使用实时显微镜和开源软件对 阿斯珀吉卢斯尼杜兰 生长速度的定量分析

在这段视频中，我们描述了一个标签免费的实时成像协议，使用传输的光显微镜技术捕捉模型真菌阿斯珀吉卢斯尼杜兰的图像。我们使用此图像分析和量化液体和固体介质中阿斯珀吉卢斯尼杜兰的生长动力学。此协议的视觉表示允许用户熟悉图像捕获和显微镜图像处理的重要步骤。

用于测量长丝真菌生长的常见方法是，在含有营养阿加的培养皿中接种两个接种真菌孢子，并在几天后测量发育中的菌落的直径。然而，这种方法不够敏感，无法量化精细的增长差异。因此，利用延时显微镜进行了单细胞测量。

这种测量不仅能够提供准确和定量的结果，而且还能够反映人群中不同细胞的生长动力学。此外，这种方法旨在更好地了解真菌生长对内源性和环境信号的反应所涉及的分子机制。首先将15毫升的液体营养阿加倒入培养皿中。

将盖子放在顶部，让它冷却。使用紫外线辐射对板进行消毒。在从股票中划出感兴趣的真菌菌株之前，加热邦森燃烧器中的点头环，直到它变热，通过刺入阿加来冷却环。

漩涡管和条纹环穿过表面的agar最小的介质补充了适当的营养要求。在37摄氏度下孵育板两到三天。使用无菌牙签，通过轻轻触摸单个菌落将少量针叶转移到完整的介质板上。

在37摄氏度下孵育板三到四天。阿斯珀吉卢斯尼杜兰的Conidia，在无菌的1.5毫升漩涡管中收获，1.0毫升的高压灭菌蒸馏水每卷含有0.05%的体积，Tween 80，用于减少针叶团的数量。倒置阿加方法的修改版本用于在阿加中等表面成像丝状真菌。

最初发现10微升的大力涡旋锥体悬浮物，大约2倍于每毫升104细胞到15毫升的Petri菜最小介质，每卷一个重量的阿加。根据研究的发展阶段孵化实验文化。在这里，我们在30摄氏度下孵育三天。

之后，使用无菌手术刀切出一块含有菌落的阿加。在这里，我们在殖民地边缘切出一块美洲狮楔子，倒置，将阿加片放入八个井滑梯中。转移10微升的大力涡旋锥体悬浮约2倍10在井滑梯的井中，包含200微升的最小介质与适当的补充。

每次检查的时间和温度孵育。显微镜的选择取决于可用的设备。在任何情况下，设置的显微镜应包括倒置舞台、环境室或至少具有精确空气温度控制的房间。

最初预热恒温器和显微镜室，以稳定所需的温度。在这里，我们把温度定在30摄氏度。打开显微镜、扫描仪电源、激光电源和计算机，并加载成像软件。

将先前准备好的滑动放在显微镜阶段并集中注意力。查找包含隔离、不重叠的单元格或至少不过度拥挤的视图字段，以便在图像分析期间促进生长测量。选择要使用的传输光显微镜技术，并在必要时激活传输的光探测器以及荧光探测器。

设置显微镜，以所需的时间间隔获取图像，并开始时间系列采集。图像的加载、可视化和处理是通过开源图像J斐济软件完成的。首先，使用插件格式将图像导入斐济。

选择默认颜色模式和自动刻度。为了可视化时间戳和刻度栏作为叠加去分析，工具，刻度栏。设置有关秤杆宽度、高度、颜色和位置的预期参数。

去图像，属性，以显示图像属性在图像J斐济软件。观察帧间隔信息。在这里，我们使用大约15分钟的时间间隔，并按好。

然后转到图像、堆叠、标记，并将正确的信息设置为间隔。通过修改 X 和 Y 设置现场文本中的测量单元并按预览设置标签的位置。使用直方图匹配，通过选择图像、调整、漂白校正、直方图匹配，在不同帧之间进行照明校正。

出现了一个带有校正照明的新窗口。使用 MtrackJ 插件插件插件插件 MtrackJ 来跟踪不断增长的连字符提示要添加轨道，请选择工具栏中的添加按钮，然后使用鼠标的左键将第一点放在连字符提示处。时间系列将自动移动到下一帧。

要完成跟踪过程，请双击鼠标到最后一点，或按下逃生键。滚动输出表，计算连字符尖端增长的最重要列，是任何给定帧的速度。安全跟踪测量，添加文件，保存为您选择的文件格式，例如CSV，将保存的文件导入您的电子表格程序，并计算可视化和进一步测试。

按下电影按钮生成电影 RGB 颜色类型，其中包含画入其中的轨道的帧，可在任何标准多媒体播放器中可视化。按照这个协议，我们捕获并分析了与长丝真菌阿斯珀吉卢斯尼杜兰的不同生长发育阶段相对应的各种图像。图为野生类型与阿扎德三角洲 ngnA 三角洲增长率测量的比较。

azhAD 德尔塔 ngnA 三角洲是两个基因中的双重删除菌株，与两种卡西酸中添加的有毒战斗机产品 L 的排毒和同化有关。与水下液体培养物中的野生类型菌株相比，其统计学上显著降低增长率测量值。通过用固体最小介质测量这两个菌株的菌落面积，无法检测到这种生长差异。

单细胞、长期活成像对于获取细胞蛋白动力学的时空信息具有重要的价值。此协议也适用于进行长期活细胞成像。在这里，我们看到科尼迪亚共同表达GFP标记的核心艾索马尔蛋白PilA和mRFP组织H1的发芽。在这里，我们提出了一个协议，以可重复和可靠的方式分析真菌生长动力学，而无需任何来自用户的任何以前的图像分析经验。

此协议允许对真菌生长进行客观准确的量化。