Name: 用于果蝇消费量化的高吞吐量微板馈线分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习使用高通量微板馈线分析法量化果蝇摄食行为，该方法采用3D打印装置连接微孔板，通过吸光度测量实现自动化数据采集。此经济高效的技术适用于神经科学和行为生物学研究。

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本工作获得了美国国家药物滥用研究所（U01 DA041613）向 TFCM 和 RRHA 提供的资助。

1. 饥饿平板制备
<ol>
	<li>称取 1.5 g 琼脂糖放入 250 mL 玻璃烧杯中。</li>
	<li>向烧杯中加入 100 mL 蒸馏水（H2O）。</li>
	<li>间歇性微波加热，直至琼脂糖完全熔化。 
	注意：需密切观察烧杯，因琼脂糖容易沸腾溢出。</li>
	<li>将熔化的琼脂糖倒入试剂槽中，使用多通道移液器将 80 µL 熔融琼脂糖分配至 96 孔微孔板的每个孔中。将微孔板在室温下加盖静置使其固化。将剩余的琼脂糖密封后冷藏保存，可保存一周，后续可重新熔化用于制备额外的微孔板。</li>
</ol>
2. 果蝇分选与饥饿处理
<ol>
	<li>通过将隔板条插入隔板条通道中来准备连接器。如果隔板条过松，可将其绕在手指上使其产生一定曲率，以便固定在通道中。</li>
	<li>将连接器固定到饥饿板上。请勿使用连接器操作饥饿板，以免连接器滑脱。确保连接器方向正确（即连接器的斜角与微孔板的斜角对齐）。</li>
	<li>在 CO2 麻醉条件下（材料表），分选 3-5 日龄的果蝇。按列将单个果蝇装入饥饿板中。 
	注意：尽管果蝇按列装载，但建议将样本组沿板的行方向分布，而非沿列方向分布（参见 图4 中的板布局示例）。</li>
	<li>每填满一列后，通过调整该列的隔板条至闭合位置将其关闭。</li>
</ol>
<img alt="饥饿培养板布局；E：蒸发对照，M：雄性，F：雌性；网格模式分析，实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：典型的饥饿培养板布局。 该示意图展示了本研究中所用96孔板内蒸发对照、雄性和雌性果蝇的排列方式。也可采用其他配置方式，例如将雄性和雌性交替排列于不同行，而将蒸发对照置于A行和H行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>仔细记录微孔板内的样品布局。在加样完成后，移除 CO2 使果蝇自然恢复，并从初次麻醉时间开始让其饥饿处理 6 h。</li>
</ol>
3. 液体食物的制备
注意：每天需新鲜配制液体食物。
<ol>
	<li>配制 10 mg/mL 的 FD 荧光染料储备液&amp;C 蓝 #1 溶于蒸馏水2O. 
