通过高通量条件评估噬菌体对食源性病原体的生物防控效果
2021年8月19日
本方案描述了一种利用高通量条件筛选噬菌体混合物抗菌效果的可靠方法。
本实验方案可在高通量条件下，于不同环境参数下评估多种噬菌体组合（亦称噬菌体鸡尾酒）的抗菌效果。该技术的主要优势在于能够系统性地调节可能影响噬菌体活性的各种生物与非生物因素（如温度），从而在多种环境条件下进行测试。本方法有助于设计更有效的噬菌体组合，以提升生物防控与治疗效果，并阐明细菌宿主与噬菌体之间的相互作用关系。
首先，使用带滤芯的吸头设置微量滴定板实验，以避免交叉污染。在96孔微量滴定板的第1至第12列孔中加入180微升mTSB，然后在无菌96孔微量滴定板的第1至第8列孔中对每种噬菌体进行连续十倍稀释，以建立实验体系。将20微升的单个噬菌体或噬菌体混合液加入微量滴定板最上方A行的第1至第8孔中。
对于无噬菌体对照和空白对照，在第9至12列的顶部孔中加入20微升mTSB。移液时，通过轻柔且重复的吸打至少5次混匀孔内液体，并在每次稀释之间更换吸头。从最末一行H中移除20微升液体，然后使用1毫升移液器将2至3毫升稀释后的菌液转移至储液槽中，为待测细菌菌株建立储液体系。
使用多通道移液器，向第1至第10列的每个孔中加入20 µL稀释后的细菌培养液，每次加样后更换吸头。盖好盖子，将微孔板置于37 °C条件下孵育。每隔2小时将微孔板从孵育箱中取出，使用微孔板读板仪读取数据。
或者，将培养板置于酶标仪中孵育，并随时间读取数据。若要使用酶标仪检测600纳米处的光密度，请先打开酶标仪上的程序，在启动选项窗口中选择“简单模式”，然后在任务管理器中选择“创建新方案”。
在“选择板类型”窗口中，从下拉列表中选择 96 孔板。检测方法选择吸收光（Absorbance）作为读数类型，光学类型选择终点法/动力学法（Endpoint/Kinetic）选项，选择单色器（Monochromators），然后点击“确定”。在读数步骤中，波长输入 600 纳米，读数速度选择“正常”（Normal），然后点击“确定”。为实验设置温度时，勾选“孵育”（Incubate）复选框，并选择“开启孵育器”（Incubator On）。在温度输入框中输入所需温度，然后点击“确定”。对于 37 摄氏度的孵育温度，请勾选“继续下一步之前预热”复选框；但在 22 摄氏度的测试条件下，此选项并非必需。为防止孵育过程中板盖产生冷凝水，需在梯度输入框中输入数值以设置温度梯度，然后点击“确定”。接下来，勾选“动力学”（Kinetic）复选框以打开动力学设置。
将运行时间设置为37摄氏度孵育10小时，或室温孵育22小时，并将读取间隔设为2小时，然后点击“确定”。在程序窗口中，如有需要，点击“摇动”复选框以设置每次动力学读数的摇动条件。选择“线性”作为摇动模式，并将持续时间更改为30秒。将线性频率值设置为每分钟731个循环，然后点击“确定”。在“方案摘要”对话框中，点击“板布局”，选择“空白对照”、“检测对照”和“样品”，然后点击“下一步”。
定义每种孔类型的设置后，单击“完成”。在左侧界面中选择一个孔编号，将其分配给“板布局”窗口中显示的矩阵，然后单击“确定”。单击“读取板”按钮，将协议保存为 prt 文件，然后单击“保存”。插入板后，单击“确定”。实验完成后，将实验保存为 xpt 文件，然后单击“保存”。
单击消息窗口框中的“是”按钮，将数据导出到 Excel 中以进行进一步分析。勾选“保存是/否选择”以及“不再询问”复选框以保存偏好设置。按照实验方案，对噬菌体在不同噬菌体组合、温度、时间及感染复数（MOI）条件下的效果进行了比较。
根据该分析，抗 O157 噬菌体在 22 摄氏度下孵育 14、16 或 18 小时后，其效力达到最大。为了解噬菌体对细菌的杀灭动力学，将 600 纳米处的 OD 值对采样时间、感染复数（MOIs）和噬菌体处理进行作图。图中显示了在 37 摄氏度下处理的代表性细菌生长曲线。
T4在每个采样时间点即使在低感染复数（MOI）下也完全抑制了细菌生长。为了分析噬菌体对细菌生长的抑制作用，将所有MOI条件下的平均OD值分别对各个采样时间点和噬菌体处理进行作图。两个温度下的代表性图谱显示，噬菌体的杀菌效果在22摄氏度下较37摄氏度有所增强，例如T1与T4联用时。
展示了噬菌体总体效果的比较，有助于确定最佳的噬菌体治疗方案。例如，对于大肠杆菌3081菌株，在37摄氏度下，使用T4和T5加T4的噬菌体处理是最有效的治疗方案。然而，在22摄氏度下，除了T4外，T1加T4、T1加T4加rV5，以及四种噬菌体混合物均表现出有效性。
