通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

本方案解决了在痰液处理过程中常遇到的难题，这些难题过去使得痰液难以用于高通量临床诊断中的流式细胞术。本方案通过使用痰液重量来确定抗体和染料的染色体积，从而节省时间。在染色孵育期间，可对后续步骤进行细胞计数。

获得准确的细胞计数对于确定正确的重悬体积至关重要，以避免在流式细胞仪运行过程中出现任何问题。该方案可为研究肺部健康相关领域的研究提供参考。例如，可利用此方法研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘、肺癌或 COVID-19 的影响等疾病。

本实验操作将由我实验室的研发科学家 Dr. Michael Lai 进行示范。首先，称量痰液样本以确定解离试剂的用量。根据痰液重量将样本转移至适当大小的容器中，然后每克样本加入 1 毫升 0.5% NAC 和 4 毫升 0.1% DTT。

将样品在最大速度下涡旋振荡15秒，并在室温下以最大速度摇动15分钟。用4倍浓度的Hanks平衡盐溶液（HBSS）稀释该样品，以中和NAC和DTT。快速涡旋振荡后，将样品在室温下摇动5分钟。

将细胞悬液通过100微米尼龙网细胞筛过滤至一个或多个50毫升锥形离心管中，以制备单细胞悬液。离心沉淀细胞。吸除上清液后，将沉淀合并至一个15毫升锥形管中，并在相同条件下用HBSS洗涤。

根据痰液样本的初始重量，用相应体积的缓冲液重悬细胞沉淀。取部分细胞悬液，将10微升痰液稀释液与30微升0.4%台盼蓝混合，然后加入血细胞计数板的计数室中进行活/死细胞计数。在补偿管上标记痰液样本信息。

根据文中所述，向每管痰细胞管和补偿管中加入HBSS抗体和染料。将痰细胞加入检测管中，并按文中所述向补偿管中加入补偿微珠。将所有管置于冰上避光孵育35分钟。

随后，用预冷的HBSS充满离心管，在4°C条件下以800 × g离心10分钟。对于补偿管，尽可能吸除上清液，仅留沉淀，轻轻弹击管底使沉淀松散。接着，向补偿管中加入0.5 mL冷HBSS，并将管子置于冰上避光处保存，待流式细胞术分析时使用。然后，吸除痰液未染色管、同型对照管、血液管和上皮细胞管中的上清液。

轻轻敲击离心管使沉淀松散。向未染色管和同型对照管中各加入2毫升1%PFA，向血液管和上皮管中各加入10毫升1%PFA。将各管置于冰上避光孵育30分钟，然后在最大转速下快速涡旋振荡，再继续冰上避光孵育30分钟。

然后用预冷的HBSS填充离心管。接下来，在4°C条件下以1,600 × g离心10分钟。尽可能吸除上清液，不要扰动细胞沉淀，用手指轻弹管壁以松散细胞。向未染色管和同型对照管中各加入200 µL冷HBSS。根据总细胞数计算并加入重悬血液和上皮细胞管所需的HBSS体积。

将所有补偿管中的样本置于冰上并避光保存，温度为 4 摄氏度，直至进行流式细胞术分析。对所使用的流式细胞仪执行适当的开机程序。使用美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）微球混合物，确保前向散射光和侧向散射光的电压设置能使 NIST 微球在图谱中充分分布，且微球不靠近坐标轴。

将LSRII的流速设为中等，Navios EX的流速设为高。调整各散射光和荧光参数的电压，使细胞群落在量程范围内。参考设门策略图示，相应调整各电压参数。首先采集未染色痰样本的数据，随后依次采集同型对照染色样本、血液样本管和上皮细胞样本管的数据。

采用痰液重量来确定抗体或染料染色所需的体积。痰液重量与细胞得率之间的相关性较弱。将痰液样本按重量分为四类，这些类别在细胞得率分布中呈现聚集状态。

所用每种抗体均进行滴定，在达到最高染色指数的平台期浓度下选择工作浓度。在所有体重类别中，平均SEC污染率均低于20%，图中显示了活细胞百分比。此处展示的是用于分析的设门策略。

采用 NIST 微球设置门控，应用于痰液样本以去除碎片。通过宽度门控进一步去除较小的碎片。使用活性染料排除死细胞，而单细胞门控用于去除双联体细胞。

抗CD45抗体标记可将活的单个痰细胞分为血细胞和非血细胞组分。比较了Navios EX、LSRII和Lyric获得的图谱。图中展示了去除碎片、死细胞、双联体，并比较血细胞与非血细胞图谱的设门策略。

该技术使我们能够应用这些方法来检测肺癌风险，作为非侵入性临床检测手段。