	注意：可在室温下保存长达6个月。</li>
	<li>制备10 mL液体食物（4%蔗糖，1%酵母提取物， 40 µg/mL 的 FD&amp;C Blue #1) 在15 mL圆锥管中，将0.4 g蔗糖和0.1 g酵母提取物溶解于10 mL蒸馏H2O. 颠倒混匀试管，直至固体完全溶解。加入 40 µL 加入染料母液后反复倒置试管以充分混匀溶液。</li>
	<li>将液体食物转移至装有 0.45 µm 过滤。每次将约 1.5 mL 溶液过滤至 1.7 mL 微离心管中。将装有溶液的注射器暂置一旁，并在制备饲养层平板过程中根据需要继续过滤剩余溶液。</li>
</ol>
4. 饲养层平板的制备
注意：填充后应轻柔操作饲喂板，避免孔中产生气泡或液滴，以免影响吸光度读数。
<ol>
	<li>通过使用密封膜将1536孔微孔板的底部密封，制备一块饲养板。使用密封压板使膜完全贴合。用剃刀刀片修剪左右两侧多余的膜。</li>
	<li>将过滤后的液体食物以列向方式加入1536孔微孔板的相应孔中，每孔加10 µL（参见图5示意图）。每个四孔一组的孔群，加至左上角的孔中（参见图5示意图）。</li>
</ol>
<img alt="用于样本分配规划的1536孔板布局及96孔饲喂板加样顺序示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：1536孔饲喂板的加样顺序与孔位位置。 该示意图对应实验方案中的步骤4.2。箭头表示饲喂溶液按列依次加入饲喂板的顺序，从第1列至第12列逐列添加。样本B1被放大显示，以示例说明在单选和双选实验中饲喂溶液的孔位分布情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>所有孔加样完毕后，将密封膜覆盖在板的顶部。使用压膜工具将密封膜完全贴合。用剃刀刀片修剪左右两侧多余的密封膜。按需要重复此操作处理其余板子。</li>
	<li>将板在 200 × g 条件下离心 10 秒，使液体沉降至孔底。切勿将板冷却，因为这可能导致孔内产生冷凝水，干扰吸光度读数。</li>
</ol>
5. 暴露
<ol>
	<li>当果蝇准备好进行摄食实验时，使用装有直径为0.25 mm针头的针探工具，在培养板顶面的孔位上穿孔。穿孔顺序应与加样时的顺序一致。翻转培养板，在底部的孔位上穿孔。每次更换溶液时需擦拭针头，以防止交叉污染。操作时避免触碰穿孔部位，以免通过毛细作用将孔中的溶液吸出。</li>
	<li>在630 nm波长下读取无盖微孔板的吸光度。</li>
	<li>在顶部密封膜上放置内盖，确保冷凝环环绕穿孔孔位。将外盖盖在板上。</li>
	<li>将饲喂板正面朝上放置在连接器上，使导针对准饲喂板和饥饿板的相应孔位。确保连接器和各板方向正确（即连接器的斜角与各板的斜角对齐）。用橡皮筋缠绕顶部和底部的板，以固定连接器。检查饲喂板与连接器之间的对齐情况及是否存在间隙。</li>
	<li>将所有饲养层板装载到连接器上后，通过调节连接器上的隔板条打开各板的孔位。将连接器-板组件放入次级容器中，每个次级容器最多可容纳六个组件。</li>
	<li>将装有浸湿纸巾的移液器盒下半部分放入每个次级容器中以提供湿度。盖上次级容器的盖子，并将其转移至受控环境（25 °C，湿度控制，12小时光照：12小时黑暗循环）。让果蝇摄食22小时。</li>
	<li>在暴露22小时后，检查每块培养皿中的果蝇死亡情况，并相应更新培养皿布局。待所有培养皿检查完毕后，对果蝇进行麻醉 大规模 通过泵送 CO2 将果蝇转移至次级容器中。约60秒后，确认所有果蝇均已 immobilized（ immobilized）。轻轻将果蝇压入饥饿板中，并重新放置塑料隔板条。移除饲喂板以进行读数。</li>
	<li>在 630 nm 处重新读取各孔的吸光度。重复此步骤，直至完成所有板的读数。</li>
</ol>
6. 数据分析
注意：可使用研究者偏好的软件包进行分析。
<ol>
	<li>剔除在22小时暴露期间死亡的果蝇。</li>
	<li>对于每个孔，计算消耗的体积，公式如下： 
	<img alt="化学分析中利用吸光度测定浓度的方程" src="/files/ftp_upload/62771/62771eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 
	C - 消耗体积 (µL) 
	V - 初始孔体积（即 10 µL) 
	ABS0 - 暴露前吸光度 
	ABS1 - 暴露后吸光度 
	注意：计算中消耗量以正值体积表示。</li>
