Name: 分析宿主-微生物群相互作用的肠道肠道器官培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 了解肠道器官培养系统用于分析宿主-微生物群相互作用的方法。该技术结合体外和体内实验优势，在保留肠道生理学的同时实现严格的实验控制，为微生物组研究提供重要平台。

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感谢Yissachar实验室过去和现在的成员在优化肠道类器官培养系统方案中所做出的宝贵贡献。感谢Yael Laure对本文稿的审阅与修改。本工作由以色列科学基金会（资助号：3114831）、以色列科学基金会-布罗德研究所联合项目（资助号：8165162）以及以色列Gassner医学研究基金资助。

本方案遵循动物福利伦理委员会批准的动物护理指南。
1. 实验准备
<ol>
	<li>肠道类器官培养装置的制备（3天）
	<ol>
		<li>使用3D打印机打印可重复使用的塑料模具，用于器官培养装置（该装置包含6个孔，24个大小孔洞）以及装置盖（3D文件已附）。 
		注意：这些塑料模具可用于制备多种装置。</li>
		<li>插入平头针头（22 G） &amp;将18号针头（#38; 18 G）置于装置模具内的适当位置，然后浇注约20 g的聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物（基础剂与催化剂质量比为1:10），用于制作一套装置及其盖子。</li>
		<li>将模具放入真空室中抽真空30分钟，以去除PDMS混合物中的气泡。</li>
		<li>在55 °C下过夜孵育模具，以完成PDMS聚合。</li>
		<li>当PDMS固化后，从模具中拔出针头，并小心地将培养装置和盖子从塑料模具中取出。</li>
		<li>使用手术刀去除微孔边缘的PDMS残留物。将PDMS装置及其盖板用无毒硅胶粘合剂固定在盖玻片（75 mm × 50 mm显微载玻片）上，并静置过夜固化（将胶水涂于装置的光滑面）。</li>
		<li>插入12根22 G针头用于管腔，12根18 G针头用于外室。使用硅胶固定所有针头，并静置过夜使其固化。在盖子上插入两根18 G针头，以确保肠道器官培养装置内外空气流通顺畅。</li>
		<li>使用装有水的注射器检查所有针头是否泄漏。通过向孔中注水检查孔是否存在泄漏。</li>
		<li>在将连接至结肠的每根22 G针上打两个外科结。将装置和盖子放入灭菌纸袋中，并在高压灭菌器中进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基（0.5 小时）
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，将以下组分混合（置于50 mL离心管中）：37 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、10 mL KSR血清替代物、1 mL B27&#160;补充剂，0.5 mL N2补充剂，0.5 mL 1 M HEPES缓冲液，以及0.5 mL非必需氨基酸。</li>
		<li>过滤，并将完全培养基在 4 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管和手术器械准备
	<ol>
		<li>根据输入管腔、输入孔、输出管腔和输出孔的需要，截取适当长度的管子（12根短管和12根长管）。在每根管子的两端连接合适的接头。</li>
		<li>准备手术器械：直剪、4 把细镊子和 2 把尖头镊子。</li>
		<li>将试管和手术器械放入高压灭菌纸袋中，并使用高压灭菌器进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备管腔输入物（所需的刺激物——细菌、粪便、药物等）。
	<ol>
		<li>实验前，通过系列稀释法测定细菌培养物的菌量12在有氧和/或厌氧条件下培养。</li>
		<li>在计算细菌载量后，用无菌组织培养基稀释细菌培养物，以获得所需的细菌浓度。对于粪便样本，使用100 µm滤网过滤。 
		&#8203;注意：对于非细菌性刺激物（药物、代谢物等），使用肠道培养基将该物质稀释至所需浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验设置准备
<ol>
	<li>在器官培养孵育箱内，打开加热装置，并将其设定为 37 °C。</li>
	<li>安装泵系统以及输入和输出端的注射器。</li>
	<li>组织培养基输入
	<ol>
		<li>在生物安全柜或层流罩内，用完全培养基填充输入端注射器。最终体积取决于实验持续时间和流速；通常为每小时 1 mL，另需额外培养基用于冲洗。</li>
		<li>使用鲁尔锁接头将管路连接至注射器。将装满的注射器放入注射泵中。</li>
		<li>冲洗输入端注射器。确保培养基从所有管路中流出并进入废液杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腔内输入
	<ol>
		<li>用刺激物处理液（细菌、药物等）填充腔内输入端注射器。体积取决于实验持续时间和流速（通常为每小时 30 µL，另需额外液体用于冲洗）。</li>
		<li>使用鲁尔锁接头将管路连接至注射器。将装满的注射器放入注射泵中。</li>
		<li>冲洗输入端注射器。确保刺激物流体从所有管路中流出并进入废液杯中。注意避免不同刺激物之间的交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输出端
	<ol>
