Name: 噬菌体对食源性病原体生物防治的有效性通过高通量设置进行评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 了解高通量筛选技术用于评估噬菌体鸡尾酒对食源性病原体的抗菌效果。该方法通过微孔板检测和光密度测量，帮助研究者优化噬菌体治疗方案并分析宿主相互作用。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC Discovery Grant，RGPIN-2019-04384）、加拿大创新基金会（项目编号 #38710）以及阿尔伯塔省重大创新基金的支持。我们感谢John Kastelic博士对稿件的编辑工作。

1. 缓冲液和试剂的准备
<ol>
	<li>配制500 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（15 g TSB粉末和500 mL超纯水），并进行高压灭菌。 
	注意：可在室温下保存最长3个月，或在4 °C下保存最长6个月。</li>
	<li>配制500 mL胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（20 g TSA粉末和500 mL超纯水），并进行高压灭菌。 
	注意：可在4 °C下保存最长3个月。</li>
	<li>配制500 mL磷酸盐缓冲液（PBS；4 g NaCl、0.1 g KCl、0.77 g Na2HPO4、0.12 g KH2PO4，加超纯水至500 mL），在25 °C下测定并调节pH至7.2 ± 0.2，然后进行高压灭菌。 
	注意：可在4 °C下保存最长6个月。</li>
	<li>配制200 mL 1 M MgSO4溶液（49.294 g，加超纯水至200 mL），并通过0.22 µm聚醚砜滤膜过滤除菌。</li>
	<li>配制500 mL含10 mM MgSO4的TSB培养基（mTSB；15 g TSB粉末、500 mL超纯水和5 mL 1 M MgSO4），高压灭菌后冷却至室温。采用无菌操作技术，使用血清移液管小心加入5.0 mL 1 M MgSO4，轻轻旋转混匀。</li>
</ol>
2. 细菌培养物的制备
<ol>
	<li>准备细菌研究实验室培养物（BRLC）时，从冷冻库中取出甘油保存管，并转移至实验室。</li>
	<li>使用一次性接种环或等效工具，浸入保存管中，取出少量接种物（冻结的冰状物），在II级生物安全柜内将其划线接种至TSA平板或等效培养基上。将平板置于37 ± 2 °C条件下培养15–18小时。</li>
	<li>将制备好的BRLC平板装入密封袋中，并在4 °C下保存。 
	注：BRLC的一般有效期为制备后在4 °C下保存14天。</li>
	<li>从待测的BRLC平板上挑取单个菌落，将每种 E. coli O157 菌株分别接种至10 mL TSB培养基中，在37 °C静置培养18小时，使其达到9 log10 CFU/mL。</li>
	<li>次日早晨，对过夜培养物进行系列稀释，每种 E. coli O157 菌株使用含10 mM MgSO4 的mTSB培养基稀释，使其浓度达到4–5 log10 CFU/mL（或其他所需接种浓度）。</li>
	<li>取每种菌株的过夜培养物等体积混合，使总体浓度达到4–5 log10 CFU/mL（或按需调整），以制备细菌混合液。</li>
	<li>立即将稀释后的细菌培养物置于4 °C保存，待用。</li>
	<li>将接种培养物稀释10倍或100倍，取0.1 mL稀释液分别涂布于TSA平板上，以获得单菌落。</li>
</ol>
3. 噬菌体工作溶液的制备
<ol>
	<li>按照标准方法增殖每种待筛选噬菌体的高滴度工作液（≥108 PFU/mL）4。 