	<li>为消除蒸发影响，从各培养板内果蝇消耗量的平均值中减去相应的平均蒸发体积。对于二选一/偏好性测试，需根据各自对应的溶液对每个孔进行校正，例如.，根据蒸发对照组中的“choice 1”调整“choice 1”孔。</li>
	<li>调整蒸发量后，剔除消耗值小于零的样本。</li>
	<li>对于双选择测试，计算每个孔的偏好值，公式如下： 
	<img alt="偏振公式 \(P=\frac{F_A-F_N}{F_A+F_N}\)；用于光学分析的数学方程。" src="/files/ftp_upload/62771/62771eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"> 
	P - 偏好指数（正值表示偏好） 
	FA 含添加剂液体食物的摄取量（选择2） 
	FN - 正常液态食物摄取量（选项1）</li>
</ol>
7. 微孔板和耦合器清洗方案。
注意：请小心避免损坏微量滴定板的底部，因为损坏可能会影响密封效果。
<ol>
	<li>从1536孔微孔板上移除薄膜和标签。分离耦合器和屏障条。将屏障条放入可密封的容器（如瓶子）中。用温热的自来水、温和的洗涤剂溶液、温热的自来水，最后用蒸馏水H2O，剧烈振荡清洗屏障条。</li>
	<li>用温热的自来水冲洗1536孔微孔板和耦合器。对于微孔板，让自来水流经每块板的各个孔，尽可能清除溶液和残留物。如有需要，可使用移液器吸头清除残留物；切勿在板上使用金属或玻璃器具。</li>
	<li>用温和的洗涤剂溶液（例如1% v/v Aquet）覆盖每块板和耦合器。对于板，用手套擦拭表面；对于耦合器，使用刷子刷洗。</li>
	<li>先用自来水彻底冲洗每块板，再用蒸馏水H2O冲洗。确保在水流下专门冲洗各孔。</li>
	<li>将板和耦合器在室温下盖好后自然晾干。存放于洁净的储存容器中，待用。 
	注意：操作1536孔微孔板时切勿不戴手套。皮肤上的残留油脂可能影响密封，导致孔间泄漏和蒸发。</li>
</ol>

<ol><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+food+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS ONE. 4 (6), (2009).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究描述了一种定量测量黑腹果蝇（Drosophila）摄食行为的新方法：微孔板摄食检测法（Microplate Feeder Assay, MFA）。在该检测中，果蝇通过控制尺寸的穿孔从1536孔微孔板的密封孔中摄取食物（图1，图2； 补充视频S.1）。由于液体食物被染色并置于微孔板中，因此可使用微孔板分光光度计测量食物的光吸收值（图3）。通过比较摄食前后食物的吸光度，并将该比例应用于摄食前已知的加样体积，即可确定摄食量。该方法通过测量不同体积染色培养基的吸光度进行了实证验证（图3B）。
为了开发该检测方法，需要一种能够利用基于吸光度的消耗量定量分析的装置。以微孔板形式测试果蝇具有吸引力，因为这种形式可与用于分配食物的微孔板相配合，并通过调整耦合器几何结构，灵活选择多种孔板格式（例如6孔、12孔、48孔或96孔格式）。本研究选用96孔微孔板格式，以实现对单只果蝇的独立培养。
3D 打印装置（图 1）可精确对齐 1536 孔饲喂板与 96 孔培养板，使每只果蝇最多可接触饲喂板上的 4 个孔进行摄食。此外，为了提供充足的时间将果蝇分配至饲养板中，并控制实验的启动时间，该装置包含可翻转的屏障条，用于将果蝇限制在各自的孔内，防止其逃逸。获取或修改这些部件所需的文件已提供（补充文件 S.2-S.3），以及相关部件的必要制造说明（补充文件 S.4）。
MFA 提供了一种简单且高通量的方法，可作为监测果蝇摄食行为的更复杂方法的补充18,21,22。相较于其他用于量化食物摄入的方法，MFA 具有多项优势。通过使用酶标仪定量摄食量，显著提高了通量，避免了人工测量和手动数据录入。数据也便于进行程序化提取和处理。此外，更高的通量增加了可行的生物学重复数量，尤其是与群体饲喂器设计相比，这大大提高了检测摄食微小差异的统计效能。使用 MFA，单个实验人员在一次过夜实验中即可量化超过 500 只果蝇的摄食量或偏好。通过重叠实验运行，在 5 天内可检测超过 2,000 只果蝇。最后，由于微孔板和连接器可重复使用，长期使用可节省成本（补充文件 S.5）。使用 MFA，每次实验的估计成本可低至 14.80 美元，设备前期投入为 127.60 美元。而使用传统的毛细管饲喂（CApillary FEeder, CAFE）实验，由于需要昂贵的精密毛细管，相同数量重复的每次实验估计成本为 46.08 美元。因此，尽管在设备购置上存在前期投入，但 recurring 成本的降低可带来显著节约，尤其适用于需要反复测试的情况。