		<li>将空注射器放入输出端注射泵中（将泵模式设为“抽取”）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装置设置
	<ol>
		<li>调节控制气体混合物（95% O2 + 5% CO2）流速的调节阀，使气流轻柔且最小。</li>
		<li>在层流罩内检查装置。</li>
		<li>用无菌 IMDM 冲洗装置的针头，以清洗针头。</li>
		<li>向装置的每个孔中加入 500 µL 无菌培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织解剖前准备
	<ol>
		<li>将无菌手术器械放入层流罩内。</li>
		<li>用无菌 IMDM 填充一支 10 mL 注射器，并连接一根无菌（经高压灭菌）的 22 G 钝头针头，用于冲洗结肠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 器官培养
<ol>
	<li>小鼠处死与组织解剖
	<ol>
		<li>在超净工作台内，通过断头法处死12至14日龄的小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠，并将其放置在塑料培养皿上。</li>
		<li>使用锋利的剪刀和镊子解剖小鼠，从胃部至肛门完整取出消化道，切除所有脂肪和结缔组织。剪下结肠并置于新的培养皿中。 
		&#8203;注意：尽量减少与结肠组织的接触。不要触碰结肠组织的中部区域。仅在组织边缘轻柔操作，避免损伤组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结肠冲洗与清洗
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，使用已准备好的10 mL注射器（步骤2.7.2）将无菌IMDM培养基从近端注入，轻柔冲洗结肠内容物。清除肠道组织中的粪便后，将结肠放入盛有0.5 mL无菌IMDM培养基的新6孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将结肠连接至装置
	<ol>
		<li>取出组织，小心地将其连接到22 G针头上，并用两根缝线牢固结扎。此时必须确保结肠的方向正确，以匹配管腔流动方向（近端为输入，远端为输出）。对全部6个组织重复步骤3.2–3.3。</li>
		<li>确认输入针头的鲁尔锁接口内无培养基残留。如有，需排空。向输入针头的鲁尔锁接口中加入刺激液（以避免气泡进入管腔）。根据相应的刺激条件，对每个结肠重复此步骤。</li>
		<li>检查所有组织均已正确连接，并将盖子盖在装置上方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将器官培养装置连接至泵
	<ol>
		<li>将装置放入预热的温控培养室中（37 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接气体流
	<ol>
		<li>使用合适的输入针头将气体适配器连接至盖子。</li>
		<li>将输入和输出管路连接至装置。 
		&#8203;注意：将结肠的近端侧连接至输入管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用刺激液冲洗管腔
	<ol>
		<li>轻柔地将管腔刺激液流经肠道，并确认输出管路中有培养基流动。</li>
		<li>清洗外部培养基。</li>
		<li>对外部培养基进行3次清洗（将泵的流速设置为输入和输出孔均为600 µL/min）。每次清洗持续1分钟（从排空孔开始）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始实验
	<ol>
		<li>以以下流速启动泵： 
		流速：管腔：输入- 30 µL/h，输出- 35 µL/h 
		外部培养基：输入- 1000 µL/h，输出- 950 µL/h 
		&#8203;注意：实验时间可在30分钟至24小时之间变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验结束（结肠类器官培养最长可达24小时）
	<ol>
		<li>断开装置上的所有管路。</li>
		<li>将组织从针头上取下，并进行后续所需的检测分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
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<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种优化的实验方案 离体 Yissachar 等人近期开发的肠道器官培养技术（已发表）9 以及未发表数据）。肠道类器官培养系统可支持完整肠段的多重培养，同时维持管腔内液体流动。该系统可完全控制管腔内外环境（包括刺激剂量、暴露时间和流速），并保持肠道组织的原始结构及其细胞复杂性9.
方案中的关键步骤包括以下内容。（1）组织解剖应尽可能快速且轻柔地进行，以最大限度减少组织损伤（组织损伤可能导致细胞死亡以及管腔内容物通过受损部位泄漏）。（2）通过将输入端口连接至近端结肠、输出端口连接至结肠远端，以在装置中维持组织的正确方向。（3）将肠道连接至装置后，需确认组织完整，且与管腔内端口的连接处无泄漏。这可确保细菌刺激局限于管腔内，避免污染外部环境，外部环境应尽可能保持无菌状态。（4）组织应取自12–14日龄的小鼠。在更年幼的小鼠中，结肠更小且更脆弱，需采用不同的操作和培养条件（数据未显示）。而年长小鼠的组织显著更大，会影响组织存活率和培养持续时间。（5）为降低肠道反应的变...

