测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物:评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型
2021年8月16日
从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，使研究人员能够以各种实验方式对线粒体进行功能和分析评估。这项研究展示了如何从冷冻的心脏组织制备富含线粒体的制剂，并对线粒体进行分析评估。
该协议具有重要意义，因为它允许用户从从先前研究收集并存档的冷冻组织中制备线粒体样本。该协议还减少了使用活体动物进行组织收获。该技术允许用户使用先前冷冻的存档组织，通过采用温和的组织切碎方法制备富含线粒体的样品。
这种制备方法最大限度地提高了线粒体制备的产量。建议通过阅读协议来确保所有组件和工具的可用性，尤其是充满电的碎纸机驱动器，并且还使用一些不需要的组织进行锻炼以熟悉步骤。演示该过程的将是我实验室的研究助理Edina Kosa。
首先，记录含有心脏组织的管子的重量。现在称量空管并从先前记录的重量中减去它，以获得心脏组织的净重。将冷冻的心脏组织直接放入冰冷溶液的烧杯中。
搅拌五分钟。同时使用镊子对组织施加轻微的压力，以尽可能多地排出血液。用镊子取出纸巾，用干净的滤纸巾挤压心脏以去除血液。
然后将纸巾放入另一个冰冷溶液烧杯中。搅拌纸巾五分钟后，用纸巾轻轻擦干纸巾，除去脂肪、凝血、耳廓和筋膜。池化心室组织。
要切碎组织样品，请从冲压侧将50至300毫克的心脏组织放入组织粉碎室中，并关闭冲压侧。然后将约0.2至0.8毫升的洗涤缓冲液加入到管的盖子侧。使用管状工具用碎纸机盖紧紧地盖住碎纸机室，不要过度拧紧。
将碎纸机室放入碎纸机支架单元中，冲压板侧面朝下以进行啮合安装。用碎纸机盖插入并接合充满电的碎纸机驱动器的钻头，确保刀头紧贴到位，然后向下施加压力到碎纸机室中的碎纸机驱动器，直到碎纸机支架上的压力指示器达到大约两个的设置。按下扳机并运行碎纸机驱动程序约 10 到 12 秒，同时保持设置为 2 秒。
观察管以确保粉碎并确保全部或大部分组织团块通过裂解盘进入上部碎纸机室，并在必要时将管子返回到碎纸机支架以继续切碎。粉碎后，样品将碎纸机室从支架单元中取出，并使用管工具取下碎纸机盖并将其放在干净的表面上，以便以后仅在同一样品中使用，以避免其他组织样品的交叉污染。将切碎的心脏组织转移到第三个烧杯中，用40毫升的洗涤缓冲液搅拌，并在搅拌板上以中等速度搅拌组织五分钟。
通过预润湿的尼龙网单丝过滤悬浮液。丢弃滤液后，用10毫升洗涤缓冲液将切碎的组织放在过滤器上三次。将洗涤的组织转移到50毫升的烧杯中，将20毫升的洗涤缓冲液置于磁搅拌的冰浴中。
加入0.5毫升胰蛋白酶溶液，同时不断搅拌15分钟。搅拌大约一半时，将组织悬浮液转移到一个松散安装的手持式玻璃对玻璃均质机中，该均质机可以容纳15毫升的体积。通过四到五次轻柔的冲程使悬浮液均质化，而不会产生泡沫。
然后，将匀浆放入50毫升烧杯中，在搅拌板上混合。接下来，向匀浆中加入10毫升含有胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，并在轻轻搅拌的同时孵育。通过尼龙过滤器再次过滤悬浮液后，将过滤器保存在50毫升的锥形管中，并将过滤器上剩余的颗粒部分转移到玻璃对玻璃均质机中。
在15至20毫升的洗涤缓冲液中，用手轻轻匀浆25至30秒。将匀浆与滤液结合并平衡管后，离心，然后使用塑料移液管从蓬松的沉淀顶部除去留下0.2毫升的上清液。使用尼龙过滤器将得到的上清液过滤到新的锥形管中，以避免污染并再次离心。
丢弃上清液后，通过向管的侧面添加隔离缓冲液来洗涤沉淀两到三次，以防止破裂或污染沉淀。每次都丢弃蓬松的白色外缘层。向每个管中加入5毫升分离缓冲液，并使用带有1毫升尖端的移液器或新的转移移液器分解沉淀，然后用20毫升额外的分离缓冲液稀释悬浮液，并在4摄氏度下以8， 500 X g离心悬浮液15分钟。
弃去上清液后，首先将沉淀重悬于5毫升中，然后再悬浮在另外15毫升的重悬缓冲液中，并在4摄氏度下以8， 500 X g离心15分钟。现在丢弃上清液并保存含有洗涤完好线粒体的棕色沉淀。将线粒体富集的沉淀重悬于250微升的重悬缓冲液（包括蛋白酶抑制剂）中。
以25微升体积等分悬浮液，在液氮中快速冷冻，并在80摄氏度深的冰箱中储存数年。按照协议，从两组母猪所生后代的心脏中制备富含线粒体的蛋白质。一个在怀孕期间锻炼，另一个久坐不动。
ETC蛋白谱分析显示，在一些ETC复合物中，运动母猪的后代水平相对较低。线粒体蛋白在3%至8%梯度BN-PAGE中分辨，并用抗体混合物进行免疫探针。运动组和久坐不动组都表现出多种超级复合体。
与久坐不动的组相比，运动组观察到的显着超复合物增加在九个月时。使用动力学测定法分析了从48小时3个月，6个月和9个月的不同年龄组获得的富含线粒体的蛋白质的复合物I-II活性。与久坐组相比，锻炼组表现出复杂的I-II活性。
其他研究人员展示了从冷冻组织和细胞中获得的线粒体功能研究的可行性。从冷冻组织获得的线粒体的制备可以应用于各种具有最小损伤的组织。
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概览
该协议能够从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，便于进行线粒体的功能和分析评估。它显著减少了对活体动物组织采集的需求。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 从冷冻组织中制备线粒体对于各种研究至关重要。
- 该方法最大化了线粒体制备的产量。
- 可以利用存档组织，减少了伦理方面的担忧。
- 为了获得最佳结果，建议熟悉该程序。
研究目的
- 提供一个可靠的协议，用于从冷冻心脏组织中制备线粒体。
- 能够对线粒体进行功能和分析评估。
- 最大限度地减少研究中对活体动物的使用。
使用的方法
- 用于样品制备的温和组织粉碎方法。
- 使用充电完全的粉碎器驱动器以获得最佳性能。
- 从存档组织中制备富含线粒体的样品。
- 由合格的研究员演示该程序。
主要结果
- 成功从冷冻组织中制备了富含线粒体的样品。
- 证明减少了对活体动物组织采集的需求。
- 最大化了后续分析所需的线粒体产量。
- 该协议为研究人员提供了一种实用的方法。
结论
- 该协议适用于从存档组织中制备线粒体。
- 它通过减少活体动物的使用支持了伦理研究实践。
