Name: 标记细胞外囊泡以监测软骨外植体的迁移和摄取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜标记和监测血小板裂解液来源的细胞外囊泡在软骨外植体中的迁移与摄取。该方法为骨关节炎研究提供了有效的细胞外囊泡成像工具，适用于体外和体内实验。

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本研究由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）资助，并由欧洲社会基金（ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助（项目编号：MS16/00124；CP16/00124）；由“人才提升”项目（TALENT PLUS）中的“青年计划”（PROGRAMA JUNIOR）资助（项目编号：JUNIOR01/18），该计划由巴利阿里群岛可持续旅游税提供资金；由巴利阿里政府研究厅（Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear）资助（项目编号：FPI/2046/2017）；由FUTURMed框架下的FOLIUM博士后项目（FOLIUM 17/01）资助，该项目50%资金来自巴利阿里群岛可持续旅游税，50%来自欧洲社会基金（ESF）；以及由巴利阿里群岛血液与组织库基金会教学与研究委员会（Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears）资助（项目编号：CDI21/03）。

注意：软骨组织外植体来自 IdISBa 生物样本库（IB 1995/12 BIO），该项目已获得 CEI-IB（IB 3656118 PI）的伦理批准，并遵循机构指南获取。
1. 柱层析柱的制备
<ol>
	<li>按照制造商的说明或以下步骤平衡层析柱：
	<ol>
		<li>取下层析柱帽，对层析柱进行平衡，并通过洗脱去除保存缓冲液。</li>
		<li>用 2.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤层析柱 3 次。每次洗涤时，等待层析柱完全吸收全部体积。 
		&#8203;注意：切勿让层析柱变干。</li>
		<li>最后一次洗涤后，用帽盖住层析柱，直至进行样品制备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞外囊泡标记
注意：本实验所用的细胞外囊泡（EV）标记方案，采用的是先前通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离得到的PL-EV样本，分离条件如前所述21,22。然而，本方案适用于任何来源的EV样本。
<ol>
	<li>使用浓缩管浓缩EV样本和对照样本（PBS）。
	<ol>
		<li>根据EV样本的起始体积，将样本置于15 mL或500 µL的浓缩管中。按照制造商的说明进行离心，直至获得几乎干燥的样本。 
		注意：需要设置对照样本以检测染料背景信号。尽管本方法对初始体积无特殊要求，但应考虑到在纯化步骤中约有10%的颗粒会损失。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用稀释液C重悬浓缩后的样本。将EV样本用200 µL重悬，对照组用100 µL重悬，并转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将浓缩的EV样本分为两份，每份100 µL。其中一份标记染料，作为处理组（PKH-PL-EV）；另一份不标记，但与EV样本同样处理（NTA-PL-EV），用于通过NTA定量EV浓度。</li>
	<li>配制2倍浓度的染料溶液，得到在稀释液C中浓度为8 µM的PKH26溶液。</li>
	<li>在样本中，按每125 µL稀释液C加入1 µL的1 mM PKH26连接剂的比例混合。准备足够体积，以便以1:1比例加入样本中。</li>
	<li>以1:1比例向PKH-PL-EV样本和对照样本中加入2倍浓度的染料溶液，使最终染料浓度为1倍，PKH26浓度为4 µM。向NTA-PL-EV样本中加入等体积的PBS。室温孵育5分钟。</li>
	<li>以1:1比例向样本中加入5%牛血清白蛋白-PBS溶液，确保最终体积约为400 µL。 
	注意：此步骤可去除非特异性染料相互作用或未结合的游离染料。</li>
	<li>继续通过层析柱分离标记的EV与未结合的染料及染料的非特异性结合物。</li>
</ol>
3. 标记EV的分离
<ol>
	<li>取下层析柱的盖子，加入 400 µL 样品（PKH-PL-EV、NTA-PL-EV 或对照），弃去所有流出液体。</li>
	<li>等待样品完全进入层析柱后，再进行下一步操作。加入 600 µL PBS，弃去所有流出液体。</li>
	<li>等待 PBS 完全进入层析柱后，再进行下一步操作。加入 600 µL PBS，并在 1.5 mL 离心管中收集 600 µL 的洗脱组分（EVs 或对照）。 
	注意：这些步骤用于去除样品中过量的染料。需要再次进行柱分离以获得更纯的 EVs。因此，后续步骤应在新的平衡柱（步骤 4.1）或经过初步洗涤后的同一根柱子（步骤 4.2）中进行。</li>
	<li>准备层析柱以进行新的 EV 分离步骤，以获得更纯的 EVs。若使用新柱子，请重复步骤 2.1 和 2.2；若使用同一根柱子，则先用 2.5 mL 20% 异丙醇洗涤柱子，然后重复步骤 2.1 和 2.2。</li>
