Name: 测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物:评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解如何从冷冻心脏组织中制备线粒体富集样本用于线粒体电子转移复合物分析。该方案采用温和的组织研磨方法，可最大化线粒体产量，减少活体动物使用，适用于评估运动诱导的线粒体生物能量变化研究。

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本工作获得了堪萨斯城大学向Abdulbaki Agbas提供的校内资助以及向Daniel Barrera提供的暑期研究奖学金。作者感谢Jan Talley博士在编辑方面的工作。

来自肖恩·纽科默博士的冷冻子代心脏组织样本，连同机构的IACUC批准函一同接收。这些心脏组织样本取自一项长期纵向研究，经液氮速冻后，于-80 °C保存以备后续使用。所有涉及子代心脏组织处理的操作规程均遵循堪萨斯城大学IBC和IACUC委员会的指导原则。
1. 缓冲液与试剂的准备
注意：所有样本的制备均需遵循制造商的使用说明。在所有试剂配方和实验步骤中使用超纯水或同等纯度的水。操作过程中需佩戴个人防护装备（实验室外套、口罩、手套和护目镜/面罩）。缓冲液体积适用于处理六个组织样本。
<ol>
	<li>通过将154.035 g蔗糖（终浓度0.3 M）、3.904 g HEPES（终浓度10 mM）和0.111 g EDTA（终浓度0.2 mM）加入1.0 L水中（置于搅拌器上搅拌），用稀盐酸调节pH至7.2，最后定容至1.5 L，配制1.5 L组织洗涤缓冲液。 
	注意：每个样品（50–300 mg）约需200 mL洗涤缓冲液。每天可处理六个组织样品。剩余的洗涤缓冲液可用于配制分离缓冲液。</li>
	<li>取步骤1.1中已配制的洗涤缓冲液210 mL，加入210 mg牛血清白蛋白（BSA），配制分离缓冲液。用稀NaOH溶液调节pH至7.4。 
	注意：每个组织样品约需35 mL分离缓冲液，因此六个样品共需210 mL。应在当天加入新鲜的BSA溶液（终浓度1 mg/mL）进行配制。BSA用于线粒体分离，可通过去除游离脂肪酸等天然解偶联剂来改善线粒体特性。研究发现BSA具有抗氧化活性，可提高底物（尤其是琥珀酸）在脑线粒体中的氧化速率7。也可使用价格较低的无酸类似物（如卵清蛋白）替代牛血清白蛋白。</li>
	<li>通过将0.011 g EDTA（终浓度0.2 mM EDTA，或使用200 mM EDTA储备液150 µL配制150 mL重悬缓冲液）、12.836 g蔗糖（终浓度0.25 M蔗糖）和0.236 g Tris（终浓度10 mM Tris-HCl）溶于水中，配制150 mL重悬缓冲液。用0.1 N NaOH调节pH至7.8。使用前加入60 µL蛋白酶抑制剂混合液。</li>
	<li>将7.5 mg胰蛋白酶溶于3.0 mL 1 mM HCl中，配制胰蛋白酶溶液（终浓度2.5 mg胰蛋白酶/mL）。此用量适用于一个样品。 
	注意：应根据计划处理的组织样品数量配制相应量的胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>将13.0 mg大豆胰蛋白酶抑制剂溶于含BSA的20 mL分离缓冲液中，配制胰蛋白酶抑制剂溶液（终浓度0.65 mg/mL胰蛋白酶抑制剂）。 
	注意：应新鲜配制胰蛋白酶抑制剂溶液。</li>
	<li>将0.1 g过硫酸铵溶于1 mL水中，配制过硫酸铵试剂（终浓度10%过硫酸铵）。 
	注意：过硫酸铵试剂应新鲜配制，或分装后保存于-20 °C冰箱中。</li>
	<li>将0.131 g 6-氨基己酸溶于1.0 mL超纯水中，配制氨基己酸溶液（ACA）（终浓度1 M 6-氨基己酸），并于4 °C保存。</li>
	<li>将1 g考马斯亮蓝G-250溶于0.5 mL水和0.5 mL 1 M氨基己酸中，配制考马斯亮蓝染料溶液（终浓度10%染料溶液）。</li>
	<li>为蓝色天然PAGE（BN-PAGE）配制5%皂苷溶液。根据样品制备所需量并额外增加体积以补偿移液误差（多估算10 mg），计算所需皂苷量。以15 mg为例：首先将15 mg皂苷溶于30 µL 100% DMSO中，涡旋助溶；然后加入剩余的90% ddH2O（270 µL），轻轻加热混匀（涡旋），再于冰上冷却。</li>
	<li>配制天然PAGE阳极缓冲液。将50 mL 20×天然PAGE电泳缓冲液加入950 mL水中，定容至1 L。应新鲜配制阳极缓冲液并立即使用。此缓冲液作为1×运行缓冲液使用。</li>
	<li>配制深蓝色阴极缓冲液。将0.0160 g考马斯亮蓝G-250溶于80 mL天然PAGE阳极缓冲液中，充分混匀。 
	注意：应新鲜配制阴极缓冲液并立即使用。通常仅需60 mL，但建议额外多配20 mL以防泄漏。</li>
	<li>配制浅蓝色阴极缓冲液。将20 mL深蓝色阴极缓冲液加入180 mL天然PAGE阳极缓冲液中，充分混匀。 
	注意：此缓冲液仅可使用一次。</li>
	<li>配制5%考马斯亮蓝G-250作为样品添加剂。将已配制的10%考马斯亮蓝储备液200 µL（见步骤1.8）与200 µL 1 M ACA混合稀释，于4 °C保存。</li>
	<li>通过将40%甘油、0.04%丽春红S、25 mM Tris-HCl（pH 6.8）和192 mM甘氨酸溶于水中，配制终体积为10 mL的4×天然PAGE样品缓冲液。分装后保存于-20 °C冰箱中。</li>
</ol>
2. 从冻存心脏组织中分离线粒体
注意：线粒体分离步骤需在 4 °C 的冷室中进行。若无冷室，可使用大尺寸冰浴替代。
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出先前冷冻的心脏组织样本。 
	注意：每天最多可舒适地处理四个组织样本用于线粒体分离。</li>
	<li>称量含有心脏组织样本的离心管并记录重量。准备三个烧杯（每个 50 mL），各加入 40 mL 洗涤缓冲液。在进行下一步之前，将每个烧杯置于冰盐浴中冷却 3-5 分钟（冰与盐等量混合）。在每个烧杯中放入磁力搅拌子，并将搅拌器调至中等速度。 
	注意：不要使烧杯过度结冰，应在冰晶云雾刚开始出现后立即使用。</li>
	<li>将冷冻的心脏组织直接放入第一个烧杯的冰冻溶液中。在搅拌的同时，用镊子轻轻按压组织，持续约 5 分钟，以尽可能去除血液。</li>
	<li>称量空离心管的重量，并从原始重量（步骤 2.2）中减去该值，得到心脏组织的净重。</li>
	<li>用镊子取出组织，用干净的滤纸或纸巾轻轻挤压心脏以去除残留血液，然后将组织转移至第二个烧杯中。在搅拌条件下静置约 5 分钟，以去除多余血液。</li>
	<li>用纸巾轻轻吸干组织表面水分，去除所有脂肪、凝固血液、耳状突起和筋膜（白色组织），然后收集心室组织。</li>
	<li>使用组织切碎机按照步骤 2.7.1–2.7.9 对组织样本进行切碎。
	<ol>
