体内 通过脾T细胞流式细胞术筛选肿瘤来源的细胞外囊泡的免疫原性

该视频展示了如何使用流式细胞术评估肿瘤来源的细胞外囊泡或EV的体内免疫原性。本文所述的筛选方法相对容易执行，并且可以适应各种设置。在癌症中，鉴定具有特殊翻译相关性的免疫原性细胞外囊泡释放的条件。

因此，自体电动汽车可以用作个性化的抗癌治疗。演示程序的第一部分的将是我实验室的技术助理Tatiana Nedelko。为了开始制备细胞外囊泡或EV所需的细胞培养基，通过在4摄氏度下以100，000次g超速离心24小时来耗尽FCS培养基中的牛EV。

离心后丢弃沉淀。从培养物中收获表达卵清蛋白或B16-OVA细胞的小鼠B16黑色素瘤细胞，并用PBS洗涤细胞两次。然后，在EV耗尽的培养基中以每毫升400， 000个细胞的浓度接种细胞。

接下来，用每毫升30微克奥沙利铂处理B16-OVA细胞，并在37摄氏度下与未处理的对照样品孵育24小时。24小时后，收集上清液，在4摄氏度下以400次g离心5分钟。在以2， 000次g再次离心之前丢弃沉淀，在4摄氏度下离心30分钟。

丢弃沉淀后，通过220纳米PVDF膜过滤器过滤上清液到新鲜管中。然后，将1毫升上清液与0.5毫升特定的市售外泌体分离试剂混合。涡旋并将混合物转移到1.5毫升管中，然后在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，将混合物以10， 000次g在4摄氏度下离心60分钟。小心地丢弃上清液后，通过将1.5毫升管倒置在纸巾上，并通过细尖移液管抽吸而不接触底部的EV沉淀来除去剩余的滴剂。通过上下移液而不用吸头刮擦沉淀，将沉淀重悬于冷PBS中。

然后，从所有管中汇集EV。如果不立即使用，请将EV悬浮液以80摄氏度存放在硅化容器中长达28天，直到应用。为了用从4.0 x 10到第五个B16-OVA细胞分离的EV对治疗组中的每只小鼠进行免疫，将5微升EV悬浮液与55微升冷PBS混合。

接下来，用26至30号针头填充注射器，并加入60微升稀释的EV或PBS，然后立即将注射器放在冰上。将EV或PBS皮下接种到小鼠大腿的内侧。七天后重复免疫接种。

第一次治疗后14天，牺牲小鼠切除脾脏。然后，用湿润的100微米细胞过滤器和注射器的塑料柱塞捣碎切除的脾脏。将脾细胞冲洗到50毫升管中，其中有5至10毫升的冷却完全RPMI。

接下来，在4摄氏度下以400次g离心细胞五分钟，然后丢弃上清液。为了从细胞悬浮液中除去红细胞，在室温下用2毫升红细胞裂解缓冲液重悬并孵育细胞沉淀5分钟。然后，通过加入5至10毫升完全RPMI来停止反应，然后如前所述离心。

在完全RPMI中重悬细胞沉淀后，计数来自每只小鼠的细胞，并将200， 000个脾细胞的一式三份和200微升cRPMI放入具有U形底部的96孔板的每个孔中。然后，将板在37摄氏度下孵育48小时。48小时后，用每毫升5纳克Brefeldin A，每毫升PMA20纳克和每毫升1微克离子红霉素在37摄氏度下处理细胞培养物4小时。

孵育后，将脾细胞转移到具有V形底部的96孔板中，并用PBS洗涤细胞两次。将沉淀的脾细胞重悬于新制备的染色溶液中，并在4摄氏度下孵育细胞悬浮液30分钟，使其避光。对于固定和透化，在FACS缓冲液中洗涤脾细胞两次，然后将脾细胞重悬在每孔100微升的固定和透化溶液中，然后在黑暗中孵育，如前所述。

为了染色细胞内干扰素γ，在固定或透化缓冲液中洗涤脾细胞，然后在缓冲液中用1:200稀释的针对干扰素γ的荧光抗体重新发送细胞。在黑暗中以4摄氏度孵育脾细胞1至12小时。在FACS缓冲液中彻底洗涤和重悬后，根据手稿中解释的门控策略分析细胞毒性T细胞的活化。

在代表性图像中，显示了分析细胞毒性T细胞活化的门控策略。这些细胞被门控为单细胞，淋巴细胞亚群，活的CD3阳性T细胞和CD4阴性CD8阳性细胞毒性T细胞。评估干扰素γ的细胞内积累作为激活的替代标志物。

用来自肿瘤细胞的EV进行免疫后，研究了受体小鼠抗原特异性T细胞反应的诱导。与未治疗的EV相比，在遗传毒性应激条件下培养的肿瘤衍生的EV（例如奥沙利铂治疗）诱导脾细胞毒性T细胞的有效活化。经过车辆处理的动物组表现出最低的反应。

脾T细胞的活化是在离体再刺激后确定的，无论是否存在卵清蛋白。当肿瘤EV治疗动物的脾细胞在分析前用模型肿瘤抗原卵清蛋白重新刺激时，干扰素γ的产生增加。请注意，可重复的结果取决于电动汽车的持续隔离效率。

因此，确保EV颗粒完全及时地重悬以避免干燥。通过该协议，我们能够分析肿瘤细胞内的特定途径，以确定肿瘤细胞衍生EV的免疫原性。这可能为在癌症治疗中利用这种免疫原性EV铺平道路。