Name: 粒状棘球绦虫的短暂转导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: 了解使用第三代慢病毒载体对粒状棘球绦虫不同发育阶段进行快速短暂转导的技术。该方法为寄生虫遗传学研究提供了有效工具，有助于深入理解包虫病的致病机制并推动疾病防控研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作获得了伊朗德黑兰医学研究与发展国家研究所（NIMAD）精英研究人员资助委员会的资助，项目编号为958680。

本研究已获得国家医学研究发展研究所和研究伦理审查委员会的批准，批准编号为958680。慢病毒被归类为生物安全二级（BSL-2）生物体；因此，本方案中的所有实验室培养操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，采用无菌实验室操作并在层流罩内进行。图1展示了针对不同阶段E. granulosus的研究方案示意图。
1. 收集包虫囊肿
<ol>
	<li>从屠宰场常规屠宰的自然感染绵羊体内采集肝包虫囊肿。</li>
	<li>在吸取原头蚴（PSCs）之前，使用无菌纱布和70%酒精彻底消毒囊肿表面。</li>
	<li>将20–50 mL囊液抽出至无菌的50 mL锥形管中。</li>
	<li>排空液体后，用锋利刀片切开囊壁，将生发层转移至无菌50 mL锥形管中，并短暂振荡（约2分钟），以提高原头蚴的收集率。随后将生发层转移至新的1.5 mL离心管中，用于分子鉴定。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗原头蚴3–5次。</li>
	<li>将原头蚴置于0.1%伊红溶液中染色5分钟，于光学显微镜下观察以评估其活力。培养时应使用活力不低于95%的原头蚴。</li>
	<li>用2 mL胃蛋白酶溶液（2 mg/mL，pH 2）处理原头蚴沉淀物15–20分钟。</li>
	<li>为分离单个原头蚴，将原头蚴沉淀重悬于PBS中，并通过两层无菌纱布过滤至新的无菌50 mL锥形管中。 
	注意：使用光学显微镜对50 µL原头蚴沉淀进行三次计数，取平均值。后续实验可根据该估算值确定原头蚴浓度（个/µL）。每个包虫囊肿分离株均应通过分子方法（如PCR测序17或高分辨率熔解曲线分析18）基于核苷酸多态性进行鉴定。</li>
</ol>
2. 通过双相培养 E. granulosus 的 PSCs 以获得成虫
注意：分离的PSCs应在II级生物安全柜中的无菌条件下进行培养。在进行后续步骤之前，需分别制备双相培养基的固体相和液体相19。
<ol>
	<li>准备双相培养基，使其包含两个相。
	<ol>
		<li>固体相部分：向一个25 mL的培养瓶中加入10 mL牛血清，并在76 °C下静置凝固20-30分钟。</li>
		<li>液体相部分（改良CMRL培养基）：在260 mL CMRL-1066培养基中加入100 mL热灭活的胎牛血清（FCS）、36 mL 5%酵母提取物、5.6 mL 30%葡萄糖（溶于蒸馏水）、1.4 mL含5%犬胆汁的PBS溶液、20 mM HEPES缓冲液和10 mM NaHCO3。最后向混合液中加入青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个25 cm2培养瓶中加入10 mL液体相培养基。</li>
	<li>向培养瓶中接种约5,000个PSCs，并将培养瓶放入CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。</li>
	<li>培养24-48小时后，将PSCs转移至含有固体相（牛血清）的新培养瓶中，每瓶加入1 mL相同的新鲜液体相培养基。将培养瓶放回CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。</li>
	<li>每5-7天根据培养基颜色变化及估计的PSCs分化比例更换新鲜的液体相培养基。 
	注意：原头节在体外培养后对环境变化反应迅速，大多数会在2-3周内发生分化。由于营养物质的消耗以及原头节的生长发育，培养基的pH值发生变化，颜色逐渐变为橙色或黄色。</li>
</ol>
3. 多能干细胞的单相培养 E.&#160;granulosus
<ol>
	<li>确保在转导前 24–48 小时完成单相培养。
	<ol>
		<li>在 25 cm2 培养瓶中，使用 RPMI 培养基和 10% 胎牛血清（FBS）培养约 5,000 个 PSC。</li>
		<li>将培养瓶置于 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 病毒生产与制备的细胞培养
注意：用于载体生产的人胚胎肾293T（HEK293T）细胞购自伊朗克尔曼医科大学病理学与干细胞研究中心。
<ol>
	<li>将 5 × 105 个 HEK293T 细胞转移至含有 5 mL DMEM 培养基（含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 25 cm2 培养瓶中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 HEK293T 细胞，每 48 小时用完全培养基传代一次。最终使用低代次的 HEK293T 细胞进行转导20。</li>
</ol>
5. 使用第三代慢病毒载体进行病毒的生产与制备
注意：使用慢病毒载体 pCDH513b（转移载体）以及 PLPII、PLPI 和 PMD2G（辅助载体）来表达 GFP 报告基因。参见材料表和补充图 S1。
<ol>
	<li>第1天：
	<ol>
		<li>消化HEK293T细胞后21 在6孔培养板中接种7 × 104 每孔细胞数，加入新鲜的不含抗生素的DMEM培养基 10% FBS.</li>
		<li>使用钙磷酸盐法进行转导时，选择细胞密度为50%-60%融合度的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：
	<ol>
		<li>在实验前2-3小时，用新鲜的不含抗生素的DMEM更换细胞培养基 2% 胎牛血清.</li>
		<li>在1.5 mL离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括7 µg/µL pCDH513b（转移载体）、4 µg/µL PLPII、4 µg/µL PLPI和2 µg/µL PMD2G（辅助载体）。</li>
		<li>加入HEPES缓冲液（0.28 M NaCl，0.05 M HEPES，1.5 mM Na2HPO4；将pH值为7.00–7.28的缓冲液加入混合物中，定容至422 µL。</li>
		<li>加入16 µL的1% Tris-EDTA（TE）缓冲液至混合物中。</li>
		<li>向各管中加入 62 µL 的 2.5 mM 氯化钙，充分混匀。</li>
		<li>加入500 µL的2倍HEPES缓冲盐溶液（HBS）至混合物中， 逐滴加入，1-2 分钟内完成 使用巴斯德移液管轻轻混匀，直至获得半透明溶液，并在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>将混合物缓慢加入每块培养板中，并以缓慢的环形动作使其均匀分布。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 培养箱中孵育，并在4-6小时后更换为不含抗生素的DMEM培养基 10% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：
	<ol>
		<li>使用倒置荧光显微镜确认瞬时转导的成功及细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天：
	<ol>
		<li>从培养基中收获病毒，收集每个孔的上清液，并于 -70 °C 保存备用。 