		<li>将心脏组织（约 50–300 mg）从推杆侧放入组织切碎机腔室中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用裂解盘、粉碎驱动器、管和样品制备工具的组织匀浆装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62809/62809fig01a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：与粉碎器配合使用的组织粉碎室（管）。使用粉碎管进行组织匀浆时，每个组织样本约需 10–12 秒。当匀浆后的组织完全通过带孔圆盘进入上层腔室时，匀浆过程即告完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62809/62809fig01alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>向管盖端加入约 0.2–0.8 mL 洗涤缓冲液。 
	注意：确保在匀浆过程中样本与洗涤缓冲液的总体积不超过 0.7–0.8 mL。</li>
	<li>使用管工具将匀浆室与匀浆盖紧密盖合。 
	注意：切勿过度拧紧匀浆盖。</li>
	<li>将匀浆室放入匀浆支架单元中，活塞端朝下。活塞将与匀浆支架中的接口啮合。</li>
	<li>插入匀浆驱动器的转头；使转头与匀浆盖啮合。确保转头已牢固锁定到位。 
	注意：务必使用完全充电的匀浆驱动器。</li>
	<li>手动向下施加压力于匀浆驱动器和匀浆室，直至匀浆支架上的压力指示器达到匀浆支架刻度上约 2 的位置。 
	注意：若组织纤维含量较高，可将压力设定在更高水平。</li>
	<li>在保持压力设定为 2 的同时，按下匀浆驱动器的触发开关，运行约 10–12 秒。</li>
	<li>观察管内情况，检查组织的固体物质是否全部或大部分已通过裂解盘被匀浆，并进入匀浆室的上腔。 
	注意：可能需要更长时间进行匀浆。此时可将管重新放回匀浆支架并继续操作。大多数类型的组织样本仅需 10–12 秒的匀浆时间。尽管所有匀浆过程都会因摩擦产生一定热量，但如此短的处理时间不会显著升高样本温度。</li>
	<li>匀浆完成后，将匀浆室从支架单元中取出。使用管工具卸下匀浆盖，并将其放置在洁净表面以备后续使用。 
	注意：匀浆盖应视为已被样本提取物污染，且根据样本类型，可能还含有传染性物质。请勿将同一匀浆盖用于其他组织样本，以防交叉污染。</li>
</ol>
<ol start="8">
	<li>将剪碎的心脏组织转移至含有40 mL洗涤缓冲液和搅拌子的第三个烧杯中，将烧杯置于搅拌器上，以中等速度搅拌5分钟。</li>
	<li>将悬液通过尼龙单丝滤膜（孔径74 µm）过滤，弃去滤液。用10 mL洗涤缓冲液在滤膜上清洗剪碎的组织3次。 
	注意：确保尼龙单丝滤膜已预先用清水润湿。</li>
	<li>将洗涤后的剪碎组织转移至含有20 mL洗涤缓冲液的50 mL烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器的冰浴中。在持续搅拌下加入0.5 mL胰蛋白酶溶液，搅拌孵育15分钟。在孵育过程约一半时（约7.5分钟），将组织悬液转移至一个可容纳0-15 mL体积的松口玻璃匀浆器（玻璃对玻璃）中进行匀浆。</li>
</ol>
<img alt="用于样品制备的玻璃对玻璃手持式匀浆器；黑色表面上的实验设备。" src="/files/ftp_upload/62809/62809fig01b.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：与匀浆器配合使用的组织剪切腔室（管）。 在剪切管中对组织进行匀浆处理每个组织样本约需10–12秒。当匀浆后的组织穿过带孔圆盘进入上层腔室时，匀浆过程即已完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62809/62809fig01blarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="11">
	<li>轻轻匀浆4-5次，使悬浮液分散均匀，避免产生泡沫。将匀浆液转移至50 mL烧杯中，在4 °C下置于搅拌板上轻轻搅拌混合15分钟。</li>
	<li>孵育15分钟后，向含有匀浆液的烧杯中加入10 mL含胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，在4 °C下边轻轻搅拌边孵育1分钟。</li>
	<li>再次通过尼龙滤膜过滤悬浮液，并将滤液收集至50 mL锥形管中。</li>
	<li>收集残留在尼龙滤膜上的颗粒组分，转移至玻璃匀浆器中。加入15-20 mL洗涤缓冲液，手动轻轻匀浆25-30秒。 
	注意：此步骤中滤液流速较慢。为加快滤液流动，可将漏斗尖端接触锥形管内壁。</li>
	<li>将匀浆液与滤液合并，平衡离心管后，在4 °C下以600 x g离心15分钟。</li>
	<li>将所得上清液通过尼龙滤膜过滤至新的锥形管中，以避免沉淀物污染。再次在4 °C下以8,500 x g离心15分钟。 
	注意：使用塑料移液枪头吸取上清液，并弃去蓬松沉淀物顶部约0.2 mL的上清液。</li>
	<li>弃去上清液，并用1 mL分离缓冲液对沉淀物冲洗2-3次。每次均需弃去外层蓬松的白色边缘层。 
	注意：使用带1 mL枪头的移液器或新的转移移液器加入分离缓冲液进行洗涤。将缓冲液加至管壁侧边，避免直接加在沉淀物上，以防破坏沉淀物并污染上清液。随后用转移移液器吸出缓冲液，并重复该过程两次。</li>
	<li>向每根离心管中加入5 mL分离缓冲液，使用带1 mL枪头的移液器或新的转移移液器将沉淀物打散。</li>
	<li>用额外20 mL分离缓冲液稀释悬浮液，再次在4 °C下以8,500 x g离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于5 mL重悬缓冲液中。然后加入15 mL更多缓冲液，总体积达20 mL，在4 °C下以8,500 x g离心15分钟。弃去上清液。所得棕色沉淀物即为洗涤后的完整线粒体。</li>
	<li>将富含线粒体的沉淀物重悬于250 µL重悬缓冲液中（含蛋白酶抑制剂）。分装为25 µL每份，液氮速冻后于-80 °C超低温冰箱中可保存数年。 
	注意：预留5 µL富含线粒体的样品用于蛋白质分析实验。如进行BN-PAGE（蓝色天然电泳）研究，将重悬后的沉淀物按每管含50 µg线粒体蛋白进行分装。在4 °C下以8,500 x g离心15分钟。小心吸除上清液，将线粒体沉淀（每份含50 µg蛋白）于-80 °C超低温冰箱中长期保存。</li>
</ol>
3. 线粒体电子传递复合体（ETC）评估
注意：可通过标准免疫印迹法检测单个线粒体电子传递链蛋白（即复合物 I、II、III、IV、V）。由于样本种类较多（四个时间点：48 小时、3 个月、6 个月、9 个月）、两种实验条件（运动组与久坐组）以及多种免疫探针抗体（五种抗体），建议采用多重免疫印迹法。操作步骤如下。
<ol>
