Name: 一种简单有效的斑马鱼胚胎移植装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学习使用低成本移植装置在斑马鱼胚胎中进行细胞移植，研究胚胎发育过程中的信号分子功能。该方法可高效生成生殖系突变体，适用于囊胚期斑马鱼和青鳉胚胎。

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本项目由马克斯·普朗克学会资助，并获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资金支持（资助协议编号 No. 637840（QUANTPATTERN）和资助协议编号 No. 863952（ACE-OF-SPACE））。

1. 移植装置的组装与使用
<ol>
	<li>组装移植装置。
	<ol>
		<li>将带有鲁尔接头的25 µL气密式注射器与带有鲁尔锁扣配件的微量移液器架连接，组装成移植装置（图1A). 
		注意：用一层薄水膜润湿鲁尔接头尖端，可通过水的粘附力和内聚力使部件更紧密连接，从而增强连接效果。</li>
		<li>将装置直接安装到手动显微操作器上（图1B该设备可仅用主手操作，从而解放另一只手以执行其他任务。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备移植针。
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪拉制无纤维的玻璃毛细管移液器，制备移植针。</li>
		<li>尽可能平滑地折断针尖，因为锋利的边缘在移植过程中会增加划伤卵黄的风险，而这对胚胎是致命的。 
		注意：在体视显微镜下，使用直边剃须刀片可轻易折断针尖。然而，使用显微拉针仪可精确制备出所需尺寸的开口。对于异位来源的生成，针尖外径约为50–60 µm较为合适。对于组织切除和生殖系移植，针尖外径应约为80–90 µm，以增加移植细胞的数量。</li>
		<li>将即用型针头插入移植装置中（图1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移植装置。
	<ol>
		<li>将配备移植装置的显微操作仪置于体视显微镜旁图 1B).</li>
		<li>取出针芯，将移植针以45°角插入盛有任氏液的移植培养皿中（见步骤2.2.1），直至针尖浸入液面下图1B）。由于毛细作用，水会迅速沿针管上升。</li>
		<li>将活塞插入约一半深度，以排出林格氏液，仅在针头细小的锥形部分留下少量水图1C). 
		注意：此为中性位置，水位应在此处保持稳定一段时间（&#62;20 分钟）。如果水位不稳定，说明有空气泄漏；需重新连接鲁尔锁接头或更换注射器。</li>
		<li>首次使用移植针时，先吸取一只已处死胚胎的卵黄液以润洗针管内壁，随后将卵黄液完全排出。该润洗步骤有助于减少后续操作中细胞在玻璃表面的黏附。</li>
		<li>借助针头轻柔地调整供体胚胎的位置，然后将针头开口垂直于胚胎表面放置图1D). 
		注意：不同实验中该位置会有所不同。对于异位信号分子来源的生成和细胞切除，该位置为动物极的顶端图1E）；对于生殖系移植，这将是边缘（图1D，F).</li>
		<li>缓慢而小心地拉动活塞，将细胞吸入针头中。 
		注意：若吸取消极过快，细胞可能受损。操作正确时，细胞应呈圆柱状柱体吸出。避免将卵黄吸入针头，因为移植的卵黄对宿主胚胎具有毒性。</li>
		<li>通过轻轻向下推动活塞以停止抽吸，当吸入所需数量的细胞后。将针头从胚胎中移出时，以短促而迅速的侧向动作抽动针头。在细胞柱两侧保留少量林格氏液，并将细胞限制在针头的锥形末端图1C，D). 