	<li>将步骤 2.5 中先前洗脱得到的 600 µL EVs 加入柱子中，并弃去流出体积。等待液体完全进入柱子后，再进行下一步操作。</li>
	<li>加入 400 µL PBS，并弃去所有流出体积。等待液体完全进入柱子后，再进行下一步操作。</li>
	<li>加入 600 µL PBS，并在 1.5 mL 离心管中收集 600 µL 的洗脱组分。将 EVs 和对照样品用于后续分析，或在 4 ᵒC 下保存过夜。</li>
	<li>将使用过的层析柱保存以备将来使用。
	<ol>
		<li>用 25 mL 20% 异丙醇洗涤柱子，并弃去流出体积。再用 2.5 mL PBS 洗涤柱子 3 次。</li>
		<li>加入步骤 1.1.1 中移除的保存缓冲液，等待缓冲液完全进入柱子。盖上柱子盖子，并在 4 ᵒC 下保存至下次使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞外囊泡定量
<ol>
	<li>按照以下两个步骤，用 PBS（经 0.2 µm 滤膜过滤）将 NTA-PL-EV 样品和初始 PL-EV 样品分别稀释至 1:1,000。
	<ol>
		<li>用经 0.2 µm 滤膜过滤的 PBS 制备 1 mL 的 1:10 稀释 NTA-PL-EV 样品和 1 mL 的 1:10 稀释初始 PL-EV 样品。</li>
		<li>用经 0.2 µm 滤膜过滤的 PBS 将上述已稀释的样品进一步稀释 1:100，制备 1 mL 稀释液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌注射器将 1:1,000 稀释的 NTA-PL-EV 样品或初始 PL-EV 样品注入 NTA 泵中。按照仪器制造商的说明和建议进行颗粒浓度和粒径分布的测定。 
	&#8203;注意：由于 EV 浓度取决于起始样品体积，可能需要检测中间稀释度并进行调整，以获得准确的 NTA 测定结果。</li>
</ol>
5. 用于治疗炎症驱动型骨关节炎的EVs
<ol>
	<li>用 PBS 清洗软骨两次，并在无菌条件下使用直径为 3 mm 的活检打孔器切除软骨。 
	注意：步骤5.1至5.6需在细胞培养超净台中进行。</li>
	<li>将外植体置于含有添加了1%青霉素-链霉素的DMEM-F12培养基的96孔培养板中，在37 ᵒC、5% CO₂条件下培养2，以及80%的湿度。
	<ol>
		<li>为建立炎症驱动的骨关节炎模型，在细胞培养基中添加10 ng/mL的抑癌素M和2 ng/mL的肿瘤坏死因子-α（TNFα）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 1 × 10 处理外植体9 添加含有标记的细胞外囊泡（PKH-PL-EV）或对照物的细胞培养基，每孔颗粒数为指定数量，并补充oncostatin M和TNFα。 
	注意：测量含有 1 × 10 的样品体积9 每孔粒子数及对照组使用的体积保持相同。</li>
	<li>从含有软骨外植体的96孔细胞培养板中移除培养基。向每孔加入200 µL步骤5.3中所述的细胞培养基。 
	注意：如果 96 孔板曾接触胎牛血清（FBS），需用 200 µL PBS 每孔洗涤三次，以去除 FBS 中的细胞外囊泡（EVs）。</li>
	<li>停止 体外 在不同时间点进行检测：0、1、2、3、4 和 5 h。</li>
	<li>用 200 µL PBS 将含有软骨外植体的细胞培养孔洗涤两次。</li>
	<li>向组织中加入100 µL 4%多聚甲醛（PFA），于4 ᵒC固定3小时。 
	&#8203;注意：涉及多聚甲醛（PFA）的操作步骤应在通风橱中进行，并遵循安全数据表（Safety Data Sheet）的建议。</li>
	<li>去除PFA，加入100 µL PBS，将固定后的组织于4 °C保存，并在48 h内处理样品。</li>
</ol>
6. 显微镜样品制备与观察
注意：该组织学实验步骤包括脱水、石蜡包埋和复水过程。这些步骤可能会降低染料的整体荧光强度（PKH26 产品说明书提到的局限性之一）。因此，对于通过共聚焦显微镜观察细胞外囊泡（EV），其他实验方法（如冷冻切片）可能更为合适。
<ol>
	<li>将固定组织包埋于石蜡块中，切成 6 µm 厚的切片。</li>
	<li>脱去组织切片中的石蜡。 
	注意：所有使用二甲苯的步骤均应在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>将组织切片依次浸入二甲苯 30 分钟、100% 乙醇 2 分钟、96% 乙醇 2 分钟、75% 乙醇 1 分钟，最后浸入蒸馏水中 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组织切片进行通透处理。
	<ol>
		<li>配制 0.1% Triton-0.1% 柠檬酸钠溶液用于组织通透。每张组织切片上加 20 µL，室温孵育 10 分钟。每张切片用 20 µL PBS 洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在载玻片上滴加含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂，覆盖来自步骤 6.3.1 的含 3 个组织切片的载玻片。</li>
	<li>将载玻片于室温避光孵育过夜。</li>
	<li>4 °C 避光保存，直至进行共聚焦显微镜观察。</li>
</ol>