	<li>将线粒体富集的蛋白质样品每孔 50 µg 在 4%–20% 浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离（100 V，90 分钟）。</li>
	<li>将蛋白质转移至 PVDF 膜（75 V，60 分钟）。</li>
	<li>在封闭缓冲液中 4 °C 下封闭膜至少 1 小时。 
	注意：封闭时间可延长至 4 °C 过夜。封闭缓冲液（材料表）含有非哺乳动物成分（例如鱼类蛋白），与抗体及其他哺乳动物蛋白发生特异性结合的可能性较低。</li>
	<li>使用包含抗复合物 I、II、III、IV 和 V 抗体的抗体混合液孵育膜，并在 4 °C 下于摇床上孵育过夜。</li>
	<li>次日，在室温下于摇床上用 IR 标记的二抗孵育膜 2 小时。</li>
	<li>用 1× TBS-T（含 Tween 20 的 TBS）洗涤五次，再用 1× TBS（Tris 缓冲盐水）洗涤一次。 
	注意：最后一次洗涤时，TBS 缓冲液中不要加入去污剂。</li>
	<li>在成像仪中对印迹膜进行成像。</li>
</ol>
4. 通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）评估线粒体超复合物
注意：也可通过 BN-PAGE 技术评估电子传递链的超复合体谱型。
<ol>
	<li>为每50 µg线粒体富集沉淀蛋白准备20 µL样品缓冲液混合液（7 µL水 + 5 µL 4x非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液 + 8 µL 5% Digitonin + 2 µL Coomassie G-250）。 
	注意：根据可用样品数量（每样品50 µg蛋白）配制储备样品缓冲液混合液。根据线粒体富集沉淀的蛋白浓度选择合适的Digitonin用量（参见表1）8。</li>
	<li>将Digitonin储备液在95 °C加热3分钟，混匀后置于冰上冷却，再配制主混合液。</li>
	<li>在将样品上样至凝胶前，立即加入Coomassie G-250样品添加剂。</li>
	<li>在含有50 µg线粒体蛋白沉淀的离心管中加入20 µL样品缓冲液混合液。用移液器轻轻吹打，使沉淀充分溶解/重悬，避免产生气泡。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育20分钟，以实现线粒体富集沉淀的最大程度溶解。孵育过程中间歇性轻轻弹动离心管，以促进溶解。</li>
	<li>在孵育期间，准备非变性PAGE阳极缓冲液/1x电泳运行缓冲液以及深蓝色阴极缓冲液。</li>
	<li>将已溶解的线粒体富集沉淀在4 °C下以20,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>离心后，将上清液15 µL转移至置于冰上的新离心管中。</li>
	<li>向步骤4.8中获得的上清液加入适量的5% Coomassie G-250试剂（参见表1）。 
	​注意：5% Coomassie G-250的体积应使染料的最终浓度为去垢剂浓度的1/4。此步骤应在上样前立即进行。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>蛋白质</td>
			<td>皂苷/蛋白质</td>
			<td>4倍样品缓冲液</td>
			<td>5% 皂苷</td>
			<td>水</td>
			<td>终体积</td>
			<td>5% 考马斯亮蓝 G-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>比例（g/g）</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>样品添加物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 µg</td>
			<td>8</td>
			<td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 µg</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>11</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：两种不同去垢剂/蛋白比例的样品缓冲液配制。 为了最大程度溶解线粒体悬液中的膜蛋白，应将皂苷/线粒体悬液蛋白浓度调整至4–8 g 皂苷/g 蛋白之间。在心脏组织中，使用400 µg 皂苷处理50 µg线粒体悬液蛋白（即8 g 皂苷/g线粒体蛋白），以最大程度溶解线粒体悬液中的超复合物。
<ol start="10">
	<li>倒入3%-8%的梯度凝胶，取出梳子，并用1×电泳缓冲液冲洗凝胶孔三次。 
	注意：凝胶最好在使用前一天配制，以利于充分聚合。</li>
	<li>组装电泳装置，并将凝胶放入电泳仪中。</li>
	<li>用深蓝色阴极缓冲液填充样品孔。</li>
	<li>在凝胶两端的孔中各加入10 µL未染色的蛋白质标准品，作为天然分子量标记。</li>
	<li>使用平头加样吸头，将步骤4.9中制备的全部样品上清液与考马斯亮蓝加样缓冲液混合物加入凝胶孔中。</li>
	<li>小心地用约60 mL深蓝色阴极缓冲液填充迷你电泳槽的内槽（inner chamber），注意不要扰动样品孔中的样品，然后在外槽中加入天然PAGE 1×电泳缓冲液。</li>
	<li>打开电源，以150 V电压电泳约30分钟。</li>
	<li>用移液器或抽吸方式移除内槽中深蓝色的阴极缓冲液（或样品孔中的液体），向内槽加入150–200 mL浅蓝色阴极缓冲液，然后以250 V电压继续电泳60分钟。 
	注意：电泳时间可根据染料前沿迁移至凝胶底部上方约0.5 cm处来判断是否结束。</li>
	<li>从玻璃板中取出凝胶，并将其放入洁净的塑料容器中。在摇床或旋转摇床上用高质量的蒸馏水洗涤凝胶15分钟。 
	注意：从玻璃板中取出梯度凝胶时，应从底部（较坚固的一侧）操作，以减少凝胶破裂的风险。</li>
	<li>倒去水，将凝胶完全浸入足量的考马斯亮蓝染色试剂（Coomassie GelCode Blue stain reagent）中，在室温下于旋转摇床中孵育1小时。 
	注意：使用前应通过轻轻旋转瓶身数次，充分混匀蓝色染色试剂（材料表）溶液。</li>
	<li>倒去染色液，加入蒸馏水，用水多次漂洗，然后置于旋转摇床上进行脱色。 
	注意：在凝胶脱色容器中放入一块海绵（约3 cm × 0.5 cm），并将凝胶置于其中过夜脱色。海绵可吸附染料颗粒，避免频繁更换水。</li>
	<li>使用图像分析仪对凝胶进行分析。</li>
</ol>
5. 通过免疫印迹分析评估线粒体超复合物
<ol>
	<li>进行一组新的BN-PAGE实验，在电泳结束后不对接胶进行染色。</li>
	<li>按照第3节（线粒体电子传递复合物（ETC）评估）中的相同步骤完成免疫印迹。</li>
</ol>