		注意：在沉积细胞柱时，细胞柱前方的液体有助于将宿主胚胎的细胞分开。</li>
		<li>通过缓慢上下移动注射器活塞（针头保持浸没状态），用林格氏液冲洗细胞，以清除残留的卵黄或细胞碎片。若操作正确，完好的细胞将保持聚集成柱状，而碎片则被冲洗掉。 
		注意：此步骤需格外小心，因为水位将上升至针头锥形末端以上，导致水突然涌入，可用于冲洗细胞。然而，一旦水位超过针头锥形末端，活塞的精细控制能力将下降，因此必须更缓慢、谨慎地移动活塞。</li>
		<li>用非优势手移动移植培养皿，使针头与宿主胚胎表面（动物极或边缘区）垂直图1D- F).</li>
		<li>轻轻施加轻微压力，然后迅速而果断地移动，以刺穿宿主胚胎的包被层。注意避免针头划伤卵黄。 
		注意：通过小心地将胚胎挤压在孔壁上，对其施加轻微压力，可增加胚胎的表面张力，从而有助于刺穿包被层。</li>
		<li>针头进入后，轻轻推动推杆，将细胞柱注入胚胎，同时缓慢撤出针头（图1D- F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗移植针。
	<ol>
		<li>将针头浸入去离子水中，通过上下移动活塞冲洗针头。 
		注意：如果针头仍然不洁净，先用10 M氢氧化钠溶液冲洗，然后再用水冲洗.</li>
		<li>将针头存放在适当的容器中以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在斑马鱼胚胎中生成分泌信号分子的异位来源
<ol>
	<li>准备宿主和供体胚胎。
	<ol>
		<li>通过交配斑马鱼收集新鲜产出的胚胎。</li>
		<li>将1细胞期的斑马鱼胚胎置于含有0.5 mg/mL蛋白酶溶液的小型玻璃培养皿中孵育约15分钟，以去除卵膜（该操作的详细描述已由Rogers, K. W. 等人发表14）。 
		注意：也可在移植前的高阶段（high stage）进行去膜（步骤2.2），但此方法要求注射过的供体胚胎与未注射的宿主胚胎分别去膜。</li>
		<li>将胚胎浸没于200 mL烧杯中的胚胎培养液中。 
		注意：去膜后的囊胚期和原肠胚期胚胎非常脆弱。其暴露的卵黄容易黏附塑料表面，并在接触空气时破裂。因此，这些胚胎必须始终保持完全浸没在胚胎培养液中，使用玻璃移液管转移，并置于涂有琼脂糖（1%溶于胚胎培养液）的塑料培养皿或玻璃培养皿中。</li>
		<li>小心倒出大部分胚胎培养液，缓慢加入新鲜的胚胎培养液。由此产生的轻微搅动有助于去除已松动的卵膜。重复此步骤2–3次。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管将去膜后的胚胎转移至涂有琼脂糖的注射培养皿中。 
		注意：将玻璃巴斯德移液管的尖端在本生灯火焰上灼烧，可使其边缘熔化并变得光滑，有助于防止损伤胚胎。</li>
		<li>将编码荧光标记蛋白的mRNA注射到部分胚胎中（该操作的详细描述已由Rogers, K. W. 等人发表14）。应将mRNA注射至细胞内而非卵黄中，以实现接近均一的表达。注射过的胚胎作为供体，未注射的胚胎作为宿主。 
		注意：注射mRNA的种类和剂量取决于所研究的信号分子，通常范围为20至200 pg2,4,5,6（在某些情况下可高达1000 pg4）。</li>
		<li>将注射后的胚胎转移至装有胚胎培养液的涂有琼脂糖的六孔板中，在28 °C下孵育，直至胚胎发育至早期球状期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移植细胞以生成异位信号源。
	<ol>
		<li>用林格氏液（116 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES；HEPES缓冲液储存于4 °C）填充移植培养皿（含单个三角楔形孔，参见材料表）。 
		注意：林格氏液中的钙离子可促进细胞黏附，并有助于胚胎在移植后愈合。</li>
		<li>将胚胎转移至移植培养皿中。</li>
		<li>将宿主和供体胚胎按交替列排列，每枚胚胎的动物极均朝向移植针。</li>
		<li>按照第1.3节所述进行移植操作。对于异位信号源移植，从供体胚胎动物极顶端取细胞，并将其植入宿主胚胎的相同位置（图1E）。 
		注意：如步骤1.3.8所述，用林格氏液清洗细胞对于生成异位信号源至关重要，以确保已分泌的信号分子不会被带入宿主。移植时避免细胞过多，以防止信号源扩散。直径约80 µm、长度约100 µm的细胞柱适用于多数实验应用。</li>
		<li>让宿主胚胎在林格氏液中停留30分钟至1小时，以恢复。</li>
		<li>使用荧光体视显微镜检查细胞是否成功移植（图2）。</li>
