Name: 用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本的手动印迹和切入式冷冻 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习手动印迹和切入式冷冻技术，用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本制备。该方法经济可靠，可在受控环境中实现高质量冷冻样品制备，适用于神经科学和结构生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Herzik实验室成员对本文稿及视频内容进行的深入思考和反馈。M.A.H.Jr. 的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）R35 GM138206项目资助，并获得Searle学者项目支持。H.P.M.N. 受分子生物物理学培训项目（NIH T32 GM008326）资助。我们还要感谢斯克里普斯研究所的Bill Anderson、Charles Bowman以及Gabriel Lander博士在视频中所示手动冲压器的设计、组装和测试过程中提供的帮助。

1. 准备手动冷冻环境
注意：预计操作时间：5-30 分钟
<ol>
	<li>在4 &#176;C 冷室，其中可放置加湿器以维持接近 100% 相对湿度（RH）的环境（图1A). 
	警告：请查阅所在机构的环境健康与安全指南，以确定手动冷冻装置的安全使用位置及推荐操作规程。</li>
	<li>在制备载网前，开启冷室内的加湿器，确保冷室的相对湿度 ≥ 95 %。 
	注意：在低湿度条件下制备载网可能导致薄膜脱水、缓冲液成分因蒸发而改变，以及载网间重复性的降低46不建议将载网冷冻在 &#60;80 % RH</li>
	<li>确保冷室的温度为 4 &#176;C.</li>
	<li>将手动冲压装置放置在远离强气流的位置（例如远离空调出风口），因为强气流可能导致载网附近产生湍流和/或在冷表面形成明显的冰层积累。</li>
</ol>
2. 准备冷冻载样材料和配件
注意：预计操作时间：1-5 分钟
<ol>
	<li>使用干净的剪刀将滤纸剪成宽1-1.5 cm、长约9 cm的条状。避免触碰滤纸中心区域，并丢弃较小的边角料。务必确保滤纸条干燥、洁净且无污染物。将滤纸条分开后放入一个100 mm的培养皿中。</li>
	<li>将一块22×22 mm的方形玻璃盖玻片放入另一个60 mm的玻璃培养皿中。此装有盖玻片的玻璃培养皿将用于储存、转移和辉光放电处理载网。 
	注意：建议使用压缩空气除尘罐清除载片表面可见的碎屑。也可使用防静电枪去除积聚的静电。</li>
	<li>组装并标记载网储存盒。</li>
	<li>准备4至6把洁净干燥的夹持镊子，并将其放置于手动冷冻装置附近。在冷冻前目视检查每把镊子，确保其无损坏且无污染物。</li>
</ol>
3. 准备冷冻剂杜瓦瓶和手动冲压装置
注意：预计操作时间：5-15 分钟
<ol>
	<li>将平台底座安装在冷冻浸入式杜瓦瓶的底部。将乙烷容器杜瓦瓶置于平台底座上方，放入黄铜乙烷容器，然后安装旋转式载网储存平台。
	<ol>
		<li>向浸入式杜瓦瓶中加入液氮（LN2）后，平台底座的高度将无法再进行调节。请确保载网底座已正确安装并保持水平，以避免因冷冻夹持器高度不当而导致载网和/或镊子损坏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冷冻前，检查手动夹持器及所有辅助设备，确保其正常工作，以减少样品和/或载网的损失。</li>
	<li>每次冷冻操作前，更换手动夹持臂上用于固定镊子的胶带。实验室内高湿度环境可能使胶带粘性下降，降低其固定镊子的能力，从而增加镊子损坏和/或载网丢失的风险。</li>
	<li>调节靠近手动夹持器的灯具，确保有足够光线以观察样品的毛细吸液过程，并便于清晰观察载网转移过程，防止载网损坏和/或丢失（参见步骤3.7）。使用位于夹持器正后方的环形灯以观察液体流动情况，并在杜瓦瓶附近使用带柔性臂的任务灯照亮已冷冻的载网。</li>
	<li>调节脚踏板张力，确保浸入臂在抬起位置时能牢固固定，并在踩下脚踏板时完全释放。在加样前进行数次“空载”测试，以确认夹持器工作正常。 
	注意：脚踏板张力调节不当会导致浸入臂过早释放（即张力设置过低），造成载网丢失；或导致载网未能完全浸入乙烷容器中（即张力设置过高）。</li>
	<li>将浸入式杜瓦瓶放置在手动夹持器底部正下方的夹持臂下方，并将其固定。使用附带的胶带将一对镊子固定在夹持臂上。在握住手动夹持臂的同时，踩下脚踏板，小心地降低浸入臂，并调节其行程，确保载网能准确进入乙烷容器的中部位置。</li>
	<li>利用浸入臂顶部的限位块来确定脚踏板完全踩下时浸入臂的最终位置（图1B）。调节浸入臂上限位块的高度，以调整载网在乙烷容器中的位置（图1C）。 
	注意：浸入臂高度设置不当可能导致载网和/或镊子损坏（例如浸入臂高度设置过低），或导致玻璃化效果不佳（例如浸入臂高度设置过高）。</li>
	<li>将杜瓦瓶置于低温室外部，随后进行液态乙烷的制备（步骤4）。</li>
</ol>
4. 准备冷冻剂
注意：预计操作时间：10-30 分钟
<ol>
	<li>检查乙烷罐、减压阀、管路和乙烷 dispensing 尖端是否有任何损坏迹象。如发现损坏，必须立即报告并修复后方可继续操作。 
	警告：压缩乙烷及乙烷:丙烷混合气体具有可燃性，若操作或处理不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。如不确定如何操作或处理压缩气体钢瓶，请咨询专业人员。处理可燃性压缩气体时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。此外，液化乙烷是一种强效冷冻剂，若处理不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。处理冷冻剂时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。</li>