<ol><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li>
<li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).</li>
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<li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Isolation+of+Functional+Mitochondria+from+Whole+Rat+Heart+Using+a+PBI+Shredder+and+Pressure+Cycling+Technology+%28PCT%29%22">Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT)</a>. , South Easton, MA. (2010).</li>
<li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).</li>
<li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案的关键步骤如下。首先，组织匀浆过程需谨慎操作，避免在匀浆过程中施加过强的剪切力。应使用组织剪切器进行初步匀浆，该装置是压力循环技术（PCT）的一部分9。此步骤可减少玻璃-玻璃匀浆器（图1B）过度的往复运动，从而避免因组织处于冷冻状态而本就脆弱的线粒体受到进一步破坏。其次，冷冻组织的重量至关重要，以确保获得足量的线粒体富集样品。建议起始组织用量应大于0.8 g，具体用量取决于组织来源。心脏组织富含线粒体10,11，因此该推荐用量足以获得线粒体富集样品。第三，所有操作均应在低温环境（冷室）中进行。若无冷室，使用大容量冰浴亦可满足要求。
本研究证实了从先前冷冻的心脏组织中获取线粒体富集样品的可行性。该方案对于利用存档的冷冻组织进行线粒体分离及线粒体电子传递链（ETC）酶复合体评估至关重要。最近一项研究表明，先前冷冻的组织和细胞中的线粒体呼吸功能亦可被检测<su...