肠道是一个高度复杂的器官，包含多种细胞类型（上皮细胞、免疫细胞、神经元等），这些细胞以特定结构排列，使细胞之间以及细胞与管腔内容物（微生物群、食物等）能够相互作用和交流。1目前，可用于分析宿主-微生物群相互作用的研究工具包包括 体外 细胞培养和 体内 动物模型2. 在体 动物模型提供了生理性的组织构建3 但实验控制较差，且对实验条件的调控能力有限。 体外 另一方面，培养系统可使用原代细胞或细胞系，并可添加微生物4，可对实验参数进行精确控制，但缺乏细胞复杂性和组织结构。现代 体外 检测方法使得能够深入利用健康与病理状态的人体组织样本，例如源自小鼠或人类的上皮类器官5,6以及模拟黏膜微环境的样本7另一个例子是“肠道芯片”检测，该检测包含人结肠上皮细胞系（Caco2）、细胞外基质和微流控通道，用以模拟肠道的生理条件8。然而，尽管其先进与创新程度 体外 无论样本如何，它们都无法维持正常的组织结构或原始的细胞组成。
为解决这一问题，Yissachar 等人近期开发了一种 离体 器官培养系统9 (图1) 保持完整的肠道片段 离体，同时受益于两者的优点 体内 和 体外 模型。这 离体 肠道类器官培养系统基于一种定制的培养装置，可同时培养六份结肠组织，支持在可比较的条件下检测实验干预的影响，同时控制系统输入与输出。近期研究表明，该系统在分析肠道对单一种类肠道细菌反应方面具有重要价值9，完整的人类微生物组样本10 和微生物代谢产物11该系统首次实现了对宿主、微生物及环境组分的高度可控，从而能够深入研究这些早期的宿主-微生物群相互作用。此外，该系统还可在实验过程中实时监测和调控整个体系。
<img alt="肠道芯片示意图；分析转录、流式细胞术、组织学和微生物培养。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：肠道培养装置示意图。 一段完整的肠道组织片段连接在腔室的输出端和输入端口（顶部），通过泵调节管腔内和外部培养基腔室中的培养基流动。整个装置（底部）包含6个这样的腔室。该图经Yissachar等（2017）修改而来。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18号钝针</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22号钝针</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>通用密封胶 100%硅酮</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>立方真空干燥器 VDC-21+ 2层搁板</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>1 mm厚玻璃载片</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>迷你培养箱 im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E 真空泵</td><td></td><td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>塑料快旋式管接头插头</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>塑料快旋式管接头插座</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体</td><td>Dow</td><td></td><td>聚二甲基硅氧烷，PDMS</td></tr><tr><td>管路</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE，Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 材料：z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（50倍浓度），无血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液（1 M）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的Iscove改良Dulbecco培养基（1倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂（100倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大剪刀</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>F.S.T</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>编织丝线手术缝合线</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>直剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;器官系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 鲁尔锁注射器</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough体视显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>循环式精密空气加热器 &quot;CUBE&quot;</td><td></td><td>CUBE-2-LIS</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>new era pump systems inc</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

肠道组织的结构促进了宿主与肠道微生物群之间密切且互惠的相互作用。这些相互对话对于维持局部和全身的稳态至关重要；肠道微生物群组成的变化（即菌群失调）与多种人类疾病相关。研究宿主-微生物群相互作用的方法在保留生理组织结构（如使用体内动物模型）与实验因素的可控程度（如简单的体外细胞培养系统）之间存在固有的权衡。为解决这一权衡问题，Yissachar 等人近期开发了一种肠道类器官培养系统。该系统既保留了天然结肠组织的结构和细胞机制，又实现了严格的实验控制，便于开展难以在体内直接进行的实验。该系统非常适合研究肠道各组分（如上皮、免疫和神经元件）对管腔扰动（包括厌氧或需氧微生物、来自小鼠或人类的完整微生物群样本、药物和代谢物）的短期反应。本文详细描述了一种利用定制肠道培养装置对多个肠道片段进行类器官培养的优化方案。通过组织切片或整体组织片段的免疫荧光染色、荧光原位杂交（FISH）或延时成像，可直观观察宿主对管腔扰动的反应。该系统支持多种检测手段，包括高通量测序、流式细胞术以及多种细胞和生化检测。总体而言，这一三维类器官培养系统可支持大块完整肠道组织的培养，在局部肠道环境中对宿主-微生物群相互作用进行高分辨率分析和可视化方面具有广泛的应用前景。