	<li>获取足量液氮2 在适量的液氮中2 液氮杜瓦瓶（例如，用于载网制备和储存时，3-4 L 为常规容量）。 
	警告：液氮（LN₂）2 是一种冷冻剂，若操作不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。
	<ol>
		<li>确保使用所有个人防护装备，以最大限度地降低受伤风险。液氮（LN₂）的蒸气2 是一种窒息性气体，应在通风良好的区域操作。如果不确定如何操作或处理低温容器和低温液体，请咨询专家。处理低温液体时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。在冷室中无法使用液氮的情况下，建议在低温且通风良好的环境中进行 plunge freezing（浸入式冷冻）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冷室外，通过倒入液氮来预冷冷冻铜杯2 直接注入铜制乙烷容器中，直至液氮液面达到乙烷容器顶部（即平台略上方）。补充液氮至满2 根据需要在乙烷容器外部操作。当液氮（LN）2 停止剧烈冒泡（约5分钟）。
	<ol>
		<li>加入液氮2 直接将液氮导入铜制乙烷容器，以在冷凝乙烷气体前充分冷却该容器。若未能充分冷却铜制乙烷容器，将显著延长乙烷冷凝所需时间。</li>
		<li>一旦杜瓦瓶达到液氮（LN₂）2 温度，避免过满填充液氮罐，以免液氮溢出2 溢入乙烷容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙烷以压缩气体形式提供，使用前需液化。乙烷气罐需配备高纯度双级减压阀以控制气体流量。将管路连接至减压阀出口阀，并在末端连接一个14号规格的扁平金属 dispensing tip 用于释放乙烷。</li>
	<li>打开乙烷主气罐阀门之前，确保压力调节旋钮和出口阀门均已完全关闭。完全打开主气罐阀门，然后将出口阀门打开至约50%。缓慢旋转压力调节旋钮，直至观察到气体缓慢流出。使用出口阀门精细调节气体流量。 
	警告：打开阀门或调节气体流量时，务必使金属分配尖端朝向远离自身的方向。</li>
	<li>缓慢开启气体流，将乙烷气体管路的尖端插入盛有去离子水的小烧杯中，以此评估气体流速。调节气体流速，直至达到所需的流速 适度地 扰动水体。
	<ol>
		<li>调节气体流速以确保乙烷适当冷凝——流速过慢会导致乙烷气体在 dispensing tip 处固化，流速过快则会引起剧烈冒泡并阻碍冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将乙烷气体管路的尖端插入黄铜乙烷容器之前，使用精密擦拭纸清洁并擦干 dispensing tip，以去除任何水分。</li>
	<li>以平稳而迅速的动作，将气体释放管口置于黄铜乙烷容器底部，开始让释放管口在乙烷容器底部缓慢地做环形移动。固态乙烷会立即形成，但随着更多乙烷气体的加入或冷凝，将迅速液化。
	<ol>
		<li>继续在乙烷容器底部移动金属乙烷输送尖端，以使固态乙烷液化。将乙烷容器填充至 &#190; 充满液态乙烷（液面距顶部2-3圈螺纹处）。通过小心地将金属乙烷分配尖端从黄铜乙烷容器中取出，并关闭出口阀门，以停止乙烷气体流动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用液氮加满冷冻样品杯2&#160;从液氮罐侧壁轻轻倾倒，以避免液氮（LN）飞溅2 除了黄铜乙烷容器外，继续添加液氮，直至液面刚好接触黄铜乙烷容器。将泡沫盖置于冷冻浸入式杜瓦瓶上，以促进乙烷固化。
	<ol>
		<li>LN2 必须直接接触黄铜乙烷容器，以促进乙烷的固化。大约5分钟后，黄铜容器内的乙烷将完全冻结成固体。添加更多液氮2 直到其刚好接触乙烷容器，然后进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果乙烷未完全冻结成固体，则表明黄铜乙烷容器的温度不足以进行后续步骤。需添加更多液氮（LN₂）2 直到其刚刚接触乙烷容器，再等待5分钟。确保黄铜容器内的乙烷完全冻结成固体。</li>
	<li>打开气体出口阀，使乙烷气体流速与步骤4.6中确定的流速相近。将金属乙烷 dispensing tip 垂直插入固体乙烷中，并持续以环形运动移动乙烷 dispensing tip，以熔化固体乙烷。
	<ol>
		<li>继续加入乙烷，直至其液面与黄铜乙烷容器顶部齐平。缓慢将移液枪尖端从乙烷容器中取出，并关闭乙烷气罐出口阀门。用盖子盖住杜瓦瓶，静置约1至4分钟，使乙烷在黄铜乙烷容器边缘周围固化。 
		注意：理想的乙烷容器在黄铜乙烷容器边缘应具有2–3 mm均匀的固态乙烷环，中心区域为液态乙烷图1D 和 图2).</li>
		<li>确保乙烷处于尽可能低的温度，但不得凝固，以保证生物样本的充分玻璃化。若未能正确制备液态乙烷，可能导致样本玻璃化不充分、冰晶积累和/或样本丢失，进而影响成像样本的质量。</li>
		<li>如果在2-3分钟后仍未形成完整的乙烷环，则添加更多液氮2 转移到杜瓦瓶中，并覆盖保存2-5分钟。</li>
		<li>如果乙烷凝固过快，可使用一把干净的大型镊子轻轻加热乙烷容器和/或固体乙烷，以防止乙烷完全固化。待乙烷与液氮2 保持稳定后，关闭所有乙烷罐阀门，并将冷冻用杜瓦瓶移至手动冲压装置处。将冷冻用杜瓦瓶牢固固定在手动冲压装置上。 
		警告：转移液氮罐时需格外小心，因为液氮（LN2 可能会溢入乙烷容器并使液态乙烷凝固。如有需要，可使用一套干净的镊子熔化容器中部的固态乙烷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一对空镊子测试乙烷杜瓦瓶的位置，确保镊子尖端位于乙烷容器的中心，并且在液态乙烷内部，载网和镊子尖端有足够的空间（图1D).
	<ol>
		<li>如果固态乙烷环过厚而不便于网格操作，则使用一对室温的洁净镊子熔化固态乙烷，以在乙烷容器中心创造更大的冷冻区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 准备电镜载网
注意：预计操作时间：1-5 分钟
<ol>
	<li>将网格存储盒添加至杜瓦瓶中，拧开网格存储盒的盖子，并确保每个盖子能够自由旋转至新的网格槽位。</li>
