通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

我们介绍一种通过EdU标记新合成的DNA，并结合纳米金颗粒的银增强显色以及染色质的ChromEM染色，实现细胞内复制区域的电子显微镜可视化实验方案。该方案采用传统的戊二醛固定，在常温样品处理条件下可实现高对比度的预包埋标记，同时最大程度地保持染色质的超微结构。本方案针对在培养皿盖玻片上贴壁生长的细胞进行了优化。

将EdU加入至终浓度为10 µmol，将细胞放入培养箱中进行所需时间的标记。用含2.5%戊二醛的100 mmol钠卡考基酸缓冲液固定标记的细胞1小时。过长的固定时间可能对EdU标记产生不利影响。

用添加了5毫摩尔氯化镁的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样品，以去除戊二醛，该缓冲液进一步称为PBS star。每次10分钟，洗涤3次。使用含1% Triton X-100的PBS star溶液对细胞膜进行透化处理，更换两次溶液，每次5分钟。

该溶液后文简称为 PBS star T。用 PBS star 对样本进行充分洗涤，共更换五次溶液，每次五分钟。使用含 20 毫摩尔甘氨酸的 PBS star 溶液淬灭残余醛基，每次 10 分钟，重复两次。

将样品置于含1% BSA的PBS中封闭半小时。在BSA封闭的同时，配制EdU检测的反应混合液。组分添加顺序至关重要。

在湿盒中进行EdU生物素-叠氮化物偶联反应，以尽量减少反应混合液的蒸发和浓度变化。准备湿盒，将带有细胞面朝上的盖玻片置于Parafilm上，然后在盖玻片上加入50至100微升的反应混合液。

反应在室温下进行30分钟。用PBS star T洗涤样品，每次5分钟，共洗涤5次，以终止反应。再用含1% BSA的PBS star T封闭30分钟。

在含1% BSA的PBS star T中配制链霉亲和素-Nanogold溶液。将样品置于新制备的湿盒中，于4摄氏度下与链霉亲和素孵育过夜。该操作步骤与EdU生物素-叠氮化物偶联步骤相同。

终止反应并用PBS*洗涤样品，每次10分钟，共洗涤5次。用含1%戊二醛的PBS*在室温下固定30分钟，以稳定生物素-链霉亲和素复合物。用去离子水充分洗涤以去除戊二醛。用1毫克/毫升的硼氢化钠淬灭残余的醛基。

再次彻底清洗。下一步是通过在金核上沉积银来增大纳米金颗粒的尺寸。配制预混液以尽量减少暗室操作。

用洗涤缓冲液平衡样品，然后进入暗室。在暗室内混合各组分以配制洗涤液，并将其加入样品中。金合欢粉溶液黏度很高。

因此，在混合组分时，应缓慢摇动离心管，以避免产生气泡和泡沫。反应时间为2至5分钟。我们建议进行预实验，以确定最佳反应时间。

孵育时间过长可能导致非特异性银沉积。为终止反应，需迅速用去离子水冲洗样本，换水三至五次，随后再换水三次，每次五分钟。

为了防止四氧化锇溶解银纳米颗粒，将样品在避光条件下于0.05%的四氯金酸溶液中孵育两分钟。用去离子水彻底清洗。在此阶段，含DNA的材料将获得额外的对比度。

用DRAQ5 DNA染料充分浸润样本。向样本中加入二氨基联苯胺溶液，孵育一分钟。将盖玻片转移至玻璃底培养皿中，并置于倒置显微镜的载物台上。

用640纳米红光照射多个视野。左侧面板显示DRAQ5完全光漂白。右侧面板为同一视野的透射光成像，显示DAB沉淀物。

用去离子水清洗样品。下一步操作应在通风橱中进行。制备部分还原的四氧化锇溶液。

小心。该物质具有高度挥发性和毒性。将配制好的溶液施加到样品上。

在此阶段，还原的锇化合物会与二氨基联苯胺沉积物反应，从而增强DNA的对比度。根据当地规定处理含锇溶液，并将样品每次五分钟，清洗三次。随后，样品将经过一系列浓度递增的乙醇进行脱水，再通过乙醇与树脂的混合液对细胞进行渗透。

用新配制的纯树脂替换酒精-树脂混合液。将新配制的树脂加入合适大小的包埋模具中。将盖玻片细胞面朝下覆盖在充满树脂的模腔上。

在 37 摄氏度下固化树脂 24 小时，然后在 60 摄氏度下至少固化两天。从盖玻片的底面去除树脂。

将玻片浸入液氮中，然后转移至沸水中。玻璃应会脱落。如有需要，可重复此步骤。

由于二氨基联苯胺沉积和DAB染色，照射区域应清晰可见。使用钢锯或其他合适的工具从组织块中切下感兴趣区域。将切下的组织放入超薄切片机简易样品台中。

为最终修块设置超薄切片机。使用剃刀刀片制备呈金字塔形状的样品块，其顶部平面区域的尺寸应约为 400 × 200 微米。

将制备好的锥形样品安装到超薄切片机的样品臂上，并安装刀具。制备切片。切片厚度可根据实验要求进行调整。

我们的目标是进行电子显微镜断层扫描。因此，我们制备了厚度为250纳米的切片，也称为半薄切片。将切片从刀刃上取下，并将其装载到载网槽格上。

我们使用了带有圆形孔的载网，孔径约为一毫米，侧边开口为一毫米。较小的开口尺寸可提供更好的切片稳定性。让样品在载网上干燥。

此时，切片已准备好进行观察。将载网放入电子显微镜样品台中，并将样品载入电子显微镜。

获取倾斜系列图像。哺乳动物细胞核内的复制灶根据S期的进程表现出不同的分布模式。在戊二醛固定后，通过与荧光标记的叠氮化物进行点击反应确认成功的EdU标记，显示出异质细胞群体中典型的复制模式。

链霉亲和素标记可能受到戊二醛的影响。因此，首先在与底部链霉亲和素纳米金相同的条件下检查链霉亲和素荧光染色情况。银增强反应的良好结果表现为某些细胞核呈现深棕色染色，而细胞质部分仅有微弱的黄色染色，如底部所示。

预包埋标记的一个优点是可以在切片前选择特定细胞。此步骤在此阶段是可行的，因为标记模式在明场显微镜下已可见。适当的标记可使复制位点清晰可辨。

箭头指示DAB染色的染色质纤维。右侧背景标记每平方微米仅限少数几个纳米颗粒。半薄切片已准备好进行断层扫描，无需添加金纳米颗粒。

本研究所采用的方法用于分析具有复制活性位点的染色质结构。可用于复制后染色质重排的分析，包括染色质分离的高分辨率成像。该方法还可用于大片段染色体区域的复制标记，以及高级染色质折叠结构和异染色质的研究。

该成像技术对于其他非显微方法所产生的数据也具有重要的参考价值。该方法还可整合到相关显微研究中，包括超分辨率技术，为研究染色质的高级结构及其在细胞不同生理状态下的动态变化开辟了新的前景。