一种用于定量摄食行为的高通量微孔板饲喂检测法 果蝇

微孔板饲喂实验提供了一种简单、高通量且经济的方法来测量果蝇的摄食行为，相较于其他更为复杂的实验方法具有多种优势。通过使用酶标仪测量吸光度来定量摄食量，可消除人工测量并避免手动录入数据。此外，所获得的数据也便于进行程序化提取和处理。

通过这种高通量检测方法，我们可以定量分析水溶性营养物质、药物、医药化合物或毒素的消耗情况，并且该系统可经修改后应用于多种昆虫物种。首先将熔化的琼脂糖倒入试剂槽中，然后使用多通道移液器将80微升熔化的琼脂糖分配至96孔微孔板的每个孔中。将剩余的琼脂糖密封于袋子中，可在冰箱中冷藏保存长达一周，需要时重新熔化以制备额外的微孔板。

如果屏障条过松，可将其缠绕在手指上，使其产生曲度，以便固定在通道内。将屏障条插入屏障条通道中，以制备耦合器。将耦合器固定到饥饿平板上，注意不要用耦合器来移动平板，以免耦合器滑脱。

确保耦合器的斜角与微孔板的斜角对齐，以保持正确的方向。在 CO2 麻醉条件下，挑选三至五日龄的果蝇。按列将单个果蝇加载到饥饿板中。

随着每列填满，通过将屏障条调节至闭合位置来关闭该列。仔细记录微孔板内的样品布局。饥饿板加样完成后，移除CO2使果蝇自然恢复，并从初次麻醉时开始计时，使其饥饿处理六小时。

在15毫升锥形管中，将0.4克蔗糖和0.1克酵母提取物溶解于10毫升蒸馏水中，配制10毫升液体食物。涡旋振荡管子，直至固体完全溶解。加入40微升染料储备液，并将液体食物转移至带有0.45微米滤器的10毫升注射器中。

每次将约 1.5 毫升溶液过滤至 1.7 毫升微量离心管中。将装有溶液的注射器暂时放置一旁，并在制备饲养层平板过程中根据需要继续过滤剩余溶液。通过使用封板膜密封 1536 孔微孔板的底部来制备饲养层平板。

使用封膜板彻底压紧封膜，然后用刀片修剪左侧和右侧多余的封膜。将过滤后的液体食物按列向1536孔微孔板每四个孔组成的孔簇左上角的孔中加入10微升。

所有孔加样完毕后，按照密封微孔板底部的相同步骤，将密封膜贴在板的顶部。根据需要重复此操作，完成所需数量的板。将板在200 ×g 条件下离心10秒，使液体沉降至孔底。

切勿使酶标板冷却，因为这可能导致孔内产生冷凝水，影响吸光度读数。使用装有直径为0.25毫米针头的针探工具，在酶标板上表面的孔中打孔，打孔顺序应与加样时的顺序一致。每次更换溶液时需擦拭针头，以防止交叉污染。

将酶标板翻转，在底部打孔。在无盖条件下于630纳米波长处读取酶标板的吸光度。将内盖置于顶部密封膜上，确保冷凝环围绕打孔的孔位，然后将外盖盖在酶标板上。

将进料板正面朝上放置在耦合器上，使导针对准进料板和饥饿板的相应孔位。确保耦合器和板的方向正确。当所有进料板都装载到耦合器上后，通过调节耦合器上的阻隔条来打开各板的孔。

将耦合器和板组件放入次级容器中。在每个次级容器中放入装有浸湿纸巾的移液管盒下半部分，以提供湿度。盖上次级容器的盖子，并将其转移至受控环境。

让果蝇摄食22小时。暴露22小时后，检查每块培养板中的死亡果蝇，并相应更新培养板布局。检查完所有培养板后，通过向次级容器内通入CO2，对果蝇进行集体麻醉。

大约 60 秒后，确保所有果蝇均已被固定。轻轻将果蝇敲入饥饿板中，并重新放置塑料隔板条。移除饲喂板以进行读数。

在630纳米处重新读取酶标板的吸光度。重复此过程，直至所有酶标板均被读取。对每个孔的蒸发量进行定量分析，并用于确定单个酶标板内各孔之间是否存在任何相关性。

计算了蒸发量与行位置以及蒸发量与列位置之间的皮尔逊相关系数，以评估蒸发量与孔位之间的趋势关系。通过量化3至5日龄Canton-SB果蝇的消耗量来验证该实验方案的有效性。果蝇可在含有1%酵母提取物的4%蔗糖溶液与添加了15%乙醇和1%酵母提取物的4%蔗糖溶液之间进行选择。

雄性和雌性果蝇均表现出对含有乙醇和酵母提取物溶液的强烈偏好。在制备饲喂板时必须保持一致性，确保每只果蝇在食物体积、蒸发量和接触条件方面均处于完全相同的摄食环境中。该技术将使果蝇研究领域的科研人员能够以高于传统方法的通量和更低的成本，开展摄食与偏好行为的高通量检测。