	<li>小心地将网格从网格存储盒转移至方形玻璃盖玻片边缘，使约30–40%的网格悬于载玻片边缘之外。确保网格的支撑膜面朝上。不使用时应始终将网格盖好。将网格置于方形玻璃盖玻片边缘有助于操作，并减少转移过程中弯曲或损坏网格的风险。 
	注意：通常一次准备4–6个网格。</li>
	<li>使用辉光放电器或等离子清洗仪使网格具有亲水性。 
	注意：请参考辉光放电器/等离子清洗仪制造商提供的网格清洗推荐指南。
	<ol>
		<li>等离子清洗后应在10分钟内使用网格，因为超过此时间后网格会逐渐失去亲水性，且网格间的重复性将下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 通过冷冻固定制备冷冻电镜样品
注意：预计操作时间：>10 分钟（每张载网约 1–3 分钟）
<ol>
	<li>使用干净且干燥的夹持镊子夹取一块已清洁的载网，将塑料夹具向下滑动以固定载网，并轻轻敲击镊子，确保载网已牢固固定。
	<ol>
		<li>操作载网时应仅接触其外圈，以避免损坏载网的金属箔层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 1 至 5 µL 样品滴加到载网的制备面（例如正面或金属箔面）上。 
	注意：最佳加样体积和 blotting 时间取决于具体样品，需针对每种样品进行优化；体积较大或黏度较高的样品需要更长的 blotting 时间。</li>
	<li>用胶带缠绕镊子手柄，将镊子-载网-样品组件固定在手动 plunge 装置的臂上。
	<ol>
		<li>进行传统正面 blotting 时，应使样品面朝向操作者；若需进行背面 blotting，则应使样品面背向操作者。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用双手的拇指和食指分别夹住一块干净、干燥并裁剪好的 blotting 纸。
	<ol>
		<li>仅可从 blotting 纸边缘处操作，切勿触碰其中心区域，以免手部或手套上的油脂及其他污染物影响载网质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将双手 resting 在 plunge 用杜瓦瓶边缘，以建立稳定的操作位置。将 blotting 纸平行放置于载网表面附近，距离约 1 cm。
	<ol>
		<li>使用 blotting 纸的中部区域，以确保液体在载网表面具有充分的流动性，并实现均匀的吸液效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻滑动并旋转双侧的拇指与无名指向彼此靠近，使 blotting 纸向载网方向弯曲，从而开始 blotting 操作。在整个 blotting 过程中，保持 blotting 纸与载网表面的接触。
	<ol>
		<li>确保 blotting 纸直接接触载网表面，并在整个载网表面维持一致的接触。</li>
		<li>轻微弯曲 blotting 纸可减少载网的弯曲或表面损伤，并在载网上形成更均匀的冰层（图 3A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察液体前沿的移动情况，当其停止向 blotting 纸内扩散时，开始计时 4 至 6 秒。 
	注意：计时可在 blotting 纸接触载网表面时开始，但可能导致载网间重复性降低。总 blotting 时间取决于载网类型、金属箔类型、样品浓度及样品性质（例如可溶性蛋白、膜蛋白或纤维状蛋白）。对于黏度较高的样品，需要更长的 blotting 时间（例如 5 至 7 秒）。
	<ol>
		<li>重要提示：建立一种可靠且一致的计时方法，可显著提高冷冻过程的重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将左右手的拇指与食指向相反方向移动，以“弹开”的动作迅速将 blotting 纸从载网表面移开。立即踩下脚踏开关，释放 plunge 臂，使载网迅速浸入液态乙烷中。
	<ol>
		<li>应尽可能同时完成移除 blotting 纸和踩下脚踏开关的操作，以获得最佳冷冻效果。从移除 blotting 纸到 plunge 之间的延迟越长，薄膜蒸发越多，载网间的重复性越差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一只手稳定夹持镊子，小心地将缠绕在镊子和手动 plunge 装置臂上的胶带解开。
	<ol>
		<li>操作过程中应始终与镊子保持接触，防止镊子-载网组件移动，避免因载网碰撞固态乙烷而导致损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当夹持镊子从手动 plunge 装置臂上完全释放后，用一只手将镊子 resting 在 plunge 用杜瓦瓶顶部，确保载网仍处于液态乙烷中。小心地将塑料夹具从载网处滑开，以便转移载网。持续对镊子施加压力以固定载网。
	<ol>
		<li>以一个快速连贯的动作，迅速将载网从乙烷容器转移至液氮（LN2）储存罐中。小心地将载网放入载网储存盒内。 
		注意：部分乙烷可能在载网表面凝固。略微张开镊子可破碎乙烷，使载网顺利落入储存盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用一块精细擦拭纸包裹镊子尖端，防止结霜。将镊子放置一旁，直至其恢复至室温。
	<ol>
		<li>建议准备 4 至 6 把镊子以方便使用。每把镊子用于一次样品冷冻后需待其回温，方可再次使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每一块载网重复步骤 6.1–6.11。</li>
	<li>完成所有冷冻操作后，牢固关闭载网盒，并将其转移至适当的储存位置。</li>
	<li>小心处理废弃的液态乙烷和液氮（LN2），并将所有材料存放于干燥处。</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

