标记细胞外囊泡以监测软骨外植体的迁移和摄取

这种简单的协议允许人们标记EV并通过共聚焦显微镜对其进行监测。例如，当EV成像用于治疗时，它可能有助于评估EV分布。该技术允许人们轻松监测软骨外植体中的EV迁移和摄取，使用共聚焦显微镜，没有任何特殊功能。

相同的方案可用于EV进行体外或体内实验。确保事先准备好色谱柱，并且EV的初始体积足以达到所需的最终颗粒浓度，考虑到在纯化步骤中将损失约10%的颗粒。首先浓缩细胞外囊泡或EV样品和对照。

将样品置于15毫升或500微升浓缩管中，具体取决于EV样品的起始体积。根据制造商的说明离心管，直到获得几乎干燥的样品。用200微升重新悬浮浓缩的EV样品，用100微升稀释剂C重新悬浮对照组，并将其转移到新的1.5毫升离心管中。

将EV样品分成两个等分试样，每个等分试样各100微升。用染料标记其中一个等分试样，并将其用作处理。将另一个保留为未标记，但像EV样品一样处理它，并使用它通过纳米颗粒跟踪分析来量化EV浓度。

制备2x染料溶液，使得稀释剂C中所得的PKH26溶液的浓度为8微摩尔。在样品中每125微升稀释剂C混合一微升1毫摩尔PKH26接头。准备以1:1的比例添加到样品中所需的体积。

将2x染料溶液加入PKH血小板裂解物衍生的EV中，并以1:1的比例控制样品，以达到1x染料浓度和4微摩尔PKH26浓度。将相同体积的PBS加入NTA血小板裂解物衍生的EV样品中。在室温下孵育五分钟。

以1:1的比例向样品中加入5%牛血清白蛋白-PBS溶液，并确保最终体积约为400微升。继续将标记的EV与未结合的染料和与色谱柱的非特异性染料相互作用分离。从色谱柱上取下盖子，加入400微升PKH血小板裂解物衍生的EV，NTA血小板裂解物衍生的EV，或对照并丢弃所有洗脱的液体。

等待样本完全进入列，然后再继续下一步。加入600微升PBS并丢弃所有洗脱的液体。等待 PBS 完全进入列，然后再继续执行下一步。

加入600微升PBS，并在1.5毫升离心管中收集600微升的一小部分。对于新色谱柱，重复涉及方案开始时提到的样品浓度的步骤。向色谱柱中加入600微升先前洗脱的EV，并丢弃洗脱的体积。

然后加入400微升PBS并丢弃所有洗脱体积。向色谱柱中加入600微升PBS，并在1.5毫升离心管中收集600微升的馏分。用PBS清洗软骨两次，并在无菌条件下使用直径为3毫米的活检孔将其切除。

将外植体置于具有DMEM-F12培养基的96孔培养板中，在37摄氏度，5%CO2和80%湿度下补充1%青霉素链霉素。为了建立炎症驱动的OA模型，用每毫升10纳克的癌抑素M和每毫升2纳克的肿瘤坏死因子-α补充细胞培养基。在补充了癌抑素M和肿瘤坏死因子-α的细胞培养基中，用每孔PKH血小板裂解物衍生的EV或对照物1倍10至第9个颗粒处理外植体。

从含有软骨外植体的96孔细胞培养板中取出培养基。如手稿中所述，向每个孔中加入200微升的细胞培养基。每小时停止一次体外检测，从零小时到五小时。

用200微升PBS洗涤含有软骨外植体的细胞培养孔两次。向组织中加入100微升4%多聚甲醛，在四摄氏度下固定三小时。除去PFA，加入100微升PBS，将固定组织储存在4摄氏度，并在48小时内处理样品。

在不同时间点拍摄的图像显示了EV如何进入组织，直到它们到达软骨细胞，并随着时间的推移进入软骨细胞。经过一小时的孵育后，标记的EV已经局限于软骨细胞周围。确保EV的初始体积足以达到所需的最终颗粒浓度。

要记住的另一件重要事情是在接下来的24小时内使用带有标签的电动汽车。如果在24小时内不使用，可能会降低荧光。这项技术将帮助研究人员改进电动汽车成像，并在生物学和治疗学中研究电动汽车。