- 进一步的研究可以利用这种方法进行各种实验模式。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to leverage archived cardiac tissue for mitochondrial functional assessment, reducing reliance on live animal models and supporting longitudinal studies of exercise-induced bioenergetic adaptations. By preserving mitochondrial integrity from frozen samples, it facilitates target validation and mechanistic de-risking in preclinical cardiovascular research. The approach enhances predictive confidence in evaluating maternal exercise interventions on offspring heart metabolism, informing therapeutic hypothesis generation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial electron transfer complex profiles to assess therapeutic hypotheses on maternal exercise effects.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible mitochondrial isolation from archived tissues.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial samples for downstream immunoblotting and blue-native gel electrophoresis assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through consistent protein complex and supercomplex measurements.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mitochondrial profiling to preclinical continuity via age-dependent supercomplex and activity analyses.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking mitochondrial phenotypes to developmental timepoints.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling mitochondrial preparation from archived tissues for early-stage target validation and mechanistic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial efficiency changes in offspring heart tissue.
- Screening: Delivers quantitative outputs for ETC complex activity and supercomplex profiling.
- Analytics: Provides kinetic assay data for Complex I-II activity comparisons across experimental groups.
- Translational Research: Connects mitochondrial phenotypes to developmental stages for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for processing frozen cardiac tissues across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial bioenergetics assessment and reduction of mechanistic ambiguity in cardiovascular models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial isolation from frozen archives.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through reduced animal use and increased sample accessibility.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds targeting mitochondrial efficiency pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques and tissue handling.
- Dependent on access to tissue shredder equipment and fully charged driver units.
- Necessitates cross-team standardization of washing and isolation buffer protocols.
- Involves adaptation considerations for tissue-specific shredding parameters.
- Limited by the need for optimized protease inhibitor inclusion during resuspension.