		<li>恢复后，将胚胎转移至装有胚胎培养液的涂有琼脂糖的六孔板中，在28 °C下继续孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过细胞剔除法产生尺寸减小的胚胎
<ol>
	<li>准备胚胎以进行摘除
	<ol>
		<li>从所需基因型的斑马鱼中收集 freshly laid 胚胎。</li>
		<li>在28 °C下孵育胚胎，直至其发育至高囊胚期。</li>
		<li>当胚胎发育至高囊胚阶段时，按照步骤 2.1.2–2.1.5 所述方法进行去卵膜处理。 
		注意：本示例中，细胞摘除在胚球期进行。因此，胚胎应在操作前约30分钟至1小时提前去壳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：标记卵黄合胞体层（YSL）。 
	注意：如有需要，可在切除细胞前向卵黄合胞体层（YSL）注射荧光葡聚糖。该技术可用于判断细胞移除后YSL是否保持完整，这对于正常胚胎发育至关重要。15或者， 体外 合成的mRNA或蛋白质也可注射到卵黄合胞体层（YSL）中。
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管将去壳胚胎转移至含有胚胎水的琼脂糖包被注射皿中。</li>
		<li>将胚胎侧向放置，使胚盘边缘朝向注射针图3A).</li>
		<li>向卵黄合胞体层（YSL）注射0.5 nL的1.5 µg/µL 10 kDa Alexa568-葡聚糖，注射位置应位于胚盘细胞与卵黄之间，深度约为胚胎直径的三分之一。对同一行中的所有胚胎进行注射。 
		注意：由于注射针无需穿透绒毛膜，因此较小（约4 µm）且尖锐的开口更有利。</li>
		<li>将胚胎旋转180°，使胚盘边缘的对侧朝向注射针图3A).</li>
		<li>按照步骤3.2.3所述，向卵黄合胞体层（YSL）再注射0.5 nL浓度为1.5 µg/µL的10 kDa Alexa568-葡聚糖，使每个胚胎的总注射体积达到1 nL。 
		注意：从两侧注射可使荧光葡聚糖在卵黄合胞体层（YSL）内分布更均匀。</li>
		<li>在荧光体视显微镜下观察注射结果。若操作正确，荧光信号将局限于卵黄合胞体层（YSL）图3B）且不应在囊胚的细胞间隙中可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除细胞
	<ol>
		<li>用任氏液填充移植培养皿（参见步骤 2.2.1）。</li>
		<li>将胚胎转移至移植培养皿中。</li>
		<li>将胚胎的动物极朝向移植针图3C).</li>
		<li>按照步骤1.3.5-1.3.7所述，小心地移除动物极区域的细胞，从而将胚盘缩小至所需大小。</li>
		<li>将移除的细胞从移植针中推出并弃去。</li>
		<li>程序完成后，将胚胎置于林格氏液中静置30分钟至1小时，以恢复。</li>
		<li>可选：在荧光体视显微镜下观察YSL的完整性图3D).</li>
		<li>将胚胎转移至含有胚胎培养基的琼脂糖包被培养皿中，并在28 °C下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过生殖系移植创建母源-合子突变体
<ol>
	<li>准备宿主和供体胚胎。
	<ol>
		<li>从突变型和野生型斑马鱼中收集 freshly laid 胚胎。突变型背景的斑马鱼胚胎将作为供体，而野生型背景的斑马鱼胚胎将作为宿主。 
		注意：生殖系移植需要大量的起始胚胎（供体约 50 个，宿主约 500 个），以确保有足够数量的生殖系移植成功并存活至成年。</li>
		<li>使用巴斯德移液管将胚胎转移至含有胚胎培养基的琼脂糖包被注射皿中。 
		注意：注射在去壳前进行，以提高通量。穿过卵膜注射的针头需较钝，并具有较大的开口（约 10 µm），以防止堵塞。</li>
		<li>向供体胚胎中注射 1 nL 浓度为 100 ng/µL、编码 GFP 且带有 nos1 3'UTR 的 mRNA。将 mRNA 注射到卵黄中，以提高通量。 
		注意：nos1 3'UTR 可在原始生殖细胞中稳定 mRNA，使得在受精后 1 天成像时生殖细胞呈现强烈荧光10。</li>
		<li>向宿主胚胎中注射 1 nL 浓度为 0.33 mM（3 µg/µL）的 dead end (dnd) 形态抑制寡核苷酸（morpholino）。将该形态抑制寡核苷酸注射至卵黄中，以提高通量。 
		注意：dnd 形态抑制寡核苷酸可阻断原始生殖细胞的形成，从而确保宿主胚胎的生殖系在移植后完全由供体细胞填充10。</li>