本实验方案的目的是提供详细的步骤，利用一种新型的低能量机械破碎技术，从先前冷冻的心脏组织中获得线粒体富集的制备物，该技术可改善组织裂解和线粒体提取效果。采用该方法，可在不产生高剪切力或高温的条件下，实现更高的提取效率，并将匀浆时间缩短至10–12秒1。
从存档的冷冻组织中获取线粒体是一种宝贵的资源，可用于开展功能性2和生物化学研究3，而这些研究在完全相同的实验条件下通常难以重复进行。经典的 Potter-Elvehjem 聚四氟乙烯研杵玻璃匀浆器或 Dounce 匀浆器已被广泛使用，并仍在科研实验室中用于匀浆肝脏、肾脏和脑等软组织。然而，对于肌肉和心脏等较硬组织的匀浆，则需要更长的匀浆时间、酶处理、高速匀浆以及丰富的操作经验。这使得从肌肉和心脏等硬组织中提取完整细胞器（如线粒体）变得不利。本方案所述的方法可用于获得高产量的线粒体富集样品，以分析从运动母猪和久坐母猪所产子代心脏组织中提取的线粒体电子传递链（ETC）蛋白复合物及其超复合物的形成情况。这些心脏组织经液氮速冻后于 -80 °C 保存，以备后续使用。该方法使研究者能够从先前冷冻保存的存档组织中分离出富含线粒体的组分。
妊娠期啮齿类动物暴露于外源性纳米材料可能对胎鼠在妊娠期间的心脏功能以及线粒体呼吸和生物能量学产生不利影响4。然而，妊娠期间有氧运动对胎鼠心肌细胞生物能量学的积极影响尚未见报道。不过，近年来的研究表明，妊娠期母体进行有氧运动对胎儿心脏功能具有积极影响5。为了进一步提供证据，本研究对妊娠期间母体运动对子代心脏线粒体呼吸链复合物（即复合物I至复合物V）的纵向影响进行了分析。
本研究具有重要的健康意义，因为研究结果可能表明母体运动可提高子代心肌线粒体能量生成的效率。本研究选用母猪（雌性猪）作为动物模型，原因有二：（i）其心脏生理学特征与人类相似6，以及（ii）在机构IACUC批准下，可从不同时间点的子代获取心脏组织。本研究旨在回答许多与母体运动及其对子代心脏组织细胞和生化组成潜在有益影响相关的基本科学问题。该研究方法需要采用温和而高效的线粒体分离技术，从以往长期且昂贵的纵向研究中获得的已冷冻保存的心脏组织中提取线粒体，这些纵向研究曾探讨妊娠期间胎儿心肌细胞内生物能量变化的问题。本研究所描述的方法使得大量先前冷冻存档的组织可用于富集线粒体的制备，从而支持后续的分析性和功能性研究。此外，本研究还将有助于填补该领域的知识空白，提供初步数据，为未来进一步探索母体运动对宫内及出生后心脏健康的影响奠定基础。