	注意：噬菌体工作液在4 °C塑料瓶中保存的一般有效期为制备后3个月。</li>
	<li>为达到裂解动力学实验所需的滴度（例如约108 PFU/mL），用含10 mM MgSO4的mTSB稀释各噬菌体原液。将相同滴度的各工作液等体积混合，制备所有可能组合的噬菌体混合物。</li>
</ol>
4. 准备 体外 单个噬菌体及噬菌体混合物的裂解动力学
<ol>
	<li>在无菌的96孔微孔板的第1至第8列中，对每种噬菌体进行连续10倍稀释，以建立微孔板检测。 
	注意：每块平板上可对一种细菌菌株测试四种噬菌体，每种设两个复孔，置于相邻的列中。其余四列为对照组，不加噬菌体，以及mTSB空白对照图1).</li>
	<li>将180 µL mTSB加入第1至第12列的孔中&#160;96孔微孔板</li>
	<li>加入20 µL稀释后的单个噬菌体或噬菌体混合物（约108 PFU/mL）加入至微孔板顶行（A行）的第1-8孔中。</li>
	<li>对于无噬菌体对照和空白对照，向第9、10和11列的顶部孔中各加入20 µL mTSB。</li>
	<li>使用12通道移液器对板进行梯度稀释。每行之间转移20 µL。通过轻柔地反复吸液和排液（至少5次）混匀各孔内容物，每次稀释之间更换吸头。从最后一行（H行）移除20 µL。 
	注意：建议使用带滤芯的吸头，以防止交叉污染。</li>
	<li>为每种菌株设置一个储液槽，使用1 mL移液器将2-3 mL稀释后的菌液转移至储液槽中。对于第1至第10列，使用多通道移液器向每个孔中加入20 µL稀释后的细菌培养液。每次加样后更换吸头。</li>
	<li>将微孔板覆盖并在所需条件下孵育（例如，37 °C 孵育 10 小时或 22 °C 孵育 22 小时）。</li>
	<li>在2小时或其他预定时间点，从培养箱中取出微量滴定板。</li>
</ol>
5. 光密度的测定
<ol>
	<li>在600 nm处测定光密度（OD）600 nm使用酶标仪进行检测。 
	注意：建议在准备检测板之前，先在程序中设置并保存分析方案。</li>
	<li>打开酶标仪并启动程序。</li>
	<li>选择 简单 模式中的 启动选项 窗口并选择 创建新方案 在 任务管理器 (补充图 1a,b).</li>
	<li>来自 选择培养皿类型 窗口，选择 96孔板 从下拉列表中补充图2).</li>
	<li>选择 吸光度 检测方法， 终点法/动力学法 读取类型的选项，以及 单色仪 用于光学类型。点击“确定”(补充图3).</li>
	<li>对于读取步骤，请输入 600 nm 用于波长选择 正常 以读取速度。点击 好的 (补充图4).</li>
	<li>为实验设定温度，请点击 孵育 复选框并选择 培养箱 开启. 输入所需的温度 温度 盒。单击 好的为防止孵育过程中平板盖上产生冷凝，可通过输入一个数值来设置温度梯度1-3）在 梯度 盒。单击 好的 (补充图 5a). 
	注意：单击 继续下一步之前请先预热 勾选37°C孵育温度的复选框。22°C（室温）测试条件无需执行此步骤。</li>
	<li>接下来，单击 动力学 勾选以打开动力学设置。将运行时间设置为 37 °C 孵育 10 h 或室温 22 h。读取间隔设为 2 h。点击 好的 (补充图 5b).</li>
	<li>点击 振荡 复选框中的 实验步骤 设置动力学读数的振荡条件（如需要）补充图 6a).</li>
	<li>选择 线性 对于摇动模式，将持续时间更改为 30 秒。将线性频率值设置为 731 cpm（2 mm），然后点击 好的 (补充图 6b).</li>
	<li>在 方案摘要对话 窗口，单击 板布局 并选择 空白、检测对照与样品. 点击 下一步 (补充图7). 