肠道类器官培养系统维持组织活力 离体 组织活力的评估贯穿整个培养过程。结肠组织碎片在肠道器官培养系统中孵育，并在培养2/12/24小时后固定。通过E-cadherin和细胞角蛋白-18抗体的免疫荧光染色验证肠上皮细胞（IEC）层的完整性。同时，检测结肠上皮中充满黏液的杯状细胞以及管腔内的黏液分泌情况，并通过Ki-67染色标记结肠隐窝中增殖的IEC细胞以评估其增殖活性。图2）。这些结果及其他研究结果9 表明肠道培养系统可维持肠道功能与结构 离体.
肠道定植分段丝状细菌（SFB）可触发宿主快速的转录反应。本研究采用两种不同的免疫调节性肠道微生物定植，以探究肠道内初始事件的发生。主要使用的微生物为分段丝状细菌（SFB），该菌此前已被证实可诱导小肠中Th17细胞的分化。13无SFB的SPF小鼠处死后，解剖获取小肠（SI）片段（回肠），并连接至肠道器官培养系统。由于SFB难以培养 体外...

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。

肠道组织的结构促进了宿主与肠道微生物群之间密切且互利的相互作用。这些双向交流对于……至关重要

肠道器官培养系统结合了体外和体内实验方法的优势，因此可作为从简单的体外实验过渡到复杂的体内实验之间的中间实验步骤。该技术的主要优势在于既能实现对实验条件的严格控制，又能保持肠道的生理状态。该方法有助于在对宿主、微生物及环境组分进行高度可控的条件下，深入分析肠道对特定刺激的响应。演示该实验操作的是我实验室的硕士研究生 Alon Shemesh 和实验室主管 Dr. Sivan Amidror。首先，将平头针插入装置模具中相应的位置，然后浇注约 20 克聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）或 PDMS 混合物，用于制作一套装置及其盖子。将模具放入真空室中抽气 30 分钟，以去除 PDMS 混合物中的气泡，随后在 55 摄氏度下孵育模具过夜，以完成 PDMS 的聚合反应。当PDMS固化后，从模具中拔出针头，并小心地将培养装置及盖子从塑料模具中取出。使用手术刀清除孔洞边缘的PDMS残留物。将PDMS装置及其盖子用无毒硅胶粘合剂固定在75 × 50毫米的盖玻片上，并将组件静置过夜使其完全固化。将胶水涂在装置的光滑面一侧。使用12号、22号针头插入管腔，使用12号、18号针头插入孔腔。用硅胶固定所有针头，并静置过夜使其固化。排出输入注射器中的液体，并确保灌注液从所有管道流出并进入废液杯中；随后再次排出输入注射器中的液体，确保刺激物从所有管道流出并进入废液杯中，注意避免不同刺激物之间发生交叉污染。处死小鼠后，使用锋利的剪刀和镊子进行解剖，从胃部至肛门完整取出消化道，过程中需剪除所有脂肪和结缔组织。剪下结肠并将其置于新的培养皿中。轻轻握住组织边缘，尽量减少接触。在解剖显微镜下进行结肠冲洗。按照文中所述，使用已准备好的10毫升注射器，以无菌IMDM轻柔冲洗结肠内容物。将粪便从肠组织中移除后，将结肠置于含有 0.5 毫升无菌 IMDM 的新六孔板中。接着，取结肠组织并小心地将其连接到 22 号针头上，用两根线打紧结固定。保持结肠相对于管腔流动的正确方向，使近端和远端分别对应输入和输出。对所有组织重复进行结肠冲洗和结扎针头操作。将输入和输出管路连接至设备，然后以设定的流速启动泵，开始实验。通过KI67染色显示，检测到结肠上皮中充满黏液的杯状细胞以及肠腔内的黏液分泌，同时可见结肠隐窝中增殖的肠上皮细胞（IEC）。这些结果表明，肠道培养系统能够在体外维持肠道的功能和结构。在分段丝状细菌（SFB）引入两小时后，通过荧光原位杂交技术检测到典型的 SFB 丝状结构与小肠绒毛紧密关联。此外，透射电子显微镜显示 SFB 位于小肠上皮刷状缘数微米范围内。在用SFB灌注两小时后，对全组织样本进行了三次重复的基因表达谱分析。对照组培养物则灌注无菌小鼠或单一定植脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）小鼠的粪便悬液。与无菌对照组相比，SFB诱导的这些变化幅度主要较小。结肠的方位非常重要。在将结肠固定到针上时需格外小心。正确的结扎可防止肠腔内容物污染孔板。多种读出技术均可采用本方案，例如下一代测序、成像、细胞分选等。这些读出技术为揭示宿主与微生物组在健康和疾病状态下的相互作用提供了新的见解。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

分析宿主-微生物群相互作用的肠道肠道器官培养系统

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp.

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通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

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该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

了解肠道器官培养系统用于分析宿主-微生物群相互作用的方法。该技术结合体外和体内实验优势，在保留肠道生理学的同时实现严格的实验控制，为微生物组研究提供重要平台。

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

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