		<li>将注射后的胚胎转移至含胚胎培养基的塑料培养皿中，在 28 °C 下孵育，直至胚胎发育至高期（high stage）。</li>
		<li>当胚胎达到高期时，按照步骤 2.1.2–2.1.5 所述方法对胚胎进行去壳处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生殖细胞移植
	<ol>
		<li>用任氏液（Ringer's solution）填充移植皿（见步骤 2.2.1）。</li>
		<li>将已去壳的球形期至帽状期胚胎转移至移植皿中。</li>
		<li>将宿主胚胎和供体胚胎按交替列排列，以便将一个供体胚胎的细胞移植到六个不同的宿主胚胎中。此方法可提高特定供体胚胎的生殖细胞成功移植的概率。</li>
		<li>将胚胎定向，使其胚缘朝向移植针，并按第 1.3 节所述进行移植操作。对于生殖系移植（图 1D、F），从胚缘处（原始生殖细胞所在位置）吸取细胞，并将其注入宿主胚胎的相同位置。 
		注意：移植较大体积的细胞柱（直径约 80 µm，长度约 600 µm）可提高获得成功生殖系移植的概率。</li>
		<li>移植完成后，让胚胎在任氏液中静置 30 分钟至 1 小时，以恢复。 
		注意：如果并非所有&#160;供体胚胎均为纯合突变体（例如，其来源于杂合子互交），则需在移植后对供体胚胎进行基因分型，以确定宿主胚胎所移植生殖系的基因型。在此情况下，操作过程中应确保宿主与供体胚胎的位置不发生混淆。</li>
		<li>使用荧光体视显微镜检查细胞是否成功移植（图 4A、B）。</li>
		<li>将胚胎转移至 24 孔琼脂糖包被板中。将来自同一供体的所有宿主胚胎归入同一孔中，并相应标记。在 28 °C 下孵育至次日。</li>
		<li>如需进行基因分型，将供体胚胎转移至标记好的 PCR 条板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选成功的生殖系移植
	<ol>
		<li>在受精后约 30 小时（hpf），使用荧光体视显微镜筛选宿主胚胎中成功的生殖系移植。原始生殖细胞位于卵黄延伸部上方的沟槽处（图 4C）。 
		注意：采用本设备和策略的典型实验，其成功率约为 60%–80%，即每个供体胚胎可获得至少一个携带移植生殖细胞的宿主胚胎。此前有报道的成功率约为 10%10。</li>
		<li>如适用，丢弃接受了错误基因型供体细胞的胚胎。将成功移植生殖细胞的幼鱼在标准饲养条件下，依照机构指南培育至成年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+for+Microscopic+Anatomy+and+Developmental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

移植实验的成功在很大程度上依赖于实验者的精细操作技能。要顺利完成各项操作，需要经过练习。然而，与市场上其他仪器相比，本文介绍的仪器相对容易学习和使用，通常仅需几天练习即可掌握。
通过采取若干预防措施，可提高移植操作的成功率。其中一步是确保显微操作仪质量良好，能够平稳运行。在体视显微镜上加装更高放大倍数的目镜，有助于精确调整针头相对于胚胎的位置。使用繁殖性能良好的斑马鱼或青鳉鱼以获得健康的胚胎，并在操作过程中注意避免损伤胚胎（尤其是在去壳步骤期间及之后），也有助于提高成功率。
延迟毒性问题可能更难排查。如果胚胎在移植后数小时才死亡，而非立即死亡，则可能是由于注射针损伤了卵黄（例如，针头刺入胚胎过深），或者细胞被推出时力度过大所致。延迟毒性及胚胎死亡也可能由随供体细胞一同注入的卵黄或细胞碎片引起；另一个原因可能是Ringer溶液中的HEPES缓冲液已降解。这些问题可分别通过洗涤细胞（见步骤1.3.8）或直接使用新鲜配制的缓冲液来解决。此外，在生殖系移植实验中，宿主胚胎出现畸形可能是由于吗啉代寡核苷酸（morpholino）浓度过高所致。关键在于使用足量的吗啉代以完全消除宿主的野生型生殖系，从而防止这些细胞对后代产生贡献；但同时必须避免使用过高的吗啉代浓度。因此，在典型的实验中，对所有注射的数百个宿主胚胎保持一致的吗啉代用量，是实现生殖系移植成功的关键。为此，可在吗啉代注射混合物中加入一种易于观察的示踪染料14，以便在荧光体视显微镜下追踪，确保每个胚胎接受相同的注射体积。
本方案中描述的操作仅涉及囊胚期斑马鱼或青鳉胚胎的细胞操作，但未来通过改变移植针的直径和形状，该装置很可能可适用于不同发育阶段和物种。