	注意：输入 1 在 不同对照类型的数量 作为阴性对照。</li>
	<li>在为每种孔板类型设置参数后，单击 完成.</li>
	<li>选择一个 孔板编号 在左侧界面中选择，然后将其分配给板布局窗口中显示的矩阵。单击 好的 (补充图8).</li>
	<li>点击 读板 按钮，将方案保存为 .prt 文件，然后单击 保存 (补充图9).</li>
	<li>插入平板并点击 好的.</li>
	<li>实验完成后，将实验保存为 .xpt 文件，然后单击 保存 (补充图10).</li>
	<li>通过点击将数据导出到 Excel 是 消息窗口框中的按钮以进行进一步分析（补充图11).</li>
	<li>点击 保存 是/否 选择与 不再询问 复选框以保存偏好设置。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>按照上述方法至少重复两次独立实验。汇总所有独立试验的结果，计算每个噬菌体处理组和无噬菌体对照组培养物在OD600下的平均值和标准差。</li>
	<li>对600 nm处的OD值进行平方根转换，并针对每种细菌菌株和温度使用适当的统计模型进行分析。 
	注意：对于SAS软件，选择MIXED模型和最小二乘法进行均值差异分析（P &#60; 0.05）。针对每种菌株，将图A−G分配给各噬菌体处理组，其中不同时间点和MOI条件下的整体抗O157效果存在显著差异（P &#60; 0.05）。</li>
	<li>根据OD600nm值 ≤ 0.01定义优异的噬菌体效果，该值对应于无可检测的细菌生长（检测限：300 CFU/mL）。
	<ol>
		<li>使用适当的统计模型分析时间、培养温度、E. coli O157菌株、MOI和噬菌体类型对噬菌体效果的影响。 
		注意：对于SAS软件，使用带有随机效应的GLIMMIX模型。</li>
		<li>计算比值比（Odds Ratios），以比较不同环境和生物学因素在实现优异效果方面的差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li>
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<li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiololgy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712(2021).</li>
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<li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本方案描述了一种系统评估噬菌体对食源性病原体（包括产志贺毒素大肠杆菌，STEC）功效的可靠方法9 和 沙门氏菌10. 一个关键步骤是在稀释细菌过夜培养物时，建议使用预冷的培养基，并将稀释操作置于冰桶中进行，以最大限度减少潜在的细菌生长。此外，在稀释细菌培养物之前应预先制备噬菌体稀释液。步骤 2.8 中的计数操作提供了细菌接种量的实际数值，用于计算所施加的最终 MOI。对于噬菌体的制备，通常使用通过滤膜法从感染后 4–6 小时的细菌培养物中获得的粗制噬菌体裂解液。与噬菌体感染活性相关的关键步骤是始终使用在 3 个月内制备的噬菌体工作储备液。极其精确的移液操作（特别是使用多通道移液器时）以及操作方法的一致性，对于获得可比较且可解释的结果也至关重要。补充了 10 mM Mg 的改良 TSB2+ 用于稀释噬菌体、细菌培养物和基础培养基，以优化噬菌体的吸附与感染。
由于细菌在对数生长期即使在低于培养箱温度的条件下也会增殖，因此建议使用稀释的过夜培养物而非对数期培养物，以尽量减少潜在的细菌生长。
该方案存在一些局限性。首先，由于微孔板只能容纳 200 µL，长时间孵育可能导致显著的蒸发，因此不推荐进行长时间孵育。在这种情况下，该检测可能不适用于生长缓慢的细菌。其次，该方案无法监测噬菌体的扩增过程。第三，该方案无法监测噬菌体抗性随时间的发展情况，而这是决定噬菌体治疗效果的关键因素11,12。后续实验需要评估在筛选中表现最显著的噬菌体混合物在防止抗噬菌体突变体出现方面的进一步效果，可在大规模液体培养系统及其他生物基质中进行验证。
与传统的抗菌剂不同，噬菌体的生物学特性影响了其在实际应用中进行生物防控和治疗的复杂性。传统上，噬菌体鸡尾酒疗法的理性选择主要依据噬菌体的裂解活性及其宿主范围。通常推荐使用裂解活性最强、宿主范围最广的噬菌体候选株13,14。然而，根据本研究结果，尽管rV5和T1单独作用时的毒力不如T4和T5，但当它们与T4和/或T5联合使用时，显著促进了整体的生物防控效果。因此，为了获得更优的噬菌体鸡尾酒疗效，建议在目标环境条件下，系统性地筛选潜在噬菌体组合对靶向宿主菌株的抗菌活性。此外，确定噬菌体候选株的受体类型，并纳入具有不同受体识别能力的噬菌体，可能有助于避免对宿主附着位点的竞争，阻止抗噬菌体突变株的快速产生，并提升生物防控的效果13。