用于单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）成像的生物样品玻璃化冷冻，仍是成功进行结构解析的关键步骤。本方案所述的手动 blot-and-plunge 方法是一种经济、可靠且稳健的技术，可快速将生物样品冷冻在适于 cryoEM 成像的薄层玻璃态冰中。通过本文稿所述方法，研究人员将能够组装和操作手动冷冻装置，制备适用于生物样品快速冷冻的冷冻剂，并手动对载有生物样品的电镜载网进行 blot-and-plunge 操作。尽管该方法具有较强的稳健性，但在关键步骤中仍需谨慎操作，以获得适用于高分辨率成像的最佳冰层厚度和质量。下文列出了若干关键步骤，并提供了相应的故障排除建议。
必须正确放置手动冲压臂，以确保在冲入后载网位于黄铜容器内液态乙烷的中心位置。若冲压臂的高度或位置不当，或未正确固定镊子，均可能导致夹紧镊子、电镜载网甚至手动冲压装置的损坏。如上所述，我们在制备生物样品前总会至少进行一次试运行，以确认成功冲入后电镜载网能够准确位于黄铜乙烷容器的中心（图1C）。此外，每次载网冷冻后，我们还会对冲压杜瓦瓶的位置进行微调，以优化载网在乙烷...

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种强大的结构生物学技术，可用于解析动态生物样品的近原子分辨率结构1,2,3,4。事实上，近年来直接电子探测器技术4,5,6,7,8,9,10、电子源性能的提升4,11,12,13,14以及电磁透镜稳定性的改进15，结合数据采集16,17和分析软件包的持续发展18,19，使得研究人员如今能够常规地以3 Å或更高的分辨率解析性质良好的样品结构4,11,13,14,20,21,22,23。尽管成像和数据处理能力已显著提升，冷冻电镜载网制备仍是实现高分辨率结构解析的最大障碍，常常成为电镜工作流程中的主要瓶颈24,25,26,27。
冷冻电镜（CryoEM）依赖于对生物样品在水溶液中成像，这些样品被快速冷冻形成一层薄的&#34;玻璃态&#34;冰——这一过程称为玻璃化，可保持生物分子的天然生化状态。用于冷冻电镜的生物样品玻璃化技术已有40多年历史28,29,30，许多为此开发的技术和设备均基于最初详述的“ blot-and-plunge”（吸滤-投入）法31,32,33,34,35，即先将少量样品（例如1–5 µL）施加到专用的电镜载网，再通过载网与滤纸的物理接触去除多余液体。该过程的时间通常需针对每种样品经验性地确定，因为冷冻样品的关键因素之一是玻璃态冰层的厚度：若冰层过厚，电子束散射增加将显著降低成像质量；而冰层过薄则可能限制蛋白质的取向，和/或使颗粒无法进入载网微孔的中心区域36。单颗粒冷冻电镜对理想冰层厚度的依赖，催生了多种可用于冷冻样品的技术与设备，包括机器人系统37,38、微流控技术42以及超声或喷雾装置27,39,40,41,42,43,44。近年来，一些最受欢迎的样品制备设备依赖于机器人系统，通过自动化的 blot-and-plunge 技术实现样品冷冻45。尽管这些设备旨在可重复地生成适合成像的冰层厚度，但其价格通常过高，单个实验室难以负担购买与运行成本，因此一般仅在冷冻电镜平台中以小时计费的方式提供使用。近年来，原始的手动 blot-and-plunge 技术重新受到更广泛的关注与应用3,47,48,49,50,51,52。事实上，手动操作的 blot-and-plunge 装置能够以远低于机器人设备的成本制备出高质量的冷冻电镜载网。&#160;此外，手动吸滤还为使用者提供了更高的操作控制灵活性，研究人员可根据不同样品和具体研究问题，调整吸滤方式（例如载网背面吸滤、正面吸滤等）以及吸滤时间。
本文详细介绍了如何使用传统的手动 blot-and-plunge 玻璃化冷冻装置，并结合定制设计的杜瓦平台，高效冷冻生物样品53。文中提供了最佳操作实践，包括冷冻剂的准备、载网操作、样品施加与 blotting 步骤，以及常见问题和克服这些困难的建议。同时讨论了如何提高不同载网制备之间冰层厚度的可重复性，以及如何根据生物样品类型调整样品 blotting 方法。由于本文所述手动冷冻装置在采购和运行上的成本较低，全球各地的实验室均能以经济高效且可重复的方式为冷冻电镜（cryoEM）制备生物样品。