		注意：收获的慢病毒可进行浓缩和滴定，以实现精确转导22.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用病毒对E.&#160;granulosus不同发育阶段进行瞬时转导
<ol>
	<li>第1天：
	<ol>
		<li>使用12孔培养板进行基因转导。以完全DMEM培养基作为内参，每组三复孔，接种5 × 103–5 × 104个HEK293T细胞。</li>
		<li>在RPMI加10% FBS培养基中，每组三复孔，接种150个新鲜PSCs。</li>
		<li>在含10%热灭活FBS的DMEM培养基中，每组三复孔，接种30条节片化蠕虫。 
		注意：所有转导培养基必须不含抗生素。在整个过程中，为HEK293T细胞、PSCs和节片化蠕虫各保留三个未经处理的对照孔。</li>
		<li>将1 × 106个病毒与4 µg/mL转染试剂（参见材料表）混合，用于转导HEK293T细胞及不同发育阶段的蠕虫。</li>
		<li>将混合液缓慢加入各孔中，并通过缓慢的环形运动使其均匀分布。将培养板置于CO2培养箱中孵育4–6小时（37 °C，5% CO2）。随后更换为相同的完全培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：
	<ol>
		<li>重复步骤6.1.4–6.1.5，以提高HEK293T细胞、PSCs和节片化蠕虫瞬时转导的效率。</li>
		<li>根据细胞培养基类型，在CO2培养箱中相同培养条件下继续孵育所有培养板24–48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：
	<ol>
		<li>通过荧光显微镜检测转导是否成功。 
		注意：建议在基因转导过程中采用PCR/qPCR20,23或Western blotting24等进一步的确证实验进行验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 315(2017).</li>
<li>Borhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcoses+in+Iran%2C+Turkey%2C+and+Pakistan%3A+Old+diseases+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium.</a> Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).</li>
<li>Eckert, J., Thompson, R. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+aspects+of+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Historical aspects of echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).</li>
<li>Romig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+life+cycle+patterns+of+Echinococcus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species.</a> Advances in Parasitology. 95, 213(2017).</li>
<li>Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcosis%3A+control+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcosis: control and prevention.</a> Advances in Parasitology. 95, 55(2016).</li>
<li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).</li>
<li>Tsai, I. I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomes+of+four+tapeworm+species+reveal+adaptations+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism.</a> Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).</li>
<li>Koziol, U., Brehm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Echinococcus+genomics+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research.</a> Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+hydatid+tapeworm+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).</li>
<li>Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+the+protozoan+parasite+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22International+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania.</a> International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).</li>
<li>Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transfection+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+invadens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).</li>
<li>Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Platyhelminthes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Transfection of Platyhelminthes.</a> BioMed Research International. 2015, 206161(2015).</li>
<li>Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lentiviral+vector+production+using+polyethylenimine-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection.</a> Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).</li>
<li>Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+transgenic+schistosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Establishing transgenic schistosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).</li>