该方法实现了在高通量条件下对噬菌体裂解动力学的精确量化。此外，它还允许系统评估多种生物和环境因素对一系列噬菌体抗菌效果的影响，从而有助于优化噬菌体鸡尾酒配方以获得最佳效果。该方法未来的应用与发展预计将涉及 原位 通过荧光标记噬菌体来监测噬菌体鸡尾酒疗法中每种噬菌体的疗效。除了本方案外，了解噬菌体共感染同一宿主时促进协同效应和辅助作用的遗传决定因素，将有助于制定疗效更优的噬菌体组合方案。

噬菌体（phages）是一类天然侵入细菌细胞的病毒，可干扰细菌的代谢过程并导致细菌裂解。与传统抗菌药物（如抗生素）不同，噬菌体的宿主谱较窄，仅能感染特定的细菌种类或菌株，因此对有益于动物和人类健康的微生物群落产生的附带影响较小。随着抗菌药物耐药性（AMR）问题日益严重，噬菌体及其衍生物成为控制细菌性传染病（包括人和动物中的耐药菌感染）的替代性抗菌手段1,2。已有研究证实，噬菌体对&#62;20种引起人类浅表感染以及上呼吸道和胃肠道感染的细菌病原体具有治疗潜力3。
在农业环境中，基于噬菌体的生物防控策略是指利用噬菌体治疗性地控制细菌病原体。噬菌体生物防控被广泛视为一种绿色技术，可有效去除食源性病原菌（例如，产志贺毒素大肠杆菌） 大肠杆菌 （产志贺毒素大肠杆菌）， 沙门氏菌 和 单核细胞增生李斯特菌) 在多种食品中4,5此外，噬菌体可用作消毒剂，对食品加工表面和动物皮毛进行消毒，可整合到传统的抗菌系统（如化学试剂、蒸汽和热水巴氏消毒法）中，以增强预期效果并减少对环境的影响。利用噬菌体减少动物体内人畜共患细菌也具有广阔前景。1然而，为了使噬菌体生物防控技术能够广泛应用于多种食品生产系统，有必要解决一些技术难题。主要挑战在于细菌抗性突变体的出现会降低噬菌体的防控效果。5 以及由于暴露于环境胁迫因素导致的细菌生理学变化6.
为降低噬菌体耐药性的风险，建议使用噬菌体鸡尾酒疗法（即多种噬菌体的组合），该方法已在农业和水产养殖环境中提高了生物防控效果7。然而，多项研究已证实，噬菌体鸡尾酒疗法并不总是比单一噬菌体的应用更具优势。例如，由3种T4样噬菌体组成的鸡尾酒对E. coli菌株的宿主谱反而更窄8。此外，尽管在不同培养温度下，属于Tequintavirus属的AKFV33在清除牛肉中的E. coli O157方面，其效果仍优于由四种噬菌体组成的鸡尾酒4。最近有报道称，单个噬菌体的效果并不能预测其组合后对O157控制的总体功效9，因为多种噬菌体之间的相互作用可能改变整体疗效。最重要的是，许多因素，如噬菌体的属别与组合方式、靶向菌株及感染复数（MOI）、培养温度与时间等，均可能影响噬菌体之间的相互作用。因此，针对特定细菌仔细筛选噬菌体组合，以评估噬菌体间的协同或促进作用，或至少确保在特定环境条件下噬菌体间的拮抗作用最小化，对于实现最佳防控效果至关重要。本文描述了一种系统评估不同噬菌体组合在多种环境条件下对抗食源性病原体功效的方法。该方法的优势在于能够筛查所有可能影响噬菌体在自然环境中抗菌效果的生物与非生物因素。在本实验方案中，以STEC&#160;O157及其感染性噬菌体为例进行说明。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;必需的耗材、试剂和设备&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>1374361</td><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H₂O</td></tr><tr><td>带透明盖的培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>直径：100 mm，无菌</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-300XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014405</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite 多通道移液器 L12-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite 移液器，Unv. SL-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014412</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 RT LTS 1000&amp;micro;L FL 