与所有检测方法一样，MFA 具有一定的局限性。首先，该方法需要能够读取 1536 孔微孔板的微孔板分光光度计。此外，由于定量依赖于吸光度测量，该方法容易受到光学干扰的影响，表现为少数测试样品出现负的消耗值。此外，待测的营养物质、药物、医药品或毒素必须可溶于水，才能适用于该检测方法。
尽管存在局限性，该方法仍提供了一种高通量定量分析摄食行为的方式 果蝇此外，该耦合装置可轻松改装以适配多种板型，从而能够适用于多种昆虫物种。

黑腹果蝇 作为遗传学模式生物被广泛用于研究摄食行为的生物学基础及相关摄食特征1据估计，人类致病基因中有65%在果蝇中具有功能同源基因，其中很大一部分在果蝇与人类的功能等效组织中均有表达2此外， D. melanogaster的 体型小、世代间隔短、易于饲养且遗传操作简便，使其成为研究营养物质消耗的优选模型3,4 以及多种物质（包括杀虫剂）的毒理学和药理学效应5污染物6，药物7，以及滥用药物8,9,10.
在许多情况下，对这些性状的研究需要对摄食量进行精确量化。用于量化摄食量的方法多种多样，包括毛细管摄食（CApillary FEeder, CAFE）实验11、人工喂食（MAnual FEeding, MAFE）实验12、喙伸展反应（Proboscis Extension Response, PER）实验13、示踪染料提取法14,15、寡核苷酸示踪物提取法16以及放射性同位素提取法5,17。近年来的研究重点在于提高这些实验的通量，例如Expresso实验18或基于孔板的全动物摄食平面（Whole Animal Feeding FLat, WAFFL）系统19。尽管这些方法具有实用性，但它们可能操作复杂、成本较高或劳动强度大，从而限制了其在高通量研究中的应用。
<img alt="微流控实验中带有3D打印连接器和琼脂糖的微孔板设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：微孔板喂食实验的组成部件。（A）组装完成的微孔板喂食实验的三维示意图。1536孔微孔板通过3D打印的连接器进行定位，使得下方96孔微孔板中的每个孔均可对应上方1536孔微孔板中的四个孔。通过调节插入连接器槽中的屏障条位置，可控制对各孔的通路。（B）微孔板喂食实验中每个孔的示意图。使用已打孔的密封膜将消耗性溶液保留在各孔中，以便果蝇取食。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="饲喂板制备示意图：微孔板密封、离心、ΔAbs~ΔVolume 图；饥饿处理设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：微孔板饲喂实验流程概览。 该图展示了一个流程图，对应本实验方案中的步骤 4.1–5.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了克服这些障碍，开发了微孔板喂食实验（Microplate Feeder Assay, MFA；图1）。在该实验中，果蝇被单独饲养于96孔微孔板中。每个96孔板通过一个定制的3D打印装置与一个1536孔微孔板连接。该装置精确地对齐两个板，使得96孔板中每个孔内的果蝇均可接触到1536孔板中的4个孔。通过使用无底的1536孔板并结合密封膜，将溶液分配至选定的孔中，并用精确的直径为0.25 mm的针头穿孔，以供果蝇取食。关键的是，允许果蝇直接从微孔板中摄食，从而可立即使用微孔板读数仪进行基于吸光度的测量。在摄食介质中加入稀释的示踪染料，通过检测暴露后吸光度的变化来确定摄取的液体体积（图2 和 图3）。由于每个孔中的液体近似为一液柱，体积的差异将表现为液柱高度的不同（图3A）。根据比尔-朗伯定律20：
<img alt="比尔-朗伯定律公式 A=εlc，吸光度测量，光谱分析。" src="/files/ftp_upload/62771/62771eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">
其中 A 是吸光度， ε 是衰减分析物的摩尔吸收系数， l 是光程长度，且 c 是减毒分析物的浓度。因此，在摩尔吸光系数和浓度保持恒定的情况下，吸光度的变化仅由光程长度的变化引起，即特定孔内液体液面高度的变化。通过测量暴露前后的吸光度，吸光度的相对变化可反映液体体积的相对变化（图3B).