<table><tbody><tr><td>氨基己酸</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td></td></tr><tr><td>抗-Hu 总氧化磷酸化复合物试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>458199</td><td></td></tr><tr><td>抗-VDAC 抗体</td><td>abcam</td><td>ab15895</td><td>使用 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250</td><td>ThermoSientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 GelCode Blue</td><td>ThermoScientific</td><td>24592</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Cabiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>玻璃-玻璃研杵匀浆器</td><td>VWR</td><td>KT885451-0020</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio 软件</td><td>LICOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Dye 标记的抗兔抗体</td><td>LICOR</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>天然状态分子量标准蛋白</td><td>ThermoFisher</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>尼龙单丝筛网</td><td>Small Part Inc</td><td>CMN-74</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>ThermoScientfic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCT 匀浆器</td><td>Pressure Bioscience Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK 封闭缓冲液</td><td>ThermoScienctific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器 PULSE 管</td><td>Pressure Bioscience Inc</td><td>FT500-PS</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Amresco</td><td>M150-1G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Amresco</td><td>M191-1G</td><td>需新鲜配制</td></tr></tbody></table>

测量母猪后代冷冻保存心脏组织中的线粒体电子传递链复合物：评估运动诱导的线粒体生物能量学变化的模型

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

母猪妊娠期间规律运动可提高其子代心脏生物能量学的线粒体效率，该假说已被提出并验证。研究发现，运动母猪所产子代的心脏组织中线粒体电子传递链（ETC）复合物谱发生改变。为验证该假说，采用温和的线粒体分离方法分离线粒体，以评估线粒体ETC复合物及超复合物谱。本文所述方法可用于处理先前冷冻保存的心脏组织样本，从而无需新鲜制备线粒体即可完成对线粒体ETC复合物、超复合物及ETC复合物活性谱的分析。本方案详细描述了基于多重抗体免疫印迹法对ETC蛋白复合物进行最佳检测，以及利用蓝色天然凝胶电泳进行超复合物评估的技术流程。