进行此操作时，必须极其精确地移液，尤其是在使用多通道移液器时，操作的一致性对于获得可比较且可解释的结果至关重要。后续实验需要评估筛选中最具影响力的鸡尾酒疗法在大规模肉汤培养系统及其他生物基质中防止抗噬菌体突变体出现的进一步效果。
概述
本方案描述了一种利用高通量条件筛选噬菌体混合物抗菌效果的可靠方法。该技术通过在不同条件下评估多种噬菌体组合，以提高治疗效果。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 噬菌体疗法
- 抗菌筛选
背景
- 噬菌体是能够感染细菌的病毒，可用作生物防控制剂。
- 噬菌体混合制剂可增强针对细菌感染的治疗效果。
- 高通量筛选技术可实现对多种条件的同步评估。
- 了解噬菌体与细菌宿主之间的相互作用对于实现有效治疗至关重要。
研究目的
- 评估不同噬菌体混合物的抗菌效果。
- 确定环境因素对噬菌体活性的影响。
- 促进针对细菌感染的优化噬菌体治疗方案的设计。
使用的方法
- 采用噬菌体系列稀释液进行微孔板实验设置。
- 在受控温度下孵育微孔板。
- 在600 nm处测定光密度以评估细菌生长情况。
- 数据分析以比较不同条件下噬菌体的效力。
主要结果
- 噬菌体T4在低感染复数（MOI）下可有效抑制细菌生长。
- 在特定的孵育时间和温度下观察到噬菌体的最佳效应。
- 噬菌体混合制剂的效果因细菌菌株和实验条件的不同而有所差异。
- 精确的移液操作和方法的一致性对获得可靠结果至关重要。
结论
- 该方法为评估噬菌体鸡尾酒疗法提供了一种系统性的途径。
- 尚需进一步研究以评估最有效噬菌体组合的性能。
- 深入了解噬菌体与细菌的相互作用可有助于改进治疗策略。
常见问题
行业重要性概述
系统性高通量评估噬菌体鸡尾酒疗法可在多种环境条件下，快速、定量地评价其对食源性病原体的抗菌效果。该方法有助于提高生物防控剂筛选的预测可信度，并降低新型抗菌策略在早期阶段组合决策中的风险。整合可靠的筛选数据可加速从发现到规模化生物防控解决方案的转化，应用于食品安全与农业生物技术领域。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在多种菌株和条件下对噬菌体-细菌相互作用进行定量研究。
- 支持对候选噬菌体组合在靶向病原体控制中的功能验证。
- 通过揭示环境因素对噬菌体功效的影响，促进作用机制层面的风险评估。
- 为生物防控制剂的后续开发提供基于数据的优先排序依据。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化、可重复的基于微孔板的检测方法，用于高通量噬菌体疗效筛选。
- 生成定量的光密度读数，以直接比较不同噬菌体处理的效果。
- 支持对噬菌体组合、感染复数（MOI）及环境变量进行可扩展的评估。
- 为后续优化和制剂工作流程准备经过验证的生物系统。
转化与临床前研究
- 将筛选结果与食品安全及农业生物防控应用的转化需求相匹配。
- 支持从体外发现到相关基质中临床前验证的连续性研究。
- 为具有更优疗效特征的噬菌体鸡尾酒疗法的风险评估与推进提供依据。
- 提供机制性见解，以指导耐药管理策略的制定。
流程与工作流整合
这种高通量筛选方法连接了噬菌体介导的生物防控的早期发现与先导物识别，支持基于数据的候选鸡尾酒疗法的筛选与优化。
- 发现生物学：量化噬菌体与细菌的相互作用，并阐明在不同条件下疗效的决定因素。
- 筛选：标准化检测条件，实现噬菌体疗效的可重复、可扩展的评估。
- 分析：提供动力学光密度测量，用于对处理组进行可靠的统计学比较。
- 转化研究：促进从体外筛选到食品安全领域临床前评估的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于持续优化噬菌体鸡尾酒配方及耐药性监测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高噬菌体筛选的预测可信度，降低生物防控效果的机制模糊性。
- 操作价值：增强抗菌筛选工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的决策，推动资本高效地推进生物防控候选方案。
- 组合影响：实现基于风险调整的优先排序，推动性能更优的噬菌体鸡尾酒疗法的开发。
实施注意事项
- 需要具备微生物学、噬菌体生物学和定量检测设计方面的专业知识。
- 需要配备酶标仪、可控温培养设备以及数据分析基础设施。
- 要求具备严谨的移液操作技术，并在不同实验团队间实现标准化，以确保可重复性。
- 针对不同细菌菌株或环境基质可能需要进行方法优化与调整。
- 为推进转化应用，需在更大规模或更复杂的生物系统中进行后续验证。