<table><tbody><tr><td>4 槽网格储存盒</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 号平头金属移液头</td><td>Amazon</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm 方形玻璃盖玻片</td><td>Sigma</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>用于储存网格的 60 mm 玻璃培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>用于储存 Whatman 滤纸的 100 mm 玻璃培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>用于储存 Whatman 滤纸的 150 mm 玻璃培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 烧杯</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>蓝色泡沫聚苯乙烯杜瓦瓶</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>黄铜乙烷容器</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>夹持镊子</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>带控制阀的双级调节器</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>杜瓦瓶网格底座</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙烷平台</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙烷丙烷气罐</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>高压气罐中含乙烷（50%）: 丙烷（50%）</td></tr><tr><td>乙烷气罐</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>乙烷（100%）</td></tr><tr><td>带柔性臂的工作台灯</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>网格（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 目）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>加湿器</td><td>Target</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>湿度计</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>实验服</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮杜瓦瓶</td><td>Worthington</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>液氮手套</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>手动冲压装置支架（黑色支架 + 脚踏板）</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5（浸入式平台）</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Eppendorf</td><td>E0030124286</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>ibis scientific</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>环形灯</td><td>Amazon</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>护目镜</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Amazon</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀</td><td>Ironside</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Fisher</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>用于转移网格盒的镊子</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 软管</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 吸水滤纸</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