按照该方案，从心脏组织中成功制备出产量良好的线粒体富集蛋白混合物。平均每1.2 g来自母猪后代的心脏冷冻组织可获得约15 mg/mL的线粒体富集蛋白混合物。观察发现，少于0.5 g的冷冻心脏组织无法获得足量的线粒体富集蛋白混合物，因而不足以进行BN-PAGE检测。所获得的线粒体样品量足以用于以下实验：（i）通过标准免疫印迹分析评估各电子传递链复合物（ETC）（即复合物I、II、III、IV和复合物V）；（ii）通过BN-PAGE结合免疫印迹分析评估线粒体超复合物；（iii）对特定复合物进行有限的酶活性检测。针对各个ETC蛋白复合物制备的抗体混合物在技术上具有可行性，可在单次免疫印迹实验中确保每种抗体特异性识别其对应的目标蛋白。
从母猪后代的心脏左心室中制备线粒体富集蛋白。这些后代来自两组母猪：（1）一组在妊娠期间进行运动，（2）另一组保持久坐状态。在出生后的不同时间点（48小时、3个月、6个月和9个月）采集两组后代的心脏组织。本研究旨在验证母体运动是否在妊娠期间对后代线粒体电子传递链（ETC）产生积极影响。由于线粒体富集分离过程耗时较长，每天可顺利处理四份心脏组织样本。
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从先前冷冻保存的实体组织样本中制备线粒体富集样品，使研究者能够在多种实验条件下对线粒体进行功能性和分析性评估。本研究展示了如何从冷冻的心脏组织中制备线粒体富集样本，并对线粒体进行分析性评估。

运动母猪所产仔猪的心脏组织中，线粒体电子传递复合物（ETC）谱发生改变。该假设……

本方案具有重要意义，因为它允许用户利用以往研究中采集并存档的冷冻组织来制备线粒体样品。该方案还可减少为获取组织而使用活体动物的需求。该技术通过采用温和的组织剪切方法，使用户能够利用先前冷冻保存的组织制备富含线粒体的样品。该制备方法可最大程度地提高线粒体制备的得率。建议在操作前仔细阅读实验方案，以确保所有组分和工具均已备齐，特别是确保组织破碎仪的驱动装置已充满电；同时建议先使用一些废弃组织进行练习，以熟悉各操作步骤。本次实验操作将由本实验室的研究助理 Edina Kosa 进行示范。首先，记录装有心脏组织的离心管重量。然后称量空离心管的重量，并从先前记录的重量中减去该值，以获得心脏组织的净重。将冷冻的心脏组织直接放入盛有冰浴溶液的烧杯中。搅拌5分钟。同时用镊子轻轻按压组织，尽可能去除血液。用镊子取出组织，并用干净的滤纸轻轻挤压心脏以去除血液。然后将组织放入另一个装有冰浴溶液的烧杯中。搅拌组织5分钟后，用纸巾轻轻吸干组织，并去除脂肪、凝固的血液、心耳和筋膜。汇集心室组织。为了破碎组织样本，将50至300毫克的心脏组织从推杆端放入组织破碎仪的破碎腔中，并关闭推杆端。然后向管盖端加入约0.2至0.8毫升洗涤缓冲液。使用管具将破碎仪盖紧密地盖在破碎腔上，注意不要过度拧紧。将撕碎室放入撕碎机支架单元中，使冲头侧朝下以实现卡合安装。将已充满电的撕碎机驱动器的钻头插入并卡紧到撕碎室盖中，确保钻头牢固锁定到位，然后向下施压于撕碎机驱动器，使其进入撕碎室，直至撕碎机支架上的压力指示器达到约2的设定值。按下触发开关，保持设定值为2，运行撕碎机驱动器约10至12秒。观察离心管，确保所有或大部分组织团块已通过裂解盘进入上层剪切室；如有必要，将离心管重新放回剪切仪支架中继续剪切。剪切完成后，将剪切室从支架装置中取出，并使用管子工具卸下剪切帽，将其放置于洁净表面以备后续使用——建议仅在同一份样品操作中重复使用，以避免来自其他组织样品的交叉污染。将剪切后的心脏组织转移至第三个烧杯中，烧杯内含40毫升洗涤缓冲液和一个搅拌子，将烧杯置于搅拌台上，以中等速度搅拌组织5分钟。将悬浮液通过预先润湿的尼龙单丝网筛进行过滤。弃去滤液后，用10毫升洗涤缓冲液在滤器上清洗切碎的组织三次。将清洗后的组织转移至一个50毫升烧杯中，加入20毫升洗涤缓冲液，并将烧杯置于磁力搅拌器的冰浴中。在持续搅拌的条件下加入 0.5 毫升胰蛋白酶溶液，搅拌 15 分钟。搅拌进行至大约一半时，将组织悬液转移至一个可容纳 15 毫升体积、研磨配合较松的手持式玻璃匀浆器中。用 4 到 5 次轻柔的上下研磨动作匀浆悬液，避免产生泡沫。然后，将匀浆液放入50毫升烧杯中，在搅拌板上混合。接着，向匀浆液中加入10毫升含有胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，边轻轻搅拌边孵育。再次通过尼龙滤膜过滤悬液后，将滤膜保存在50毫升锥形管中，并将留在滤膜上的颗粒部分转移至玻璃匀浆器中。加入15至20毫升洗涤缓冲液，用手轻轻匀浆25至30秒。将匀浆液与滤液合并后平衡离心管，离心，然后用塑料移液器吸走上清液，保留距离疏松沉淀顶部0.2毫升的液体。将所得上清液通过尼龙滤器过滤至新的锥形管中，以避免污染，并再次离心一次。弃去上清液后，通过向管壁侧面加入分离缓冲液来重悬沉淀，洗涤2至3次，以防止沉淀破碎或污染。每次均弃去松散的白色外层。向每根试管中加入5毫升分离缓冲液，使用带1毫升枪头的移液器或新的转移移液器将沉淀吹打分散。然后用额外的20毫升分离缓冲液稀释悬液，并在4°C条件下以8,500 × g离心15分钟。弃去上清液后，先将沉淀重悬于5毫升重悬缓冲液中，再加入15毫升重悬缓冲液，于4°C、8,500 × g离心15分钟。弃去上清液，保留含有洗涤后完整线粒体的棕色沉淀。将富含线粒体的沉淀重悬于250微升含有蛋白酶抑制剂的重悬缓冲液中。将悬浮液以25 µL体积分装，液氮中快速冷冻，然后在-80 °C超低温冰箱中可保存数年。按照本方案，从两组母猪所产仔猪的心脏组织中制备了线粒体富集蛋白，其中一组母猪在妊娠期间进行运动，另一组则保持静息状态。电子传递链（ETC）蛋白谱分析显示，运动母猪后代的某些ETC复合物水平相对降低。线粒体蛋白在3%至8%的梯度BN-PAGE中分离，并使用抗体混合物进行免疫印迹检测。运动组与久坐组均表现出多种超复合物。在运动组中观察到的显著超复合体增加出现在九个月时，相较于久坐组。从48小时、三个月、六个月和九个月不同年龄组获取的线粒体富集蛋白，通过动力学检测法分析了复合物I-II的活性。运动组的复合物I-II活性高于久坐组。其他研究者已证明，对从冷冻组织和细胞中获得的线粒体进行功能研究是可行的。从冷冻组织中制备线粒体的方法可广泛适用于多种组织，且造成的损伤极小。