<img alt="显示吸光度公式 Abs=log₁₀(I₀/I) 及吸收曲线图展示体积相关性的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：基于吸光度的孔体积定量分析。（A）已知入射光强（I0）穿过各孔。在不同填充体积下，光的衰减导致不同的出射光强（I），表现出体积与吸光度之间的线性关系。（B）吸光度与体积的实测数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
根据体积的变化，可通过已知的饲喂溶液中化合物浓度计算出任何摄入化合物的量。该检测所需的组件成本较低且可高度重复使用，显著降低了检测的重复成本。因此，该方法提供了一种经济、高通量且精确量化摄食量的技术。

<table><tbody><tr><td>0.25 mm 直径针头</td><td>Rave Scientific</td><td>RS-MN-52-001012</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>奥林巴斯塑料公司</td><td>25-245</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 一次性注射器</td><td>EXELINT</td><td>26200</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>屏障条（激光切割）</td><td>Ponoko</td><td>-</td><td>材料：透明PETG，厚度0.5 mm；补充文件：</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>A-4-62 转子配微孔板桶</td><td>Eppendorf</td><td>22638041</td><td></td></tr><tr><td>FD&amp;amp;C 蓝 1号</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>FD110</td><td></td></tr><tr><td>封膜板</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-563-280</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>#59-114 和 #59-119</td><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;麻醉：果蝇麻醉垫&amp;nbsp; 有两种规格，任一种均适用</td></tr><tr><td>微孔板连接器（3D打印）</td><td>Shapeways</td><td>-</td><td>材料：多射流熔融尼龙（MJF PA12）；补充文件：</td></tr><tr><td>微孔板盖</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656170</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Devices SpectraMax iD5</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>任何具有1536孔分辨率的微孔板读板仪均可使用。</td></tr><tr><td>针式探针固定器</td><td>Rave Scientific</td><td>RS-MN-52-001000</td><td></td></tr><tr><td>聚酯密封膜</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>100-SEAL-PLT</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯96孔微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯，无底，1536孔微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>783000</td><td>定制产品；采购时请预留充足的供货周期。</td></tr><tr><td>橡皮筋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>密封条</td><td></td><td></td><td>1/2&quot; x 1/8&quot; 高密度自粘氯丁橡胶</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于定量摄食行为的高通量微孔板饲喂检测法 果蝇