768A/8-低吸附</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips SR LTS 20&amp;micro;L F 960A/5</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005860</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips SR LTS 300&amp;micro;L 768A/4</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005867</td><td>无过滤</td></tr><tr><td>储液池</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>无菌、透明、带盖的96孔平底聚苯乙烯微孔板</td><td>Fisher</td><td>168055</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）</td><td>Sigma</td><td>105458-0500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>Sigma</td><td>105459-0500</td><td></td></tr><tr><td>T型细胞涂布棒</td><td>VWR</td><td>76299-566</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>模拟旋涡混合器</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型微生物培养箱</td><td>Fisher</td><td>50125590H</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌加热板</td><td>FIsher</td><td>13-889-335</td><td></td></tr><tr><td>多边形搅拌子</td><td>FIsher</td><td>14-512-125</td><td>长度：20 mm</td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Hybrid 多功能酶标仪</td><td>Fisher</td><td>BTNEO2M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;软件&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAS</td><td>SAS Institute</td><td>9.4</td><td></td></tr></tbody></table>

通过高通量条件评估噬菌体对食源性病原体的生物防控效果

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

细菌病原体持续威胁全球食品安全体系。随着人们对耐热和耐消毒剂细菌出现的担忧日益增加，亟需开发新型抗菌剂。基于噬菌体的生物防控策略是指利用噬菌体在农业环境中控制细菌病原体的治疗方法。噬菌体生物防控正逐渐被认可为一种可持续的技术，在消除食源性病原菌方面具有显著效果。为确保有效的生物防控效果，必须在特定环境条件下，系统性地筛选噬菌体组合对目标细菌的作用。噬菌体混合物的抗菌效果可能受到噬菌体属别与组合方式、目标细菌菌株、感染复数、温度和时间等因素的影响。为了配制出高效噬菌体混合物，本研究提出的方法是系统评估单个噬菌体及噬菌体混合物在特定条件下杀灭食源性细菌病原体的效果。通过在设定的温度和持续时间内测定光密度来监测细菌杀灭效果。以完全抑制细菌生长作为判定噬菌体高效性的标准。该方法是一种稳健、基于证据的策略，有助于配制出具有卓越抗菌效果的噬菌体混合物。

根据该方案，比较了抗 O157 噬菌体在不同噬菌体组合、温度、作用时间及感染复数（MOI）下的效果。孵育温度与时间、MOI、噬菌体种类以及所用细菌菌株对增强抗E. coli O157 效果的影响见表1（优势比表）9。在每种实验条件下，通过各噬菌体制剂测定光密度浊度值 ≤ 0.01 的百分比（%）。分析结果显示，在 22 °C 下孵育 14、16 或 18 小时后，抗 O157 噬菌体的效果达到最佳（P &lt; 0.001），且在 MOI = 1000 时效果最优（P &lt; 0.001），此时分别有 75% 和 89% 的噬菌体处理组培养物的生长被完全抑制。总体而言，在11种噬菌体制剂中，T1、T4 与 rV5 的混合制剂对 O157 的抑制效果最强（P &lt; 0.05）。此外，在不同孵育温度、时间、MOI 及噬菌体条件下，不同菌株对噬菌体的敏感性存在差异，其中 O157 菌株与 CO281-31N 菌株联用时敏感性最高（P &lt; 0.001），而 3081 菌株对噬菌体的敏感性最低（P &lt; 0.001）。
