数生长期通过在室温下以13,000 × g离心两分钟收集细菌培养物。用一毫升PBS洗涤菌体沉淀后，将细菌沉淀重悬于一毫升PBS中。通过测定600纳米处的光密度来确定细菌悬液的浓度。

然后，为了染色细菌悬液，将两微升浓缩500倍的绿色或红色染色染料加入一毫升细菌悬液中，使染料稀释一倍。将细胞在室温下避光轻柔旋转孵育30分钟。30分钟后，在13,000 × g条件下离心染色后的细菌两分钟，并将沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。

通过在13,000 × g条件下离心两分钟收集染色的细菌细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜F12 K培养基中，并在600纳米处测定每种培养物的光密度。随后根据感染复数和宿主细胞浓度将培养物稀释至所需浓度。

进行细菌黏附实验时，加入100微升预温的PBS至每个孔中，轻轻吹打上下三次，洗涤先前培养的A549细胞单层。然后弃去PBS。或者，在加入PBS后静置10秒，再用真空泵吸除PBS。

为确定细菌结合动力学，将不同感染复数的所需浓度细菌悬液各100微升加入细胞中。离心使细菌沉淀，并将感染的A549细胞在37摄氏度及5%二氧化碳条件下继续孵育1小时。如图所示，用预热的PBS洗涤单层细胞5次，以去除未结合的细菌。

接下来，在冰上向96孔板的每个孔中加入100微升4%多聚甲醛固定细胞。15分钟后，用PBS洗涤3次以去除固定液。在室温下用50纳克/毫升的DAPI染色液对细胞核染色10分钟。

用 PBS 洗涤细胞后，向感染的 A549 细胞中加入 100 微升 PBS 以防止干燥，然后将培养板置于 4 摄氏度避光保存最多两天，或立即进行成像。为保证数据完整性，需在每个孔中随机手动选取五个位置，在 20 倍放大倍数下采集图像。在 GFP 通道下采集细菌的荧光图像，在 DAPI 通道下采集 A549 细胞图像，对于经红色荧光染料标记的细菌，使用 PE Si5 通道。

根据物镜设置用于平滑处理的滚珠半径参数，并自动测量图像去卷积的点扩散函数，以获得更佳的分辨率。测量宿主细胞和细菌的荧光强度。将宿主细胞和细菌中最弱的荧光强度设为细胞计数的阈值，并将距离宿主细胞15微米范围内的所有邻近细菌计为黏附细菌。

在对所有自动拍摄的图像中的细胞进行计数后，分析关键的读数指标，例如宿主细胞数量、细胞大小和形态、细菌总数，以及每个宿主细胞的平均细菌数，后者是判断细菌黏附能力的最重要指标。在共孵育一小时后，铜绿假单胞菌PAO1菌株以剂量依赖的方式黏附于A549细胞。当使用革兰氏阳性菌单核细胞增生李斯特菌及其阴性对照枯草芽孢杆菌时，也观察到类似的结果。

宿主细胞黏附的铜绿假单胞菌分割代表性图像展示了使用本方案计数细菌细胞的便捷性。自动分析结果包括细菌和宿主细胞数量、每个宿主细胞的平均细菌数量，以及反映宿主细胞健康状况、细菌黏附水平和细菌细胞毒性的宿主细胞大小和面积。除A549细胞外，还对HUVECs进行了黏附实验检测。

粘质沙雷氏菌（Serratia rubidaea）和无乳链球菌（streptococcus agalactiae）可黏附于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），但不能黏附于A549细胞，这表明该方法在检测多种宿主细胞与细菌相互作用方面具有有效性和适用性。为尽量减少细菌非特异性黏附至孔板底部，宿主细胞应生长至约90%至100%汇合度。该技术将使研究人员能够探索宿主与病原体相互作用的新机制。