<li>Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of microglial cells.</a> Glia. 50 (1), 48-55 (2005).</li>
<li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titering+lentiviral+vectors%3A+comparison+of+DNA%2C+RNA+and+marker+expression+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).</li>
<li>Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variants+within+the+genus+Echinococcus+identified+by+mitochondrial+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).</li>
<li>Rostami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+technique+for+molecular+epidemiological+studies+of+cystic+echinococcosis%3A+differentiating+G1%2C+G3%2C+and+G6+genotypes+of+Echinococcus+granulosus+sensu+lato%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato.</a> Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+morphological+consequences+of+dsRNA-induced+suppression+of+tetraspanin+mRNA+in+developmental+stages+of+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus.</a> Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).</li>
<li>Afgar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-339+and+especially+miR-766+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes+in+colorectal+cancer+cell+lines+through+DNA+methyltransferase+3B+gene+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition.</a> Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Dezaki, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+harvested+and+in+vitro+cultured+materials+from+Echinococcus+granulosus+by+measuring+expression+levels+of+five+genes+putatively+involved+in+the+development+and+maturation+of+adult+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms.</a> Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-specific+small+interfering+RNA+induces+consistent+expression+suppression+and+morphological+changes+in+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+for+parasitic+nematodes+and+platyhelminths%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths.</a> Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).</li>
<li>Elegheert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+mammalian+cells+for+fast%2C+scalable+and+high-level+production+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).</li>
<li>Mizukami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Echinococcus+multilocularis+protoscoleces+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference.</a> Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).</li>
<li>Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus+as+a+model+system%3A+biology+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus as a model system: biology and epidemiology.</a> International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).</li>
<li>Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+RCA+%22Advances+in+Parasitology%22">Advances in Parasitology</a>. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).</li>
<li>Brehm, K., Koziol, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus-host+interactions+at+cellular+and+molecular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels.</a> Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).</li>
<li>Moguel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transgenesis+of+the+tapeworm+Taenia+crassiceps%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps.</a> SpringerPlus. 4, 496(2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