为了解每种受试细菌菌株的噬菌体杀灭动力学，将OD600值随各采样时间、感染复数（MOI）以及不同培养温度下的噬菌体处理情况进行绘图。在37 °C条件下，噬菌体对大肠杆菌（E. coli）O157 3081作用效果的代表性结果如图2所示。在评估噬菌体处理组的生长曲线抑制情况之前，需确认无噬菌体的对照组细菌生长曲线正常。根据图2，在37 °C条件下，仅需低至1的MOI，T4噬菌体在各个采样时间点均完全抑制了细菌的生长。为全面了解在不同温度下、不考虑MOI的情况下噬菌体随时间推移对细菌生长的抑制情况，将所有MOI（MOI &gt; 0）条件下的平均OD600nm值对各采样时间及噬菌体处理进行绘图（图3）。与37 °C相比，在22 °C条件下，某些噬菌体的杀灭效果增强，例如T4噬菌体以及T1 + T4联合噬菌体。另一种用于总结和比较不同噬菌体对O157总体抑制效果的方法见表2和表39。OD600值由各采样时间点和MOI条件下的数据取平均，并据此将噬菌体效果从高到低分级（37 °C时为A至F级，22 °C时为A至D级）。该表格有助于识别最优的噬菌体处理方案。例如，对于3081菌株，在37 °C时，T4噬菌体以及T5 + T4组合（A组）为最有效的处理方式；而在22 °C时，除T4噬菌体外，T1 + T4、T1 + T4 + rV5以及四种噬菌体混合制剂（A组）均为最有效的处理方式。
该方案还使我们能够比较噬菌体对不同靶向细菌菌株的裂解效果，并定制噬菌体组合。例如，在选择噬菌体时，在37 °C条件下，除菌株3081外，T1 + T4 + rV5噬菌体组合对所有其他菌株均表现出最显著的裂解效果，无论其噬菌体类型如何。在22 °C条件下，四联噬菌体混合物对所有测试菌株均具有最佳效果。最佳感染复数（MOI）可实现完全裂解（OD600 ≤ 0.01），表明在实验条件下具有潜在的更优疗效（表2 和 表3）。
<img alt="噬菌体稀释测定示意图；多孔板、细菌培养物、对照组、实验布局。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：96孔微孔板测定建议布局。 每种噬菌体的连续10倍稀释液在无菌96孔微孔板的第1-8列中进行制备。每块板上可在相邻列中以双复孔形式同时检测四种针对同一种细菌菌株的噬菌体。其余列为对照组保留。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="细菌菌株的生长曲线，OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 与时间（h）的关系，多条件图表分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：生长曲线 E. coli O157 菌株 3081 在 37 °C 在不同感染复数（MOI）下经噬菌体处理与未经噬菌体处理。 数据来自两次独立实验。柱状图表示标准偏差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="噬菌体治疗效率；OD600nm 与时间关系；生长曲线；比较分析；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：E. coli O157 菌株 3081 的生长曲线。（A）在 37 °C 下的生长曲线。（B）在 22 °C 下的生长曲线。每条曲线代表单独或混合培养物，在不同感染复数（MOI）条件下经噬菌体处理与未处理的情况。数据来自两次独立实验。误差线表示平均值的标准误差（改编自参考文献9，经许可）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：比较不同培养温度、培养时间、感染复数（MOI）、噬菌体种类及E. coli O157菌株条件下，噬菌体对E. coli O157抑制效果更优的比值比（改编自参考文献9，经许可）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：噬菌体在37 °C下对E. coli O157的总体效果（经许可改编自参考文献9）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：噬菌体在22 °C下对E. coli O157的总体效果（经许可改编自参考文献9）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图 1-11：酶标仪操作与实验流程的截图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种利用高通量条件筛选噬菌体混合物抗菌效果的可靠方法。