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<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
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<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

细胞外囊泡（EV）成像有助于理解EV的特性，例如其释放和摄取机制。通过成像可监测EV在体内的生物分布，并表征其作为药物载体的药代动力学特性。然而，由于EV体积微小，对其进行成像和追踪可能具有挑战性，尽管目前已开发出多种成像设备和标记技术，以帮助研究人员在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下监测EV23,24,25。
通过光学显微镜追踪细胞外囊泡（EVs）存在两种可能的方法：生物发光成像和荧光成像。这两种方法均用于在可见光光谱范围（390–700 nm）内检测EVs。生物发光是一种化学发光，由荧光素酶催化其底物氧化后产生。尽管该信号的检测需要超灵敏的电荷耦合器件（CCD）相机，但由于无需外部光源激发，其信噪比较高26。
荧光成像利用蛋白质或有机...

骨关节炎（OA）是一种关节退行性疾病，表现为关节软骨细胞外基质进行性且不可逆的炎症与破坏1。尽管多种类型的关节炎已有多种治疗方法2,3,4，但这些方法常受限于副作用和疗效有限。利用自体软骨细胞移植的组织工程技术已常规应用于早期OA软骨损伤的再生治疗4。基于细胞的治疗策略主要受限于表型稳定的软骨细胞或软骨祖细胞数量有限，难以有效修复软骨3。因此，开发新的治疗策略以阻止疾病进展并促进大面积软骨损伤的再生具有重要意义。
不同作者已提出将细胞外囊泡（EVs）作为骨关节炎（OA）的治疗方法5,6。EVs 是由大多数细胞类型分泌的膜性结构，参与细胞间信号传导，并已被证明可介导干细胞的治疗作用7,8,9，因此近年来在再生医学领域引起了广泛关注10。来源于间充质基质细胞（MSCs）的EVs是目前针对OA研究最主要的治疗性EVs，尽管也有使用其他关节相关细胞作为EV来源的报道，例如软骨祖细胞或免疫细胞11,12。
血小板浓缩物（如血小板裂解物，PLs）因其含有的细胞外囊泡（EV）成分可能对促进不同类型的损伤修复具有作用，已被用于改善角膜溃疡13,14,15或肌腱组织再生16等疾病的愈合过程17。一些针对关节相关疾病的研究将血小板来源的细胞外囊泡（PL-EVs）作为治疗手段，以缓解骨关节炎症状。PL-EVs可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖和细胞迁移18，促进骨关节炎软骨细胞中软骨生成标志物的表达19，或在经PL-EVs治疗的骨关节炎兔模型中表现出更高的软骨生成蛋白水平和更少的组织异常18。
EVs 含有可释放至靶细胞的蛋白质、脂质和核酸，介导细胞间通讯，这是与其治疗应用相关的主要特性20。EVs 的作用取决于其到达细胞并随后释放所携带的物质。这种效应可通过细胞发生的变化间接验证，例如代谢活性或基因表达的改变。然而，这些方法无法直观显示 EVs 如何到达细胞并发挥功能。因此，本文介绍了一种标记来源于 PL 的 EVs 的方法，用于治疗炎症诱导的骨关节炎软骨组织外植体。采用共聚焦显微镜对 EVs 被软骨组织外植体中软骨细胞摄取及后续转运的过程进行监测，时间跨度为 5 小时。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>SPL生命科学</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器 BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>用超纯水配制至20%</td></tr><tr><td>96孔培养板</td><td>SPL生命科学</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇 Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>用于使用 Milli-Q 水配制 96% 和 75% 乙醇</td></tr><tr><td>3 mm 带推杆活检穿刺针</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>牛血清&amp;nbsp;白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>用PBS配制为5%</td></tr><tr><td>软骨外植体</td><td>IdISBa 生物样本库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Nanosep 100 kD Omega 浓缩管</td><td>帕尔</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>500 离心管浓缩法 &amp;micro;L Nanosep 100 kD Omega</td><td>帕尔</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX 培养基</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>包埋的石蜡组织块</td><td>IdISBa 生物样本库</td><td></td><td>按服务收费</td></tr><tr><td>Exo-Spin mini-HD 柱</td><td>细胞导向系统</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 微切片刀片</td><td>羽毛</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>人肿瘤素M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>配制储备液，使其终浓度为 0.1 &amp;micro;克/&amp;micro;L 用 PBS-0.1% BSA 稀释</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>用 PBS 配制成 4% 溶液，4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 和 Dliuent C 包含在内</td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&amp;alpha;</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>210-TA-005</td><td>配制储备液，使其终浓度为 0.01 &amp;micro;克/&amp;micro;L 用 PBS-0.1% BSA 稀释</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用 Milli-Q 水配制 0.1% Triton-0.1% 柠檬酸钠溶液</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 转子</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>马尔文</td><td>NS300</td><td>嵌入式激光装置 &amp;lambda;= 532 nm 和相机 sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 手动切片机</td><td>赛默飞世尔科技&amp;trade;</td><td>A78100101</td><td></td></tr><tr><td>TCS-SPE 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