了解线虫和扁形动物生物学的分子基础对于理解人畜共患寄生虫的致病性至关重要27。缺乏有效的基因评估系统是直接解读绦虫寄生虫（包括Echinococcus属物种）功能遗传学的主要障碍12,27。本研究展示了慢病毒在E. granulosus中实现瞬时转导的优异潜力。
慢病毒转导结合了瞬时转导操作简便、速度快的特点，以及稳定细胞系表达水平高的优势，可用于将外源基因递送至哺乳动物细胞28。本研究的主要目标是阐明慢病毒载体转导的操作流程，该技术将在未来的包虫病研究中发挥关键作用。 
本实验方案中需特别注意若干关键步骤。由于培养基中未添加抗生素，必须严格遵守无菌操作流程，否则在24小时后可能出现细菌和真菌污染。微生物污染会降低寄生虫的运动能力和存活率，且在72小时后，转染组和对照组的样本均将失效。
<p class="jove_c...

囊性包虫病（CE）是由绦虫引起的重要蠕虫病之一 细粒棘球绦虫， 带科内的小型绦虫1,2. 针对免疫诊断和疫苗开发的广泛研究 E. granulosus 已开展相关研究。然而，由于对寄生虫生物学的分子基础了解不足，给包虫病的诊断、治疗和预防带来了重大局限3,4,5,6.
近年来，随着基因组测序和转录组学方法的发展，多个研究团队已对扁形动物开展了广泛的分子生物学研究7,8,9。然而，在寄生虫领域，与某些原生动物已建立的高效且可重复的瞬时转导方法相比，寄生性扁形动物的基因转移技术进展仍然有限10,11,12。
在过去的二十年中，病毒递送系统已成为外源基因递送以及基因/蛋白研究的重要工具13。慢病毒能够感染分裂期和非分裂期细胞，因此可以感染终末分化不再分裂的细胞14,15,16。最近的研究证据表明，在哺乳动物细胞中使用基于慢病毒的转导系统有望克服以往基因敲入/敲低技术的大多数局限性。已有研究描述了携带适当分子标记（如GFP表达）的慢病毒表达载体的设计与构建方法16。因此，我们评估了慢病毒介导的GFP报告基因在E. granulosus原头节和链节化虫体中的瞬时转导效果。

<table><tbody><tr><td>12孔培养板</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>工作浓度：2.5&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>狗胆汁</td><td></td><td></td><td>从安乐死的犬只中分离，并通过0.2 μm滤膜除菌 &amp;mu;m 注射器滤器</td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td>配制0.1%伊红用于工作排除试验</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>热灭活&amp;nbsp;的&amp;nbsp;FBS（40℃下30分钟） &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>热灭活&amp;nbsp;的&amp;nbsp;FCS（40 中 30 分钟） &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>人胚胎肾293T细胞</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲盐水 (HBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x 浓缩液</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU</td><td>工作浓度：100 IU/mL</td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>罗氏</td><td>10108057001</td><td>工作浓度：2 mg/mL，pH 2</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td><td>该试剂在去离子水中不到1分钟内溶解。</td></tr><tr><td>Polybrene（转染试剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>工作浓度：100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>第三代慢病毒质粒（pCDH513b）</td><td>SBI System Biosciences（BioCat GmbH）</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>转移载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）</td></tr><tr><td>第三代慢病毒质粒（pLPI 和 pLPII）</td><td>Invitrogen（Life Technologies）</td><td>K4975-00</td><td>辅助载体（购自伊朗马什哈德市伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）</td></tr><tr><td>第三代慢病毒质粒（pMD2G）</td><td>Addgene</td><td>质粒 12259</td><td>辅助载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）</td></tr><tr><td>Tris/EDTA缓冲液（TE）</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x 工作液（pH 7.4）&amp;ndash;7.6)</td></tr></tbody></table>