利用电子对生物样品进行成像，以通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）实现高分辨率结构解析，需要将目标生物分子包埋在一层薄薄的玻璃态冰中。尽管近年来多项技术进步已推动单颗粒cryoEM成为结构生物学的前沿手段，但样品玻璃化制备方法往往仍是实现高分辨率成像的限速步骤。尽管近期已有大量研究致力于克服样品玻璃化过程中常遇到的困难，包括开发新型样品支撑膜和创新的玻璃化设备，但由于成本低廉且操作简便，传统的手动操作冷冻装置在cryoEM领域仍被广泛使用。本文提供了使用标准剪刀式手动 blot-and-plunge 装置制备适用于单颗粒cryoEM高分辨率成像的生物样品的详细方法。此外，还描述了常见问题及当标准制备方法未能获得合适样品时的故障排查建议。

成功执行此处所述的 blot-and-plunge 操作方案后，将形成一层薄而均匀的玻璃态冰，无任何六方冰、污染物以及不可用冰的大范围梯度，这些特征可在电子显微镜下观察到（图3）。若 blotting 纸与载网表面接触不一致、过早移除 blotting 纸，或在与载网接触过程中移动 blotting 纸，均会降低玻璃态冰的质量，并导致电镜载网上冰层厚度不均（图4）
<img alt="冷冻电子显微镜设备装置，包括冷冻浸入装置、湿度计和镊子。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62765/62765fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：样品浸入室及所需设备。A） 本文所...