从 Mangold 和 Spemann 证明存在能够指导胚胎轴形成的组织者（organizer）的经典实验以来1，胚胎间细胞移植已成为研究胚胎发育的一种成熟技术2,3,4,5,6,7,8,9,10。一种常用的移植装置由千分尺驱动的气密注射器组成，该注射器通过柔性管路连接至微吸管支架，并配有充满矿物油的储液罐12,13。在此装置中，通过旋转螺杆推动注射器的推杆，所产生的压力经管路传递至微吸管，用于从一个胚胎中吸取细胞并将其注入另一个胚胎。然而，这种液压驱动装置包含多个部件，从零开始组装费时费力。类似的设备也可作为完整的成套装置购买，通常称为手动显微注射仪，其商业版本的价格通常超过1500美元。无论自制装置还是商用装置，用于胚胎操作的微吸管均通过充油管路与压力发生装置（即气密注射器）相分离。因此，操作微吸管和移动推杆必须分别用不同的手独立控制，降低了操作通量和实用性。此外，由于需要小心地用油填充管路并避免气泡产生，这类装置在移植前的准备工作也较为繁琐。本文中，我们介绍一种替代性的气动操作装置，可用于细胞移除与移植，该装置成本低廉、易于组装且使用简便。
本文介绍的装置由一支25 µL气密注射器和一个微移液器支架组成，总成本低于80美元。通过鲁尔锁（Luer lock）接口将微移液器支架插入注射器即可轻松完成组装（图1A）。该装置可直接安装在显微操作仪上，使用户能够用单手在显微操作仪处同时控制其位置和吸力。这样可方便地腾出另一只手来稳定和移动盛放供体与受体胚胎的移植培养皿。该装置通过空气直接产生吸力，无需填充矿物油。由于水与玻璃针管壁之间存在吸引力，只要水位处于玻璃针的锥形末端，注射器推杆的大幅移动就会转化为针内水位的微小移动。这使得对吸取细胞数量及其植入位置的精确控制成为可能。
为了展示该装置的实用性，我们以斑马鱼（Danio rerio）胚胎为例，介绍了三种应用。首先，我们展示了如何生成分泌型信号分子的局部来源，可用于研究浓度梯度的形成2,4,6。在此方法中，将编码荧光标记信号分子的mRNA注射到供体胚胎中，随后将带有荧光标记的供体细胞移植到野生型宿主胚胎中，从而对信号梯度的形成过程进行成像和分析。其次，我们描述了如何利用该装置通过切除细胞来产生体积减小的胚胎5,13。最后，我们展示了如何通过将携带原始生殖细胞报告基因的细胞移植到生殖系已被消融的宿主胚胎中，高效地获得母源-合子双突变体6,10。未来，本文所述的细胞移植装置可轻松拓展应用于其他需要进行细胞移除或移植操作的胚胎学实验中。

<table><tbody><tr><td>1.0 mm 玻璃毛细管，两端切割无丝</td><td></td><td></td><td>用于制作移植针</td></tr><tr><td>1.0 mm 玻璃毛细管，两端切割带丝</td><td></td><td></td><td>用于制作注射针</td></tr><tr><td>200 mL 玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td>用于胚胎去壳</td></tr><tr><td>24 孔塑料板</td><td></td><td></td><td>需涂覆琼脂糖以孵育胚胎</td></tr><tr><td>直径 5 cm 玻璃培养皿</td><td></td><td></td><td>用于胚胎去壳</td></tr><tr><td>6 孔塑料板</td><td></td><td></td><td>需涂覆琼脂糖以孵育胚胎</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td></td><td></td><td>用于涂覆塑料培养皿</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;dnd1&lt;/i&gt; morpholino</td><td>Gene Tools</td><td></td><td>序列：GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC&lt;br/&gt; CAT</td></tr><tr><td>胚胎培养液</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Instant Ocean 盐，1 mg/L 亚甲蓝溶于反渗透水中，用 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 调节至 pH 7</td></tr><tr><td>配备 GFP/RFP 滤光片和光源的荧光体视显微镜</td><td></td><td></td><td>用于评估卵黄囊腔注射和生殖系移植</td></tr><tr><td>玻璃微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td>用于制作移植针</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Kimble