echinococcus granulosus 棘球蚴小体的瞬时转导

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

囊性包虫病，又称棘球蚴病，是由寄生于犬类肠道的小型绦虫Echinococcus granulosus引起的重要人畜共患寄生虫病之一。目前迫切需要开展应用性遗传学研究，以阐明其致病机制并实现疾病的控制与预防。然而，由于缺乏有效的基因评估系统，阻碍了对包括Echinococcus属在内的绦虫寄生虫功能遗传学的直接解读。本研究展示了慢病毒介导的瞬时转导技术在E. granulosus的中绦期和节片化虫体中的应用潜力。从棘球囊肿中分离原头节（PSCs），并转移至特定的双相培养基中，诱导发育为节片化成虫。将收获的第三代慢病毒颗粒用于感染这些虫体，同时以HEK293T细胞作为转导过程的对照。在感染后24小时和48小时，在节片化虫体中检测到明显的荧光信号，表明E. granulosus中实现了慢病毒介导的瞬时转导。本工作首次尝试在绦虫中应用基于慢病毒的瞬时转导技术，展示了具有前景的研究成果，有望为扁形动物生物学的实验研究提供新的技术路径。

在此，我们介绍一种快速高效的瞬时转导技术 E. granulosus 通过使用第三代慢病毒载体。我们采用双相培养基培养PSCs以获得横裂体虫，方法如前所述25,26原头蚴在6周后发育为链状节片虫 体外不同发育阶段 E. granulosus 在双相培养基中观察到内陷的PSCs（图2A），外翻的PSCs（图2B），以及具有第一和第三节片体节形成的节片虫图2C-E）。分别从单相和双相培养物中获得的原头节和链节化蠕虫，用表达GFP的慢病毒进行转染（图3). 为避免自发荧光的干扰，将显微观察结果与所有三组样本的背景荧光进行比较，所有荧光信号高于背景水平的样本均被视为转染成功...

我们介绍了一种在不同发育阶段快速进行瞬时转导的技术 细粒棘球绦虫 使用第三代慢病毒载体。

Echinococcus granulosus 棘球蚴小体的瞬时转导

囊性包虫病或称棘球蚴病，是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）引起的一种最重要的动物源性寄生虫病，该虫是一种小型绦虫……