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。

使用电子对生物样本进行成像，以通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）实现高分辨率结构解析，需要……

本文所述的手动冲压法是一种经济高效且可靠的透射电子显微镜样品制备方法。在本视频中，我们将演示如何设置手动冲压装置、制备冷冻剂，以及对电镜载网进行手动 blotting 和冲压操作。请先准备手动冲压的实验环境。该操作应在温度维持在40摄氏度、湿度高于95%的低温室中进行。我们建议使用此处所示材料以及在线方案中所述的手动印迹和浸入材料。准备冷冻剂杜瓦瓶和手动浸入装置。组装冷冻剂杜瓦瓶时，首先将平台底座安装在蓝色泡沫聚苯乙烯杜瓦瓶底部，确保其平整且水平。然后将乙烷容器架放置在平台底座上方，并插入黄铜乙烷容器。最后放置旋转网格储存平台。接着，将浸入式杜瓦瓶固定在手动浸入装置的底座上。将乙烷容器置于下冲臂正下方并固定下冲杜瓦瓶到底座上。设置手动下冲高度时，首先在下冲臂底部贴上新的胶带。接着，用胶带将一对夹持镊子牢固地缠绕固定在下冲臂和镊子底座上。轻敲镊子以确保其牢固固定。握住推进臂，踩下脚踏板，缓慢将镊子浸入黄铜乙烷容器中。调整浸入式杜瓦瓶的位置，使镊子准确位于黄铜乙烷容器的中央。镊子的尖端不应接触黄铜乙烷容器的侧面或底部，以免损坏镊子和手动柱塞。位置设定后，重置手动冲压臂。准备冷冻剂。冷冻剂的制备应在通风良好的房间内进行，并始终佩戴适当的个人防护装备。开始时，将液氮直接倒入浸入式杜瓦瓶中，当液氮液面达到黄铜乙烷容器顶部时停止倾倒。待液氮剧烈沸腾停止后，系统已足够冷却，可继续后续操作。此过程大约需要五分钟。乙烷以压缩气体形式提供，需要进行冷凝。为了设置最佳乙烷冷凝的气体流速，将乙烷气体管路的末端插入盛有250 mL水的烧杯中，并观察气泡情况。气体流速应产生稳定的气泡流，且不会剧烈扰动水面。开始冷凝乙烷时，将乙烷气体导管的尖端置于黄铜乙烷容器的底部。缓慢搅动金属尖端，开始使乙烷液化。一旦乙烷开始冷却，便会发出可听见的声音。将黄铜制的乙烷容器装至其容量的四分之三满的液态乙烷。向浸入式杜瓦瓶中加满液氮，确保液氮接触到黄铜制的乙烷容器，但不会溅入其中。加入液氮对于实现乙烷均匀冷冻至关重要。将泡沫盖置于蓝色浸入式杜瓦瓶上，使乙烷完全固化。重新启动乙烷气体流，并小心地将气体管路的尖端插入固态乙烷中。务必将金属尖端垂直放入容器中，并在容器底部释放乙烷。缓慢搅拌金属尖端，使乙烷熔化，并使液态乙烷液面上升至容器顶部。盖上盖子约一分钟，使乙烷在黄铜容器边缘逐渐凝固，直至观察到2至3毫米厚的固体乙烷。此时乙烷的温度已非常适合冷冻生物样品。将浸入式杜瓦瓶小心地安装到手动 plunger 的底座上。用胶带将夹持镊子牢固地缠绕在浸入臂和镊子底座上，以固定镊子。握住冲压臂，通过踩下脚踏板缓慢将镊子浸入液态乙烷中。调整冲压杜瓦瓶的位置，使镊子位于液态乙烷的中部，避免接触固态乙烷环。准备冲压材料和配件。通过将每张圆形滤纸剪成约一厘米宽的条状来准备印迹纸。避免触碰印迹纸的中心部位，并丢弃较小的端部碎片。重要的是确保印迹纸条干燥、清洁且无污染物。在投入之前，将网格盒放入冷冻杜瓦瓶的相应插槽中。确保网格盖可以自由旋转。通过投入冷冻法制备冷冻电镜样品。由于载网种类及载网制备方法的多样性，请遵循推荐方案使载网具有亲水性。为正确操作载网，应使用洁净干燥的夹持镊子夹取亲水载网的外圈。滑动塑料夹具以固定载网，并轻轻敲击镊子，确保载网被妥善夹紧。用夹持镊子夹住载网，在其正面滴加三微升样品。将胶带缠绕在镊子底部，将镊子牢固地固定在手动浸入臂上。样品现已准备好进行滤纸吸除并速冻浸入。用双手的食指和拇指分别捏住一条洁净的滤纸条两端。将双手放在浸入式液氮杜瓦瓶的边缘以保持稳定。滤纸条应距离载网表面约一厘米。将滤纸弯曲，直至其中心接触载网。确保滤纸与载网表面平行，以实现均匀接触并防止载网受损。当移动的液面前沿停止扩散时，开始计时。用吸水纸吸去网格上的液体，持续五秒钟。迅速分开手指，拉紧吸水纸并快速将其从网格表面移开。同时，踩下脚踏板以释放手动 plunging 装置，使夹持网格的镊子迅速浸入液态乙烷中。保持新鲜冷冻的载网处于液态乙烷中，小心地将镊子从手动 plunging 装置上取下。小心松开镊子，使载网可以被取出。迅速地将载网从乙烷中一次性移动至黄铜乙烷容器下方的液氮储存罐中。将载网放入载网盒中。代表性结果。通过本视频，研究人员应能够制备出如图所示的冷冻电镜载网，其上多个方格中含有适合高分辨率成像的薄层玻璃态冰。可通过调整样品浓度和滤纸吸附时间来优化颗粒密度。在此，我们将演示使用滤纸吸附-快速冷冻法冷冻 CryoEM 样品的完整流程。使用洁净的夹持镊子夹取一张新的载网，并将载网固定到位。将3微升样品加到载网的亲水面，并用胶带缠绕镊子手柄，将其固定在手动 plunge 装置的臂上。将滤纸与载网表面平行放置，并轻轻将滤纸弯向载网以开始吸滤。在所需时间后，迅速将滤纸从载网表面移开，同时踩下脚踏开关释放 plunge 臂，使载网迅速浸入液态乙烷中。小心地将胶带从镊子和手动 plunging 臂上解开。迅速而果断地将网格从乙烷容器转移至液氮储存罐中。将网格放入网格储存盒内，并用 Kim Wipe 包裹镊子以使其干燥；重复上述步骤。