Chase (通过 Fisher 购买)</td><td>63A53WT</td><td>用于移取胚胎；尖端可通过火焰灼烧以使边缘平滑</td></tr><tr><td>28 &amp;deg;C 恒温培养箱</td><td></td><td></td><td>用于孵育斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>Luer 接头 25 &amp;mu;L Hamilton 注射器，1700 系列</td><td>Hamilton</td><td>货号：80201</td><td>移植装置的组成部分</td></tr><tr><td>手动三轴显微操作器</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>用于控制移植装置</td></tr><tr><td>手动移液泵</td><td>Bio-Tek</td><td>目录号 # 641</td><td>与玻璃移液管配合使用以转移胚胎</td></tr><tr><td>金属解剖探针</td><td></td><td></td><td>用于移动和旋转斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>显微锻造仪</td><td>Narishige</td><td>MF2</td><td>用于制作移植针</td></tr><tr><td>显微注射装置</td><td></td><td></td><td>用于将 mRNA 和 morpholino 注射入胚胎</td></tr><tr><td>显微注射模具，三角形槽</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>用于制备含琼脂糖的显微注射板</td></tr><tr><td>显微注射模具，单孔型</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>PT-1</td><td>用于制备含琼脂糖的移植板</td></tr><tr><td>带 Luer 接头的 1.0 mm 玻璃毛细管微量移液器持针器</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH6S10</td><td>移植装置的组成部分</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6&lt;br/&gt; 体外转录试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340M</td><td>用于生成带帽的 mRNA 以注射入胚胎</td></tr><tr><td>含 &lt;i&gt;GFP-nos1 3'UTR&lt;/i&gt; 的质粒</td><td></td><td></td><td>可转录生成编码 GFP 并带有 &lt;em&gt;nos1&lt;/em&gt; 3'UTR 的 mRNA 的质粒</td></tr><tr><td>100 mm 塑料培养皿</td><td></td><td></td><td>需涂覆琼脂糖以制备注射和移植用培养皿</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt; 的蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>用于胚胎去壳：配制 5 mg/ml 储存液，使用时稀释至 1 mg/ml 进行去壳处理</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s 溶液</td><td></td><td></td><td>配制 1 L：加入 6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 1.19 g HEPES；加水至 1 L；调节 pH 至 7.2；过滤除菌</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>用于注射和移植操作</td></tr></tbody></table>

一种用于斑马鱼胚胎移植的简单高效装置

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