细粒棘球绦虫的节片化形态的瞬时转染。我们描述了一种利用第三代慢病毒载体对细粒棘球绦虫不同发育阶段进行快速瞬时转导的技术。囊型棘球蚴病，又称包虫病，是由寄生于犬类肠道内的小型绦虫——细粒棘球绦虫引起的人畜共患寄生虫病中最为重要的疾病之一。迫切需要开展应用遗传学研究，以阐明发病机制以及疾病防控的机理。然而，由于缺乏有效的基因评估系统，阻碍了对包括棘球绦虫属（Echinococcus species）在内的绦虫寄生虫功能遗传学的直接解读。相较于原生动物寄生虫，寄生性扁形虫的基因转移技术进展仍然十分有限。在过去的二十年中，病毒递送系统已成为外源基因递送及基因/蛋白研究的重要工具。因此，我们评估了慢病毒介导的GFP报告基因对细粒棘球绦虫原头节和链体虫的瞬时转导效果。图1展示了针对细粒棘球绦虫不同发育阶段的研究方案示意图。第一步，收集包虫囊肿。从屠宰场常规屠宰的自然感染绵羊肝脏中采集包虫囊肿。在吸出原头蚴之前，使用无菌纱布和70%酒精对囊肿表面进行彻底消毒。吸取20至50 mL囊液至无菌的50 mL锥形管中。排尽液体后，用锋利的刀片切开包囊，将生发层转移至无菌的50 mL锥形管中，并短暂振荡以增加原头蚴的收集量。用PBS缓冲液洗涤原头蚴三至五次。将原头蚴置于0.1%伊红溶液中染色5分钟，随后在光学显微镜下观察其活力。培养时应选用活力至少为95%的原头蚴。用2 mL胃蛋白酶处理原头蚴沉淀物，作用时间为15至20分钟。为了分离单个原头蚴，将原头蚴沉淀物重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过两层无菌纱布过滤至新的无菌50 mL锥形管中。二、细粒棘球绦虫原头蚴的双相培养以获得成虫。向每个25平方厘米的培养瓶中加入10 mL液相培养基。将约 5,000 个原头蚴加入培养瓶中，并将其转移至 CO2 培养箱。24 至 48 小时后，将原头蚴转移至含有固相的新培养瓶中，每瓶加入 1 mL 相同的新鲜液相培养基。将培养瓶放入培养箱，在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养。每五到七天，用新鲜的液体相培养基更换原有培养基。三、细粒棘球绦虫原头节的单相培养。确保在转导前 24 至 48 小时完成单相培养。在25平方厘米的培养瓶中，用RPMI加10% FBS培养约5,000个原头节。将培养瓶置于CO2培养箱中，待用。四、用于病毒生产的细胞培养与制备。将500,000个HEK细胞转移至一个含有5 mL DMEM的25平方厘米培养瓶中，DMEM中添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素。将HEK2细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育，并每48小时用完全培养基传代一次。最后使用低代次的HEK细胞进行转导。五、使用第三代慢病毒载体进行病毒的生产与制备。第一天，将6孔培养板中的HEK细胞经胰蛋白酶消化后，每孔接种70,000个细胞，加入含10% FBS的新鲜无抗生素DMEM培养基。采用50%至60%融合度的细胞，通过磷酸钙法进行转导。第二天，在实验开始前两到三小时，用含有2%胎牛血清（FBS）的新鲜无抗生素DMEM培养基替换细胞培养基。在1.5 mL离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括7微克/微升的pCDH513b转移载体、4微克/微升的PLPII、4微克/微升的PLPI以及2微克/微升的PMD2G辅助载体。向混合物中加入HEPES缓冲液，使总体积达到422微升。向混合物中加入16微升1% TE缓冲液。向各管中加入62微升2.5 mL氯化钙溶液，并充分混匀。使用巴斯德移液管在1至2分钟内逐滴加入500微升2x HBS缓冲液至混合物中。轻轻混匀，直至形成半透明溶液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，将混合液缓慢加入每孔，并以缓慢的环形动作均匀分布。将培养板置于37摄氏度、5%CO2培养箱中孵育，4至6小时后更换为不含抗生素、含10%FBS的DMEM培养基。第三天，使用倒置荧光显微镜确认瞬时转导是否成功以及细胞活力。第四天，通过收集每孔的上清液从培养基中收获病毒，并将其储存在负70摄氏度直至使用。六、利用该病毒对不同发育阶段的细粒棘球绦虫进行瞬时转导。第一天，使用12孔培养板进行基因转导。用完全DMEM培养基将5,000至50,000个HEK细胞以三复孔形式培养，作为内参对照。将150个新鲜原头蚴以三复孔形式在RPMI加10% FBS培养基中培养。将30条横裂期蠕虫以DMEM培养基和10%热灭活FBS进行三组平行培养。制备含有100万个病毒和4 µg/mL转染试剂的混合液，用于转导HEK细胞及蠕虫的不同发育阶段。将该混合液缓慢加入每块培养板中，并以缓慢的环形动作使其均匀分布。将培养板置于 CO2 培养箱中孵育 4 至 6 小时，条件为 37 摄氏度、5% CO2。每份样品更换为相同的完全培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。第二天，重复前两个步骤，以提高 HEK 细胞、原头蚴和链状节片虫的瞬时转导效率。将所有培养皿在 CO2 培养箱中孵育 24 至 48 小时，培养条件根据细胞培养基类型保持一致。第三天，通过荧光显微镜观察以确认转导是否成功。代表性结果。本文介绍了一种利用第三代慢病毒载体在细粒棘球绦虫中进行快速高效瞬时转导的技术。根据我们之前的研究，将原头节在双相培养基中培养，以获得链节化虫体。原头节经过六周的体外培养后发育为链节化虫体。在双相培养基中观察到细粒棘球绦虫的不同发育阶段，包括内陷的原头节（图2A）、外翻的原头节（图2B），以及具有第一和第三节片形成的链体虫（图2C至E）。分别从单相和双相培养获得的原头节和链体虫通过表达GFP的慢病毒进行转染（图3）。作为瞬时转导过程的对照，HEK细胞明显表达了GFP。成虫在皮层结构中表现出最清晰的GFP表达。然而，原头蚴在转染后48小时表现出相对较低的GFP表达水平。部分原头蚴周围存在的囊液残留物或生发层碎片导致转染样本中出现一定的荧光背景。HEK细胞和节片化虫体的荧光强度在24小时和48小时后均有所增加。了解线虫和扁形动物生物学的分子基础是人畜共患寄生虫致病性研究中最重要的前沿领域之一。缺乏有效的基因评估系统是直接解读绦虫寄生虫（包括棘球绦虫属物种）功能遗传学的主要障碍。本研究的主要目标是阐明慢病毒载体转导的过程，该过程将在未来的棘球蚴病研究中发挥关键作用。结果表明，节片型虫体对基因瞬时转导的响应性高于原头节，这可能是由于节片型虫体具有更复杂的体被结构所致。然而，由于慢病毒转导的特性，多细胞结构的原头节和节片型虫体中的荧光强度通常远低于单层 HEK 细胞。目前迫切需要在基因组和转录组水平上开展针对棘球绦虫以及多种寄生性和自由生活的扁形动物模式系统的应用遗传学研究。因此，开发针对绦虫的基因转移技术，为病毒介导的基因定位或CRISPR-Cas9基因编辑等新技术的潜在应用铺平了道路。本研究在绦虫模型中实现了慢病毒转导，并展示了具有前景的结果，可能对扁形动物生物学研究产生重要影响。然而，仍需开展更深入的研究，以优化方法并拓展这些技术在未来实验中的适用性。

