离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

本实验的总体目标是展示将三种成像系统集成于单一装置中的方法，从而实现对收缩心脏组织的机械功能、离子动态及几何形变进行同步测量。具体而言，我们测量组织的力生成、钙瞬变、局部位移以及形态变化。这些成像模式的结合有助于回答心脏疾病领域中的关键科学问题，并对开发有效的治疗策略具有重要意义。

该技术的主要优势在于能够研究肌肉活动的异质性。本方案中使用的设备包含三个可对同一样本进行成像的成像系统：明场显微镜、荧光显微镜和光学相干断层扫描仪。通过一系列二向色镜来分离荧光发射信号与明场透射图像。

该装置的基本特征包括两个可独立驱动的固定钩、一个具有三个光学通透轴的测量室，以及一条将明场成像与光学相干断层扫描（OCT）相机和刺激器同步的外部触发线。在本视频中，我们将演示如何分离、制备和成像心脏小梁，并展示一些代表性结果。在从麻醉的大鼠体内取出心脏后，将其转移至解剖室中。

使用两把弯镊子，将主动脉拉至灌注套管上方。用一把镊子固定住主动脉。同时，打开管路，使灌注液流经灌注套管。

当冠状血管内的血液被清除且心脏完全灌注了解剖液后，使用缝线将主动脉固定到位。通过旋转插管来调整心脏位置，使左冠状动脉位于心脏表面并可见。将心脏的心尖固定在解剖腔底部。

切除左右心房。沿室间隔右侧剪至心尖。将打开的左心室固定在解剖室基部。

然后，沿室间隔左侧剪开，打开右心室，并同样将其固定在解剖槽底部。在右心室中识别一条游离的乳头肌。使用弹簧剪刀和镊子，剪除乳头肌周围的心室壁组织。

然后，沿与小梁方向垂直的方向将壁组织切成两半。修剪壁组织，直至其尺寸适合所用的固定装置。将切除的小梁保留在解剖室中。

依次用热水、蒸馏水和灌流液冲洗测量室。打开明场显微镜光源，按下 F1 键以启用图像采集。手动调节下游钩的位置，直至其在明场图像中居中。

单击下游轴归零，然后关闭下游使能以启动电机。移动下游设定点滑块，直到钩子末端与默认兴趣区域的边缘对齐。重新将下游轴归零，然后将下游设定点滑块移动至 1,000。

使用上游钩重复此过程，但在重新归零上游轴后，不要移动上游设定点滑块。单击“移动至安装位置”。通过拨动灯开关启动荧光照明系统，然后通过拨动主开关快速开启控制器子系统。

按下前面板上的模式按钮，然后依次按二和一，将操作模式切换为涡轮空白模式。按下在线按钮以启用外部控制。暂停灌流液流经测量室。

用解剖液填充固定室。使用1毫升注射器将小梁从解剖室转移至固定室。让小梁在重力作用下自然沉降至固定室中。

降低灌流室中的液面，使其与钩子的中段齐平。通过移动下游的设定点滑块，调节两个钩子之间的距离，以反映小梁的松弛长度。在显微镜辅助下观察，用镊子轻轻夹住一端的组织末端，将其固定在上游的钩子上。

将另一块组织末端固定在下游挂钩上。固定牢固后，按下“移至测量室”按钮，将小梁肌移回测量室，并恢复灌流液流动。将刺激频率设置为1，刺激持续时间设置为10，刺激电压设置为10。

通过按下刺激开启按钮开始刺激。打开明场照明系统。按下 F1 键，并在用户界面中选择一个包含横纹区域的兴趣区域。

单击“计算肌节长度”以计算高亮区域内的平均肌节长度。逐渐增加肌肉长度，直至平均肌节长度约为2.32微米。通过调节中心与分离控制标签页上的中心设定值滑块来移动肌肉，使下游钩子的边缘在明场图像中刚好可见。

