同时布莱特菲尔德， 荧光， 和光学相干断层成像收缩心脏特拉贝库莱 Ex Vivo
October 2nd, 2021
本协议提供了来自主动收缩的心脏气管 前体内的肉瘤、钙和宏观几何数据的集合。这些同时测量是通过整合三种成像方式实现的。
此过程的总体目标是演示三个成像系统在单个设备中的集成，从而能够同时测量收缩心脏组织的机械功能、离子动力学和几何变化。具体来说，我们测量组织的力生成、钙瞬态、局部位移和形状变化。这些成像模式的结合有助于回答心脏病中的关键问题，对制定有效的治疗策略具有重大意义。
这项技术的主要优点是它使我们能够研究肌肉活动的异质性。本协议中使用的设备包含三个能够成像同一样品的成像系统、一个亮场显微镜、荧光显微镜和一个光学一致性断层仪。一系列二色反射镜用于分离荧光发射和亮场传输图像。
该设备的基本功能是两个独立驱动的安装钩，一个具有三个光学清晰轴的测量室和一个外部触发线，用刺激器同步亮场和 OCT 摄像机。在本视频中，我们演示了如何隔离、准备和成像心肌，并呈现一些具有代表性的结果。从麻醉的老鼠身上切除心脏后，将其转移到解剖室。
使用两个弯曲的钳子，将主动脉拉过灌注罐。用一个力子将主动脉保持到位。同时，打开管线，让解剖液流过灌注管。
一旦冠状血管清除血液，心脏完全充满解剖溶液，使用缝合线固定主动脉就位。通过旋转管子来定位心脏，使左冠状动脉在上层表面可见。将心脏的顶点固定在解剖室的底部。
切断两个阿丽亚。沿着隔膜的右侧切到心脏的顶点。将打开的左心室固定到解剖室的底部。
然后，沿着隔膜的左侧切割，打开右心室，并将其固定在解剖室的底部。在右心室中识别自由运行的气管。使用弹簧剪刀和钳子，切割胸围周围的壁组织。
然后，将壁组织切成两半，矫形到特拉贝库拉的方向。修剪壁组织，直到其尺寸适合使用的安装配置。将切除的四叶葡萄留在解剖室中。
冲洗热水、蒸馏水，然后通过测量室将溶液超融合。打开亮场显微镜光源并按 F1 以实现捕获。手动调整下游挂钩，直到它以明亮的场图像为中心。
单击零下行轴，然后向下禁用以启用电机。移动下游设置点滑块，直到挂钩结束与默认感兴趣区域的边缘对齐。将下游轴重新归零，然后将下游设置点滑块移动到 1，000。
使用上游挂钩重复该过程，但在重新定位上游轴后不要移动上游设置点滑块。单击"移动到安装"。启动荧光照明系统时，先扭动灯开关，然后通过切换主开关快速打开控制器子系统。
通过按前面板上的模式按钮，将操作模式切换到涡轮增压空白，然后是两个，然后是一个。按下在线按钮以实现外部控制。暂停通过测量室的超融合流。
用解剖溶液填充安装室。使用一毫升注射器，将气管从解剖室运送到安装室。让气管通过重力进入安装室。
降低安装室中的液位，使其与钩的中段平起平下。通过移动下游设置点滑块来调整钩之间的距离，以反映特拉贝库拉的松弛长度。使用显微镜帮助可视化，用钳子轻轻抓住一个末端组织碎片，并将其安装到上游钩上。
将另一块端组织安装到下游钩上。一旦安全安装，通过按移到腔体并恢复超模糊流，将 trabecula 移回测量室。将刺激频率设置为 1，刺激持续时间设置为 10，将刺激电压设置为 10。
开始刺激，按刺激。打开明亮的电场照明系统。按 F1 并选择用户界面的条纹区域的感兴趣区域。
单击计算肉瘤长度以计算突出区域的平均肉瘤长度。增加肌肉长度，直到平均肉瘤长度约为2.32微米。通过调整中心设置滑块和分离控制选项卡来移动肌肉，以便下游挂钩的边缘在亮场图像中可见。
收集 10 个抽搐的荧光信息。将中心设定值增加 200，并收集另外 10 个抽搐值的荧光信息。重复此过程，直到亮场图像包含上游挂钩。
收集最后一个窗口的荧光信息。将中心设定值设置为零，将特拉贝库拉返回到中心位置。将刺激频率降低到 0.2 赫兹，并从 K-H 超级模糊切换到 Fura-2 加载解决方案。
每10分钟测量一次荧光信号。可视化 PMT 信号选项卡上的信号。在 360 纳米信号增加 10 倍后，将刺激频率返回到一个赫兹，然后切换回 K-H 超模糊解决方案。
每 10 分钟检查一次比率测量，直到信号稳定下来，此时可以开始数据收集。将肌肉返回到下游钩的边缘刚刚存在于亮场图像中的位置。通过单击启用荧光源捕获荧光信息。
开始流式传输硬件数据。在 Brightfield 成像用户界面上，将捕获模式设置为外部触发器，将帧速率提高到 100 赫兹，并将捕获的图像数设置为 100。按控制移位-S，然后是 F1，以记录此窗口的亮场成像数据。
将中心设置点值增加 200，并重复亮场捕获过程。继续执行扫描协议，直到为最终窗口收集成像数据。将中心设定值设置为零，将特拉贝库拉返回到中心位置。
通过转动主键、按下电源按钮，然后按下 SLD 按钮来打开 OCT 照明源。盖住电压仪头，单击背景以测量背景干扰模式，并从测量中减去。设置图像捕获模式以进行实时查看。
通过调整 X 和 Y 偏移值，将特拉贝库拉放在 X 轴和 Y 轴中。以特拉贝库拉为中心，通过调整 Y 位置沿 y 轴进行扫描，以查找与上下游挂钩对应的位置。请注意这些位置向下。
将范围 Y 设置为这些值之间的绝对差异除以 10。将图像捕获模式设置为触发的刺激，将 X 范围范围设置为 100，然后单击设置的活动参数按钮。单击流数据，然后获取。
为了捕捉区域钙和亮场信息，这里呈现的整个长度的气管，需要七个肌肉位置。每个覆盖位置的平均力数字表明，抽搐力不受此运动干扰，表明力生成行为没有位置依赖性。这些使用光学连贯性断层扫描收集的速率为 100 赫兹使用 ImageJ 插件 Weka 进行分割。
由于横向分辨率和深度分辨率之间的差异，每个横截面都出现扭曲。通过用各自的分辨率独立缩放每个轴来纠正此问题。在缩放了特拉贝库拉的原始C扫描后，肌肉大约是圆柱形的。
测量室壁的反射有时可能与肌肉数据重叠，但可训练分割软件来解释这一点。一旦分割，沿着肌肉长度的横截面区域可以计算整个抽搐。请注意，这个特殊的特拉贝库拉有一个小分支。
分支的运动在特拉贝库拉的大约一半很明显。最后，分割图像可以转换为网格，以帮助构建几何模型。以每秒100帧的速度在七个位置中捕获的成像数据被拼接在一起，以创建一个完整的特拉贝库拉图像。
与340和380纳米激发光相关的省略荧光比与细胞内钙相关，在特拉贝库拉被加载富拉-2后。每个窗口平均有10个细胞内钙瞬态值与它们被成像的区域对齐。虽然这种颤分的瞬态峰值看起来相当一致，但舒张钙的长度会减少。
同样，位移跟踪和肉瘤长度计算的结果也表明存在区域变异性。使用的无标记跟踪技术能够计算每个像素的位移。根据高斯式适合 FFT 信号的宽度和振幅测试了肉瘤长度估计的适用性。
这些条件在零到500微米之间的肌肉区域没有满足，所以没有肉瘤长度信息可以计算在那里。鉴于相关的位移，该地区肉瘤很可能在抽搐的收缩阶段拉长。观看此视频后，您应该很好地了解如何隔离心肌梗塞，并为多模式成像做好可靠的准备。
这个过程为收集构建心脏组织收缩的生理信息有限元素模型所需的数据集提供了途径。
概述
该协议展示了三个成像系统的集成，用于测量收缩心脏组织的机械功能、离子动力学和几何变化。该技术允许同时评估心脏小梁中的力生产、钙瞬变和形状变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏生理学
- 成像技术
- 心脏病研究
背景
- 了解心脏肌肉活动对于解决心脏病至关重要。
- 同步成像可以揭示肌肉功能的异质性。
- 多种成像模式的集成增强了数据收集。
- 本研究以心脏小梁为心脏组织模型。
研究目的
- 测量心脏组织的机械和离子特性。
- 探索对心脏病治疗策略的影响。
- 展示用于心脏研究的新型成像设备。
使用的方法
- 使用明场、荧光和光学相干断层扫描成像。
- 从大鼠心脏制备心脏小梁。
- 同时测量力和钙动力学。
- 通过同步成像系统收集数据。
主要结果
- 成功分离和成像心脏小梁。
- 定量分析肌小节长度和钙瞬变。
- 展示设备捕捉动态变化的能力。
- 洞察心肌活动的异质性。
结论
- 集成成像系统提供了关于心脏组织的全面数据。
- 该方法可以推进对心脏功能的理解。