经典的胚胎学操作技术，例如去除细胞以及在胚胎内或胚胎间移植细胞，是研究复杂发育过程的有力手段。斑马鱼胚胎非常适合进行此类操作，因为它们易于获取、体积相对较大且通体透明。然而，以往开发的用于细胞移除和移植的装置使用起来较为繁琐，或购买成本较高。相比之下，本文所介绍的移植装置经济实惠、易于组装且操作简便。在本实验方案中，我们首先介绍该移植装置的操作方法及其使用市售且广泛可得的部件进行组装的步骤。随后，我们展示了该装置的三种应用：生成异位克隆以研究局部信号源的信号扩散、去除细胞以产生体积减小的胚胎，以及生殖系移植以获得母源-合子突变体。最后，我们证明该工具也可用于其他物种的胚胎学操作，例如日本青鳉（medaka）。

上述三种应用中移植装置使用成功与否，可直接在体视显微镜下通过肉眼观察进行评估。在成功的移植中，胚胎应外观正常，形态和卵黄透明度与未移植胚胎相似，胚盘无明显撕裂。若胚胎出现明显损伤（图4B），则无法正常发育。理想情况下，在荧光体视显微镜下观察，表达荧光标记的移植细胞应呈现为连续的细胞柱（图2A、图4A）。若细胞柱出现断裂，表明细胞在吸入移植针头时受到剪切力损伤，或细胞沉积操作过于剧烈。可通过更缓慢、轻柔地推动活塞来避免此类问题。
尽管移植装置主要应用于囊胚期的斑马鱼胚胎5,6，但该技术同样适用于日本青鳉（Oryzias latipes）去壳后的囊胚期胚胎的细胞移植与切除操作（图2B）。除胚胎去壳步骤外，其余操作均可参照上述相同流程进行，其中去壳方法可参考 Porazinski, S. R. 等人17 的描述。
在生殖系移植的特定情况下，一次成功的移植将产生一个在卵黄边缘正上方具有长条形水平细胞列的胚胎（图4A）。然而，由于在囊胚期存在GFP的背景表达（图1F），生殖细胞是否成功移植只能在次日进行评估（图4C-F）。原始生殖细胞将表现为位于卵黄延伸部正上方沟槽内的微小荧光球状结构（图4C-E）。这些细胞出现在正确位置表明生殖系移植成功。形态不同的细胞并非生殖细胞（例如，细长形细胞通常为肌肉细胞，图4F）。此外，若在沟槽外发现原始生殖细胞，则说明其未能正常迁移，将无法贡献于胚胎的生殖系。最后，移植后胚胎的整体形态应与未移植胚胎相似（图4D）；尾部不应变形，头部不应出现萎缩或缺眼现象（图4E）。这些缺陷通常由过高的吗啉代寡核苷酸浓度或移植过程中对胚胎造成的损伤所致。按照本方法进行的生殖系移植实验，通常每6个受体胚胎中会有1-2个成功移植了生殖细胞，成功率约为60%-80%（取决于操作者的经验）。因此，需要将40-50个纯合子供体胚胎的细胞移植到200-300个受体胚胎中，以获得约30个携带突变生殖细胞的个体。
<img alt="斑马鱼嵌合体制作；显微操作仪装置；用于生殖细胞分析的移植示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：移植装置的组装与使用方法。（A）通过鲁尔锁紧接头将气密性注射器与微移液管固定器连接，从而组装移植装置。随后将用于移植的玻璃针插入微移液管固定器中。（B）已组装好的移植装置安装在显微操作仪上的照片（请注意：图片中的背景和标签已被移除）。（C）使用移植装置时，需确保移植针内的液面始终保持在锥形末端处。（D）该装置需在体视显微镜下使用，用于从移植培养皿的单个孔中吸取并注入细胞至硬骨鱼类胚胎内。（E）为构建异位来源，需从供体胚胎的动物极区域获取细胞（i-ii），并将其转移至受体胚胎的动物极区域（iii-vi）。（F）进行生殖系移植时，需从供体胚胎的边缘区域（即生殖细胞所在位置）获取较多数量的细胞（i-ii），再将这些细胞转移至受体胚胎的边缘区域（iii-vi）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼和青鳉胚胎发育，荧光标记的细胞克隆，显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过细胞移植生成克隆。 (A) 通过将荧光标记细胞（绿色）从斑马鱼供体依次移植到斑马鱼宿主胚胎中，生成双克隆的示例。单克隆和双克隆可用于研究分泌型信号分子如何形成时空梯度2,4,5,6。(B) 将转基因表达eGFP的青鳉供体（Wimbledon）17的细胞移植到野生型青鳉宿主中生成单克隆的示例。比例尺为 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="YSL 注射与细胞摘除示意图；胚胎发育过程；显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过细胞摘除生成体积缩小的胚胎。 （A）在通过摘除法去除细胞之前，可通过将荧光染料注射到YSL的两个相对侧来标记YSL。（B）YSL注射后胚胎的示例。（C）为生成体积缩小的胚胎，通过摘除法去除动物极的细胞5。（D）细胞摘除后胚胎的示例。注意YSL保持完整。比例尺表示100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原始生殖细胞移植示意图和显微图像，显示胚胎发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：生殖系移植。