采集10次抽搐的荧光信息。将中心设定值增加200，再采集另外10次抽搐的荧光信息。重复此过程，直至明场图像中包含上游钩状结构。

采集最后一个时间窗口的荧光信息。将中心设定值设为零，使小梁回到中央位置。将刺激频率降低至 0.2 赫兹，并将灌流液从 K-H 液更换为 Fura-2 负载溶液。

每10分钟测量一次荧光信号，在PMT信号标签页中观察信号变化。当360纳米处的信号增强至原来的10倍时，将刺激频率恢复至1赫兹，并切换回K-H灌流溶液。

每10分钟检查一次比值测量结果，直至信号稳定，此时可开始数据采集。将肌肉恢复至下游钩边缘刚好出现在明场图像中的位置。单击启用荧光光源以采集荧光信息。

开始流式传输硬件数据。在明场成像用户界面中，将采集模式设置为外部触发，将帧率提高至 100 Hertz，并将要采集的图像数量设置为 100。按下 control-shift-S，然后按 F1，以记录该窗口的明场成像数据。

将中心设定值增加 200，并重复明场图像采集过程。继续执行扫描程序，直至完成最后一个窗口的成像数据采集。通过将中心设定值设为零，将小梁返回至中心位置。

通过转动主钥匙、按下电源按钮，然后按下 SLDs 按钮，打开 OCT 照明光源。盖住检流计头部，点击“获取背景”以测量背景干涉图样，并从测量结果中减去该背景。将图像采集模式设置为实时预览。

通过调整 X 和 Y 偏移值，使小梁在 X 轴和 Y 轴上居中。小梁居中后，通过调节 Y 位置沿 Y 轴扫描，找到对应上游和下游钩的位置。记录下这些位置。

将Y轴范围设置为这两个值之间绝对差值的十分之一。将图像采集模式设置为刺激触发，X轴范围设置为100，然后点击“设置活动参数”按钮。点击“流式传输数据”，然后点击“采集”。

为了获取此处所示心室肌小梁全长的区域性钙信号和明场信息，共需要七个肌肉位置的扫描。每个位置平均力的叠加图表明，这种移动并未干扰收缩力，说明力的产生不存在位置依赖性。这些以每秒100赫兹速率采集的光学相干断层扫描图像，已使用ImageJ插件Weka进行分割。

由于横向与深度分辨率之间的差异，每个横截面均呈现扭曲状。通过根据各自的分辨率对每个轴进行独立缩放，可校正此问题。对骨小梁的原始C扫描图像进行缩放后，肌肉形状大致呈圆柱形。

测量室壁的反射有时会与肌肉数据重叠，但分割软件可经过训练以校正此现象。完成分割后，可在整个肌束收缩过程中计算其长度方向上的横截面积。请注意，该特定小梁肌具有一细小分支。

在距离小梁约一半的位置可以明显观察到分支的运动。最后，可将分割后的图像转换为网格，以辅助构建几何模型。以每秒100帧的速率在七个位置采集的成像数据被拼接在一起，形成一幅完整的小梁结构图像。

在小梁组织加载Fura-2后，与340和380纳米激发光相关的荧光缺失比值反映了细胞内钙离子浓度。每个窗口采集的10个细胞内钙瞬变信号的平均值与其成像区域相对应。尽管该小梁组织的瞬变峰值表现相对一致，但其舒张期钙水平沿长度方向逐渐降低。

类似地，位移追踪和肌节长度计算的结果也表明存在区域差异性。所采用的无标记追踪技术能够计算每个像素的位移。通过高斯拟合对FFT信号的宽度和振幅进行评估，以检验肌节长度估算结果的可靠性。

在距离为零到500微米的肌肉区域，这些条件未得到满足，因此无法在此区域计算肌节长度信息。根据相关的位移情况，该区域的肌节在收缩相期间很可能发生了拉长。观看本视频后，您应能充分理解如何可靠地分离心肌小梁并为其进行多模态成像做好准备。

该过程建立了收集数据集的途径，这些数据集是构建基于生理信息的心肌组织收缩有限元模型所必需的。