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本的手动印迹和切入式冷冻

本文展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术（ECT）在接近天然的状态下研究细菌细胞的超微结构，分辨率可达“大分子”级别（约4...

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

我们描述了一种在电子显微照片中定位荧光标记蛋白的方法。首先在超薄切片上利用光激活定位显微镜对荧光信号进行定位，然后将这些图像与同一切片的电子显微照片进行配准对齐。...

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

冷冻电子显微镜，包括扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），广泛用于含水量较高的生物样品或其他材料的表征1。利用扫描电镜/聚焦离子束（FIB）可识别样品中感兴趣的结构特征，并切割出一片薄而电子束可穿透的薄片，用于转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。...

利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。...

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

本文介绍了一种用于制备纳升级样品体积以进行透射电子显微镜观察的仪器及方法。该方法无需滤纸吸 blotting...

用于透射电子显微镜的微型化样品制备

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis...

高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

本文展示了如何使用三明治式冷冻装置对生物样本（包括细菌、酵母、培养细胞、分离细胞、动物和人体组织以及病毒）进行快速冷冻，同时还展示了快速冷冻后制备样本以进行超薄切片的方法。...

利用夹心式冷冻装置进行快速冷冻以实现电子显微镜中生物样本良好超微结构保存

本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。...

用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备

剥离印迹技术：一种用于从多层或高浓度生物样品中分离单层结构的冷冻电镜样品制备方法

本文介绍了一种将单层石墨烯应用于透射电镜载网的方案，以及如何制备这些载网以用于冷冻电镜结构解析。...

用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯包被载网的制备

学习手动印迹和切入式冷冻技术，用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本制备。该方法经济可靠，可在受控环境中实现高质量冷冻样品制备，适用于神经科学和结构生物学研究。

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

探索更多视频