用于监测软骨组织外泌体迁移与摄取的标记方法

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

细胞外囊泡（EVs）因其携带源自细胞来源（如血小板裂解物，PL）的内容物，被广泛应用于各类研究，以验证其作为无细胞治疗手段的潜力。作为治疗剂使用时，EVs 预期可进入靶细胞并引发相应的生物学反应。本研究探讨了源自血小板裂解物的 EVs 作为骨关节炎（OA）无细胞治疗策略的可行性。为此，建立了一种标记 EVs 并检测其在软骨组织外植体中摄取情况的方法。源自 PL 的 EVs 使用脂溶性染料 PKH26 进行标记，经柱层析纯化洗涤两次后，用于后续实验 体外 炎症驱动的&#160;在通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行颗粒定量后，建立OA模型并持续观察5小时。每小时将软骨组织块固定、石蜡包埋，并切成6 µm厚的切片，置于载玻片上，随后在共聚焦显微镜下观察。该方法可用于验证此期间内EVs是否进入靶细胞（软骨细胞），并分析其直接作用。

EV标记及摄取监测的示意图见图1。表1中通过NTA检测到的颗粒浓度和EV大小显示，由于使用柱子标记后进行了两次纯化步骤，EV浓度在过程中有所下降。然而，所获得的量仍处于用于治疗时所需颗粒数的最佳范围内。该颗粒浓度用于计算用于处理骨关节炎软骨外植体的PKH-PL-EV及对照的体积。
在软骨外植体经EVs处理或对照组处理后，分别固定不同时间：0、1、2、3、4和5 h。随后对各组样本进行石蜡包埋、切片，并用含DAPI的封片剂进行封片，以备共聚焦显微镜观察。每个时间点各组的代表性图像见图2，显示EVs随时间推移进入组织并最终到达软骨细胞并进入其中的过程。
如图所示 图2，经标记的EVs在孵育1小时后已定位于软骨细胞（DAPI染色显示为蓝色）周围（PKH26染料显示为红色）。对照组中可见少量背景荧光，该组未添加EVs，但其余...