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

量化果蝇（Drosophila）的食物摄入量可用于研究与摄食相关性状的遗传和生理基础、环境影响因素，以及多种物质的毒理学和药理学效应。目前已有的一些方法中，适用于高通量测量的仍较少。微孔板摄食检测法（Microplate Feeder Assay, MFA）是一种利用吸光度来定量单只果蝇摄取液态食物的方法。在该方法中，果蝇从1536孔微孔板的特定孔中摄取含有稀释示踪染料的液态食物培养基。通过向各孔中加入已知体积的含染料液体，并在摄食前后分别测定孔的吸光度，即可反映孔内液体体积的变化（即摄食量）。为了实现该方法的高通量分析，研究人员设计了一种3D打印的耦合装置，可将果蝇逐个分选至96孔微孔板中。该装置能够精确对齐96孔板和1536孔板，使每只果蝇最多可接触4个孔进行摄食，从而在测定常规摄食量的同时，还可量化食物偏好性。此外，该装置配备有可切换开闭状态的隔断条，能够逐列控制样本的隔离与释放。该方法可实现大量果蝇对水溶液摄食行为的高通量同步测量，并具备拓展应用于其他昆虫，以及筛选营养物质、毒素或药物摄取情况的潜力。

为了确定单个板上各孔之间是否存在任何相关性，对每个孔的蒸发量进行了定量分析（每块板 n = 96 个孔，共三块板）。测得蒸发量为 -0.036 µL ± 0.003 µL（均值 ± 标准误，下同）。(图6A) 采用皮尔逊相关性分析评估蒸发量与孔位位置之间的趋势。蒸发量与行位置的相关系数 (图6B、C) 为 -0.04（p = 0.4949），蒸发量与列位置的相关系数为 -0.23（p = 0.0001）。由于列方向存在虽轻微但具有统计学意义的相关性，后续实验中将分组沿列分布以减轻该影响。
<img alt="蒸发引起的密度变化；相关系数和 p 值的统计分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：微流控芯片（MFA）中的蒸发现象。（A）蒸发变化的密度分布，虚线表示均值 ± 标准差（SD）。蒸发与行（B）或列（C）之间的相关性，Pearson 相关系数和 p 值如图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为验证该方案的有效性，对3至5日龄的个体进行了摄食量测定 Canton-S B 果蝇（每板每性别 n = 36，每板 n = 24 蒸发对照，共三板）图7). 对照孔中的蒸发量与零相比存在显著差异（-0.030 µL ± 0.006 µL，p = 4.81 × 10-6；一个样本 t-测试与零值对比）。数据集中有两份样本被剔除（均为雄性），其中一份因在过夜暴露期间死亡，另一份因经蒸发校正后摄食量为负值。最终得到 &gt; 99% 的样品保留率
<img alt="果蝇摄食研究；微室中的果蝇（A），基于Kruskal-Wallis检验的摄食量数据图表（B）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：使用微流控分析法进行消耗量量化。 (A通过定制的玻璃腔室观察摄食行为。可观察到果蝇从带孔的孔洞中饮水，并在摄入染色溶液后表现出蓝色的腹部染色。另见 补充视频 S.1 (B) 蒸发对照组、雄性果蝇和雌性果蝇之间的消耗量值（均值 ± 标准误）。两两比较 事后 t 检验采用方差不齐的 t 检验进行统计学比较，显著性以标示的图柱表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
随后，按照 Y = 的描述构建了方差分析（ANOVA）模型 µ + S + P + SxP + e，其中Y为组均值， µ as 总体均值，S 表示性别的固定效应，P 表示培养板的固定效应，S×P 表示性别与培养板之间的交互作用，e 表示残差变异。方差分析显示，摄食量在培养板之间无显著差异（p = 0.671），性别与培养板之间也无显著交互作用（p = 0.104），而性别本身对摄食量的变异具有显著影响（p = 4.17 × 10⁻⁵）。-18）。A 事后 t 检验检验结果显示，男性摄入量显著低于女性（0.500 µL ± 0.017 µL 对比 0.811 µL ± 0.028 µL，p = 1.13 × 10-17，两个样本 t- 方差不齐的t检验。