measuring-mitochondrial-electron-transfer-complexes-previously-frozen

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物:评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。...

使用小鼠骨骼肌微量组织分离线粒体进行高通量微孔板呼吸测定

本文介绍了测量线粒体耗氧量（营养能量学的核心概念）以及质子漏（线粒体生成ATP效率低下的主要原因）的方法。这些结果可解释营养利用过程中30%的能量损失，有助于评估线粒体功能。...

测量荷斯坦奶牛肝脏线粒体耗氧量和质子泄漏动力学以估算线粒体呼吸

本实验方案的目的是阐述如何利用小鼠新生心肌细胞作为模型系统，研究各种因素对心脏耗氧量的影响。...

使用细胞外通量分析仪检测原代培养小鼠新生心肌细胞的耗氧率

我们设计并构建了一个移动实验室，用于测量在野外捕获的野生动物分离线粒体的呼吸速率。本文介绍了移动线粒体实验室的设计与装备，以及相关的实验方案。...

开发用于野外测量线粒体能量学的移动式线粒体生理学实验室

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

该方法利用线粒体通透性转换孔对低电导质子漏的贡献，测定新生脆性X综合征小鼠心肌细胞线粒体辅酶Q含量升高情况下孔道开放的电压阈值，并与野生型对照小鼠进行比较。...

辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

马具有卓越的有氧运动能力，因此马的骨骼肌是研究马运动生理学以及哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了对马骨骼肌线粒体功能进行全面评估的技术方法。...

高分辨率荧光-呼吸测定法用于马骨骼肌

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

了解如何从冷冻心脏组织中制备线粒体富集样本用于线粒体电子转移复合物分析。该方案采用温和的组织研磨方法，可最大化线粒体产量，减少活体动物使用，适用于评估运动诱导的线粒体生物能量变化研究。

测量母猪后代冷冻保存心脏组织中的线粒体电子传递链复合物：评估运动诱导的线粒体生物能量学变化的模型

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