- 在开发心脏病治疗方法中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multimodal imaging approach enables simultaneous assessment of mechanical function, ionic dynamics, and geometric changes in cardiac tissue, addressing a critical gap in understanding excitation-contraction heterogeneity. By providing spatially resolved data on sarcomere length, calcium transients, and tissue deformation, the method supports mechanistic de-risking in cardiac target validation and preclinical model development. The integrated platform enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular events to functional outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating calcium handling with contractile function at subcellular resolution.
- Operational Value: Provides quantitative, spatially mapped outputs that clarify pathway-specific effects on tissue mechanics.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through direct visualization of excitation-contraction coupling in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible measurements of displacement, strain, and sarcomere dynamics for assay benchmarking.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated trabeculae for downstream compound screening with real-time functional readouts.
- Scalability: The scanning protocol overcomes imaging window limitations, enabling full-length tissue analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant structural and functional data that align with translational biomarker discovery in cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying regional heterogeneity in contractile response.
- Predictive Confidence: Enables construction of physiologically informed finite element models for preclinical continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical modeling by providing multimodal, quantitative readouts that bridge molecular, cellular, and tissue-level phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by synchronizing calcium transient data with mechanical output and geometric change.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized length control and force measurement capabilities.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions through synchronized brightfield, fluorescence, and OCT data streams.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation via geometrically accurate, data-driven computational models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal studies of cardiac tissue under varying pharmacological or genetic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking ionic dynamics to tissue-level deformation and force production.
- Operational Value: Ensures reproducibility through synchronized, trigger-based data acquisition across imaging modalities.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing spatially heterogeneous responses that may be masked in bulk measurements.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on excitation-contraction homogeneity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac tissue isolation, multimodal microscopy, and image synchronization.
- Dependent on stable superfusion, precise length control, and external triggering for data alignment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting, stimulation protocols, and region-of-interest selection.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different species or disease models.
- Limited by the physical size of the trabecula and the need for sequential scanning to achieve full-length coverage.