本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。

细胞外囊泡（EVs）因其携带源自母体细胞的生物活性物质，在多项研究中被用于验证其作为无细胞治疗手段的潜力……

该简单方案可实现对细胞外囊泡（EVs）的标记，并通过共聚焦显微镜对其进行监测。例如，在将EVs用于治疗应用时，EV成像可能有助于评估其分布情况。该技术可轻松通过共聚焦显微镜监测EV在软骨组织外植体中的迁移与摄取过程，无需任何特殊功能。相同的方案可用于体外或体内实验中的细胞外囊泡（EV）。确保预先准备好层析柱，并且EV的初始体积足够，以达到所需的最终粒子浓度，因为在纯化步骤中约有10%的粒子会损失。首先浓缩细胞外囊泡（EV）样品及对照样本。根据EV样本的起始体积，将样品置于15毫升或500微升浓缩管中。按照制造商的说明离心，直至获得几乎干燥的样品。用200微升稀释液C重悬浓缩后的EV样品，对照组则用100微升稀释液C重悬，并转移至新的1.5毫升离心管中。将EV样品分为两份，每份100微升。将其中一份用染料标记，作为处理组；另一份保持未标记，但与其他EV样品同样处理，用于通过纳米颗粒追踪分析定量EV浓度。配制2倍浓度的染料溶液，使PKH26溶液在C稀释液中的终浓度为8微摩尔。在样品中，每125微升C稀释液加入1微升1毫摩尔的PKH26连接剂。根据样品所需，按1:1比例配制相应的体积。按1:1比例向PKH血小板裂解物来源的EVs样品及对照样品中加入2倍染料溶液，使终浓度为1倍染料浓度和4 µM PKH26。向NTA血小板裂解物来源的EV样品中加入等体积的PBS。室温孵育5分钟。以1:1的比例向样品中加入5%牛血清白蛋白-PBS溶液，确保最终体积约为400微升。接下来通过层析柱分离标记的EVs与未结合的染料及非特异性染料相互作用。取下层析柱帽，加入400微升PKH血小板裂解物来源EVs、NTA血小板裂解物来源EVs或对照样品，并弃去所有流出液体。等待样品完全进入柱子后，再进行下一步操作。加入 600 微升 PBS，弃去所有流出液体。等待 PBS 完全进入柱子后，再进行下一步操作。加入 600 微升 PBS，并在 1.5 毫升离心管中收集 600 微升的洗脱组分。对于新柱子，重复本实验方案开头提到的样品浓缩步骤。向柱子中加入 600 微升先前洗脱的 EVs，并弃去洗脱体积。然后加入 400 µL PBS，弃去所有洗脱液。向柱中加入 600 µL PBS，并在 1.5 mL 离心管中收集 600 µL 的洗脱组分。用 PBS 清洗软骨两次，并在无菌条件下使用直径为 3 mm 的活检打孔器切除软骨。将外植体置于含DMEM-F12培养基的96孔培养板中，培养基中添加1%青霉素-链霉素，于37摄氏度、5%二氧化碳及80%湿度条件下培养。为建立炎症驱动的骨关节炎模型，在细胞培养基中添加10纳克/毫升的抑癌素M和2纳克/毫升的肿瘤坏死因子-α。用含抑癌素M和肿瘤坏死因子-α的培养基处理外植体，每孔加入1×10⁹颗粒的PKH血小板裂解物来源的细胞外囊泡，或设对照组。移除含有软骨外植体的96孔细胞培养板中的培养基。按照文稿中的描述，向每孔加入200 µL细胞培养基。从0小时开始，每隔1小时终止一次体外实验，直至5小时。用 200 微升 PBS 将含有软骨外植体的细胞培养孔洗涤两次。向组织中加入 100 微升 4% 多聚甲醛，在 4 摄氏度条件下固定 3 小时。去除多聚甲醛，加入 100 微升 PBS，将固定后的组织在 4 摄氏度条件下保存，并在 48 小时内处理样品。在不同时间点拍摄的图像显示了细胞外囊泡（EVs）进入组织并随时间逐渐到达软骨细胞，最终进入软骨细胞的过程。标记的EVs在孵育一小时后已定位于软骨细胞周围。确保EVs的初始体积足以达到所需的最终颗粒浓度。另一个需要注意的重要事项是，在标记外泌体后的24小时内使用。如果超过24小时未使用，可能会出现荧光减弱现象。该技术将有助于研究人员改进外泌体成像，并推动外泌体在生物学和治疗学领域的研究。

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

标记细胞外囊泡以监测软骨外植体的迁移和摄取

本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。...

植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

在本视频中，我们展示了一种用于可视化并定量细胞摄取细胞外囊泡（EVs）的实验方法。该方法利用共聚焦显微镜进行三维荧光成像，能够区分被细胞内化的EVs与黏附在细胞表面的EVs。...

细胞外囊泡摄取实验：利用三维荧光成像技术可视化与定量细胞摄取细胞外囊泡的方法

本方案描述了一种通过关节内注射，在大鼠膝骨关节炎（KOA）模型中利用远红荧光标记高效监测人脂肪来源的间充质干细胞（haMSCs）细胞存留及生物分布的方法。...

体内追踪荧光脂溶性膜染料标记的人脂肪源性间充质干细胞在大鼠膝骨关节炎模型中的分布

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

本文介绍了一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的外泌体的实验方案。...

通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

我们描述了一种使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并观察其摄取的实验方案 体外...

荧光标记小型细胞外囊泡的摄取 体外 以及在脊髓中

细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。...

细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。...

设定外泌体分离的成功分选条件

学习利用共聚焦显微镜标记和监测血小板裂解液来源的细胞外囊泡在软骨外植体中的迁移与摄取。该方法为骨关节炎研究提供了有效的细胞外囊泡成像工具，适用于体外和体内实验。

用于监测软骨组织外泌体迁移与摄取的标记方法

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