细菌病原体持续威胁全球食品安全体系。随着对耐热和耐消毒剂菌株出现的担忧日益增加……

本实验方案可在高通量条件下，于不同环境参数下评估多种噬菌体组合（亦称噬菌体鸡尾酒）的抗菌效果。该技术的主要优势在于能够系统性地调节可能影响噬菌体活性的各种生物与非生物因素（如温度），从而在多种环境条件下进行测试。本方法有助于设计更有效的噬菌体组合，以提升生物防控与治疗效果，并阐明细菌宿主与噬菌体之间的相互作用关系。首先，使用带滤芯的吸头设置微量滴定板实验，以避免交叉污染。在96孔微量滴定板的第1至第12列孔中加入180微升mTSB，然后在无菌96孔微量滴定板的第1至第8列孔中对每种噬菌体进行连续十倍稀释，以建立实验体系。将20微升的单个噬菌体或噬菌体混合液加入微量滴定板最上方A行的第1至第8孔中。对于无噬菌体对照和空白对照，在第9至12列的顶部孔中加入20微升mTSB。移液时，通过轻柔且重复的吸打至少5次混匀孔内液体，并在每次稀释之间更换吸头。从最末一行H中移除20微升液体，然后使用1毫升移液器将2至3毫升稀释后的菌液转移至储液槽中，为待测细菌菌株建立储液体系。使用多通道移液器，向第1至第10列的每个孔中加入20 µL稀释后的细菌培养液，每次加样后更换吸头。盖好盖子，将微孔板置于37 °C条件下孵育。每隔2小时将微孔板从孵育箱中取出，使用微孔板读板仪读取数据。或者，将培养板置于酶标仪中孵育，并随时间读取数据。若要使用酶标仪检测600纳米处的光密度，请先打开酶标仪上的程序，在启动选项窗口中选择“简单模式”，然后在任务管理器中选择“创建新方案”。在“选择板类型”窗口中，从下拉列表中选择 96 孔板。检测方法选择吸收光（Absorbance）作为读数类型，光学类型选择终点法/动力学法（Endpoint/Kinetic）选项，选择单色器（Monochromators），然后点击“确定”。在读数步骤中，波长输入 600 纳米，读数速度选择“正常”（Normal），然后点击“确定”。为实验设置温度时，勾选“孵育”（Incubate）复选框，并选择“开启孵育器”（Incubator On）。在温度输入框中输入所需温度，然后点击“确定”。对于 37 摄氏度的孵育温度，请勾选“继续下一步之前预热”复选框；但在 22 摄氏度的测试条件下，此选项并非必需。为防止孵育过程中板盖产生冷凝水，需在梯度输入框中输入数值以设置温度梯度，然后点击“确定”。接下来，勾选“动力学”（Kinetic）复选框以打开动力学设置。将运行时间设置为37摄氏度孵育10小时，或室温孵育22小时，并将读取间隔设为2小时，然后点击“确定”。在程序窗口中，如有需要，点击“摇动”复选框以设置每次动力学读数的摇动条件。选择“线性”作为摇动模式，并将持续时间更改为30秒。将线性频率值设置为每分钟731个循环，然后点击“确定”。在“方案摘要”对话框中，点击“板布局”，选择“空白对照”、“检测对照”和“样品”，然后点击“下一步”。定义每种孔类型的设置后，单击“完成”。在左侧界面中选择一个孔编号，将其分配给“板布局”窗口中显示的矩阵，然后单击“确定”。单击“读取板”按钮，将协议保存为 prt 文件，然后单击“保存”。插入板后，单击“确定”。实验完成后，将实验保存为 xpt 文件，然后单击“保存”。单击消息窗口框中的“是”按钮，将数据导出到 Excel 中以进行进一步分析。勾选“保存是/否选择”以及“不再询问”复选框以保存偏好设置。按照实验方案，对噬菌体在不同噬菌体组合、温度、时间及感染复数（MOI）条件下的效果进行了比较。根据该分析，抗 O157 噬菌体在 22 摄氏度下孵育 14、16 或 18 小时后，其效力达到最大。为了解噬菌体对细菌的杀灭动力学，将 600 纳米处的 OD 值对采样时间、感染复数（MOIs）和噬菌体处理进行作图。图中显示了在 37 摄氏度下处理的代表性细菌生长曲线。T4在每个采样时间点即使在低感染复数（MOI）下也完全抑制了细菌生长。为了分析噬菌体对细菌生长的抑制作用，将所有MOI条件下的平均OD值分别对各个采样时间点和噬菌体处理进行作图。两个温度下的代表性图谱显示，噬菌体的杀菌效果在22摄氏度下较37摄氏度有所增强，例如T1与T4联用时。展示了噬菌体总体效果的比较，有助于确定最佳的噬菌体治疗方案。例如，对于大肠杆菌3081菌株，在37摄氏度下，使用T4和T5加T4的噬菌体处理是最有效的治疗方案。然而，在22摄氏度下，除了T4外，T1加T4、T1加T4加rV5，以及四种噬菌体混合物均表现出有效性。进行此操作时，必须极其精确地移液，尤其是在使用多通道移液器时，操作的一致性对于获得可比较且可解释的结果至关重要。后续实验需要评估筛选中最具影响力的鸡尾酒疗法在大规模肉汤培养系统及其他生物基质中防止抗噬菌体突变体出现的进一步效果。

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