transient-transduction-strobilated-forms-echinococcus

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

粒状棘球绦虫的短暂转导

透明的斑马鱼胚胎已被证明是研究先天免疫细胞与胞内细菌病原体（如Salmonella typhimurium和Mycobacterium...

斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。...

分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

在本视频中，我们介绍了核转染技术，这是一种基于电穿孔的转染方法，用于将编码荧光报告蛋白的质粒DNA导入鸡艾美球虫（Eimeria）的子孢子阶段寄生虫中。...

寄生虫形态的核转染：一种基于电穿孔的转染方法将编码荧光蛋白的质粒导入子孢子细胞核

本文介绍了一种在斑马鱼耳囊内建立并成像局部细菌感染的方法。...

Streptococcus iniae 感染的斑马鱼幼体模型中先天免疫反应的非侵入性成像

本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。...

核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

针对寄生性线虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides...

通过显微注射法在 Strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

电穿孔是一种快速且被广泛采用的方法，用于将外源DNA导入属内 立克次体. 本方案提供了一种有效的电穿孔方法，用于转化专性胞内寄生细菌属中的细菌 立克次体.

一种通过表达荧光蛋白的穿梭载体在蜱细胞系中转化Rickettsia spp. 的电穿孔方法

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。...

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

本方案描述了一种转染方法 Naegleria gruberi 滋养体携带一种在连续传代过程中保持稳定的构建体...

将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染入 N. gruberi 滋养体

本文描述了in vitro条件下多房棘球绦虫（Echinococcus...

小细胞外囊泡的分离及其树突状细胞摄取 细粒棘球绦虫

了解使用第三代慢病毒载体对粒状棘球绦虫不同发育阶段进行快速短暂转导的技术。该方法为寄生虫遗传学研究提供了有效工具，有助于深入理解包虫病的致病机制并推动疾病防控研究。

Echinococcus granulosus 棘球蚴小体的瞬时转导

探索更多视频