为了证明该检测方法可用于双选偏好量化，实验中让果蝇在含有1%酵母提取物的4%蔗糖溶液与添加了15%乙醇和1%酵母提取物的4%蔗糖溶液之间进行选择。雄性和雌性果蝇均表现出对含乙醇和酵母提取物溶液的强烈偏好，雄性的偏好指数为0.974 ± 0.026，雌性为0.876 ± 0.06（平均值 ± 标准误）（图8）。
<img alt="乙醇摄入量散点图；雄性与雌性；蔗糖对照；统计 p 值；图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62771/62771fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 8"> 
图 8：利用多通道摄食分析仪（MFA）进行偏好性量化。 雄性和雌性果蝇对 4% 蔗糖溶液与添加 15% 乙醇和酵母提取物的 4% 蔗糖溶液的摄食情况（每种性别 n = 33）。雄性果蝇对乙醇溶液的摄食量高于对照蔗糖溶液（0.511 µL ± 0.029 µL 对比 0.00 µL ± 0.017 µL；p = 4.06e-10；双样本 t-检验）。雌性果蝇对乙醇溶液的摄食量也高于对照蔗糖溶液（0.939 µL ± 0.044 µL 对比 0.132 µL ± 0.044 µL；p = 7.38e-17；双样本 t-检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/62771fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充视频 S.1：视频显示果蝇从穿孔的孔中取食，并在摄入染色溶液时腹部逐渐积累蓝色染色。 静态图像见图7A。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/JoVEJoVE_Review-Supplementary_Video_S.1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件 S.2：微孔板进样器检测耦合器。这是用于微孔板进样器检测（MFA）的耦合器的可3D打印结构。MFA采用尼龙PA12作为打印材料。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/Supplementary_File_S.2.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 S.3：微孔板喂食器实验用屏障条。 该文件包含用于切换果蝇对喂食板暴露的塑料屏障条的设计。单个连接器最多可使用十二条屏障条。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/Supplementary_File_S.3.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 S.4：微孔板饲喂实验的拆包与制备说明。 本文件包含耦合器和屏障条的拆包说明，以及用于限制暴露过程中蒸发的内盖、外盖和次级容器的制备说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/Supplementary_File_S.4.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 S.5：微量孔板喂食实验（MFA）与单管单果蝇摄食实验（CAFE）的成本比较。对单个品系的72只果蝇/性别进行测试，MFA需要两套设备（连接器 + 板 + 隔离条），而CAFE每个培养管仅需1根毛细管。尽管MFA的初期投入成本较高，但由于后续耗材成本差异显著（分别为14.80美元和46.08美元），仅需测试4个品系即可收回前期投入成本（盈亏平衡点）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62771/Supplementary_File_S.5.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

微孔板喂食实验提供了一种经济、高通量的方法，用于定量果蝇（Drosophila）的液体食物摄入量。该方法使用一个3D打印装置，将饲养果蝇的96孔微孔板与另一个含有含示踪染料喂食溶液的1536孔微孔板连接。通过分光光度法测量溶液的体积减少量。