（A）供体细胞（绿色）成功移植至宿主边缘区的示例。（B）移植失败的示例。宿主胚胎的卵黄严重受损，胚胎将无法正常发育。（C）在30 hpf时，成功移植的生殖细胞将仅位于卵黄延伸部前区的性腺中胚层中。（D）成功移植的示例，其中多个GFP标记的供体生殖细胞已定植于宿主未来的性腺中。（E）移植失败的示例。尽管生殖细胞已到达性腺中胚层，但宿主胚胎严重畸形，无法正常发育。（F）移植失败的另一示例。未能迁移至正确位置的荧光标记生殖细胞将无法重建性腺。比例尺为100 µm。D–F图的总放大倍数约为50倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

胚胎学操作（如细胞切除和移植）是研究早期发育的重要工具。本方案描述了一种简单且有效的移植装置，可用于斑马鱼胚胎的此类操作。

经典的胚胎学操作，例如在胚胎内或胚胎间移除细胞和移植细胞，是研究复杂……的有力技术

该技术通过移植异位信号源，能够研究胚胎发生过程中信号分子的功能和作用范围。同时，该技术也有助于高效产生生殖系突变体。本方案可应用于囊胚期的斑马鱼和青鳉胚胎，也可能适用于其他胚胎发育阶段及TDO物种。组装移植装置时，使用接头将带有诱饵头的25微升气密注射器连接到微型移液器支架上。然后将该装置直接安装到手动显微操作仪上。使用移植装置时，将装有该装置的显微操作仪放置在体视显微镜旁。然后移除推杆，插入移植针。将针头以45度角插入盛有林格溶液的培养皿中，直至针尖浸入溶液。将推杆插入约一半深度，以冲洗出林格溶液，仅在针头细小的锥形部分保留少量液体。首次使用移植针时，需从一只已处死的胚胎中吸取卵黄，使卵黄完全充满针管内壁，然后彻底排出卵黄物质，以完成针管内壁的包被。接下来，使用移植针轻轻固定供体胚胎，将针头开口垂直于胚胎表面，缓慢拉动针栓，将细胞吸入针内。当吸入所需数量的细胞后，轻推针栓以停止负压吸力，并通过短促而迅速的侧向抽动将针头从胚胎中移出。通过将细胞限制在移液针的锥形末端，使林格氏液保留在细胞柱的两侧。通过缓慢上下移动推杆，用林格氏液冲洗细胞，以清除残留的卵黄或细胞碎片。接着，用非优势手移动移植培养皿，使移液针与宿主胚胎表面垂直。 通过小心地将胚胎挤压在器壁上，对其施加轻微压力。然后迅速而果断地刺穿宿主胚胎的包被层，注意避免针头划伤卵黄。一旦针头进入胚胎内部，轻轻推动针栓，将细胞柱注入胚胎中，同时缓慢撤出针头。进行生殖细胞移植时，先将移植培养皿中加入林格氏液，然后将去壳后的囊胚期胚胎转移至移植培养皿中，并将宿主胚胎与供体胚胎交替排列成列，以便将一个供体胚胎的细胞移植到六个不同的宿主胚胎中。实施移植时，应将胚胎调整方向，使胚缘朝向移植针。进行生殖系移植时，从供体胚胎的胚缘处获取细胞，并将其注入宿主胚胎的相同位置。移植完成后，将胚胎置于林格氏液中恢复30分钟至1小时。然后使用荧光体视显微镜观察移植的细胞。接着，将胚胎转移至24孔琼脂糖包被板中，每孔加入胚胎培养液，并将接受同一供体细胞的所有宿主胚胎分组置于同一孔中。然后将胚胎在28摄氏度下孵育至次日。如有需要，将供体胚胎转移至标记好的PCR管条中，用于基因分型。受精后30小时，在荧光体视显微镜下筛选宿主胚胎以确认生殖系移植是否成功。生殖细胞应位于卵黄延伸部分上方的沟槽处。根据标准饲养条件，将成功移植的幼虫培育至成虫阶段。在成功的移植中，胚胎外观正常，形态和卵黄透明度与未移植胚胎相似，且胚层无明显撕裂。相反，如果胚胎在移植过程中出现明显损伤，则无法正常发育。尽管该移植装置主要应用于囊胚期的斑马鱼胚胎，但也可用于日本青鳉（medaka）去壳囊胚期胚胎的移植和细胞切除操作。在生殖系移植的特定情况下，成功的移植结果表现为胚胎在卵黄边缘正上方形成一条细长的水平细胞列。然而，该操作的成功与否只有在受精后24至30小时才能评估，此时生殖细胞的荧光与体细胞有明显区别。原始生殖细胞将呈现为卵黄延伸部正上方沟槽内微小的荧光球状结构。若这些生殖细胞出现在正确位置，则表明种系移植成功。此处展示了一些移植失败的示例。在第一个示例中，尽管生殖细胞已到达性腺中胚层，但由于宿主胚胎严重畸形，其将无法正常发育。在第二个示例中，仅在沟槽外部检测到荧光细胞。这些细胞可能是体细胞，也可能是未能正确迁移的生殖细胞。这两种类型的细胞均不会参与胚胎生殖系的形成。在操作过程中，必须避免对移植细胞和宿主胚胎造成损伤。应缓慢吸取细胞，清除任何残留的卵黄，并小心插入。该方法为斑马鱼胚胎中的细胞移植提供了一种简便的方式，可用于产生异位来源和生殖系突变体。该装置的主要优点是成本低，且易于大量使用。

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