量化果蝇的食物摄入量用于研究与摄食相关性状的遗传和生理基础及其环境……

微孔板饲喂实验提供了一种简单、高通量且经济的方法来测量果蝇的摄食行为，相较于其他更为复杂的实验方法具有多种优势。通过使用酶标仪测量吸光度来定量摄食量，可消除人工测量并避免手动录入数据。此外，所获得的数据也便于进行程序化提取和处理。通过这种高通量检测方法，我们可以定量分析水溶性营养物质、药物、医药化合物或毒素的消耗情况，并且该系统可经修改后应用于多种昆虫物种。首先将熔化的琼脂糖倒入试剂槽中，然后使用多通道移液器将80微升熔化的琼脂糖分配至96孔微孔板的每个孔中。将剩余的琼脂糖密封于袋子中，可在冰箱中冷藏保存长达一周，需要时重新熔化以制备额外的微孔板。如果屏障条过松，可将其缠绕在手指上，使其产生曲度，以便固定在通道内。将屏障条插入屏障条通道中，以制备耦合器。将耦合器固定到饥饿平板上，注意不要用耦合器来移动平板，以免耦合器滑脱。确保耦合器的斜角与微孔板的斜角对齐，以保持正确的方向。在 CO2 麻醉条件下，挑选三至五日龄的果蝇。按列将单个果蝇加载到饥饿板中。随着每列填满，通过将屏障条调节至闭合位置来关闭该列。仔细记录微孔板内的样品布局。饥饿板加样完成后，移除CO2使果蝇自然恢复，并从初次麻醉时开始计时，使其饥饿处理六小时。在15毫升锥形管中，将0.4克蔗糖和0.1克酵母提取物溶解于10毫升蒸馏水中，配制10毫升液体食物。涡旋振荡管子，直至固体完全溶解。加入40微升染料储备液，并将液体食物转移至带有0.45微米滤器的10毫升注射器中。每次将约 1.5 毫升溶液过滤至 1.7 毫升微量离心管中。将装有溶液的注射器暂时放置一旁，并在制备饲养层平板过程中根据需要继续过滤剩余溶液。通过使用封板膜密封 1536 孔微孔板的底部来制备饲养层平板。使用封膜板彻底压紧封膜，然后用刀片修剪左侧和右侧多余的封膜。将过滤后的液体食物按列向1536孔微孔板每四个孔组成的孔簇左上角的孔中加入10微升。所有孔加样完毕后，按照密封微孔板底部的相同步骤，将密封膜贴在板的顶部。根据需要重复此操作，完成所需数量的板。将板在200 ×g 条件下离心10秒，使液体沉降至孔底。切勿使酶标板冷却，因为这可能导致孔内产生冷凝水，影响吸光度读数。使用装有直径为0.25毫米针头的针探工具，在酶标板上表面的孔中打孔，打孔顺序应与加样时的顺序一致。每次更换溶液时需擦拭针头，以防止交叉污染。将酶标板翻转，在底部打孔。在无盖条件下于630纳米波长处读取酶标板的吸光度。将内盖置于顶部密封膜上，确保冷凝环围绕打孔的孔位，然后将外盖盖在酶标板上。将进料板正面朝上放置在耦合器上，使导针对准进料板和饥饿板的相应孔位。确保耦合器和板的方向正确。当所有进料板都装载到耦合器上后，通过调节耦合器上的阻隔条来打开各板的孔。将耦合器和板组件放入次级容器中。在每个次级容器中放入装有浸湿纸巾的移液管盒下半部分，以提供湿度。盖上次级容器的盖子，并将其转移至受控环境。让果蝇摄食22小时。暴露22小时后，检查每块培养板中的死亡果蝇，并相应更新培养板布局。检查完所有培养板后，通过向次级容器内通入CO2，对果蝇进行集体麻醉。大约 60 秒后，确保所有果蝇均已被固定。轻轻将果蝇敲入饥饿板中，并重新放置塑料隔板条。移除饲喂板以进行读数。在630纳米处重新读取酶标板的吸光度。重复此过程，直至所有酶标板均被读取。对每个孔的蒸发量进行定量分析，并用于确定单个酶标板内各孔之间是否存在任何相关性。计算了蒸发量与行位置以及蒸发量与列位置之间的皮尔逊相关系数，以评估蒸发量与孔位之间的趋势关系。通过量化3至5日龄Canton-SB果蝇的消耗量来验证该实验方案的有效性。果蝇可在含有1%酵母提取物的4%蔗糖溶液与添加了15%乙醇和1%酵母提取物的4%蔗糖溶液之间进行选择。雄性和雌性果蝇均表现出对含有乙醇和酵母提取物溶液的强烈偏好。在制备饲喂板时必须保持一致性，确保每只果蝇在食物体积、蒸发量和接触条件方面均处于完全相同的摄食环境中。该技术将使果蝇研究领域的科研人员能够以高于传统方法的通量和更低的成本，开展摄食与偏好行为的高通量检测。

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科研

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行为

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