光学汽化全氟化碳纳米液滴的配方和声学调制
July 16th, 2021
光学活化全氟化碳纳米液滴在血管系统以外的成像应用中显示出前景。本文将演示如何合成这些颗粒，交联聚丙烯酰胺模型，并在声学上调制液滴以增强其信号。
该协议允许简单快速地合成光学汽化的全氟化碳纳米液滴，并提供一种增强这些颗粒性能的方法。人版只需先操纵超声成像的相位即可增强对比度。它不需要额外的设备，可以在任何可编程超声系统上执行。
首先用氯仿冲洗10毫升圆底烧瓶，并通过反复吸出整个注射器体积并总共排出三次，用氯仿洗涤10微升和1毫升气密玻璃注射器。使用注射器，将200微升每毫升25毫克DSPE-mPEG-2000，8微升每毫升10毫克DSPC和1毫升每毫升IR-1048一毫克加入圆底烧瓶中。请记住清理脂质或染料之间的注射器，以防止库存污染。
使用旋转蒸发器除去溶剂。确保真空度缓慢调节到 332 毫巴以防止碰撞。五分钟后，将压力降低到 42 毫巴，以去除可能已进入溶液的任何水。
将脂质饼悬浮在一毫升PBS中，并在室温下超声处理或涡旋五分钟，或直到所有脂质饼悬浮并溶解在溶液中。将溶液转移到七毫升玻璃小瓶中，并将小瓶放入装满冰块的玻璃盘中，让溶液冷却五分钟。用全氟己烷冲洗气密玻璃注射器。
然后使用注射器向小瓶中加入50微升全氟己烷。探头对混合物进行超声处理，振幅设置为 1，处理时间设置为 20 秒，脉冲开启设置为 1 秒，脉冲关闭设置为 5 秒。然后按照文本手稿中提到的方式更改设置，并再次对混合物进行超声处理。
将纳米液滴溶液转移到1.5毫升离心管中，并以300g离心三分钟，以将超过一微米的较大液滴与较小的液滴分离。弃去沉淀并将上清液转移到另一个1.5毫升离心管中。通过以3， 000g离心5分钟来洗涤上清液，以沉淀溶液中的所有液滴。
通过上下移液将沉淀重新悬浮在一毫升PBS中，然后在浴槽中超声处理一分钟。通过将 10 微升 PFCnD 储备液加入 990 微升 PBS 和浴超声处理以分散 PFCnD 以分散 PFCnD 在测量其大小之前，将原液 PFCnD 稀释 100 倍。使用动态光散射测量液滴的大小。
通过在500毫升的真空烧瓶中填充400毫升去离子水来脱气水，用橡胶软木塞密封，然后将烧瓶连接到真空管路。打开真空管路，将烧瓶底部浸入浴声波器中。超声处理五分钟或直到看不到气泡形成。
通过将500毫克溶解在5毫升脱气水中，制备每种硫酸盐溶液10%铵。如果过硫酸铵没有完全溶解，轻轻旋转溶液。在搅拌板上装有搅拌棒的400毫升烧杯中，加入150毫升脱气水和50毫升40丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液，形成200毫升10%丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液。
以 200 RPM 的速度搅拌混合物，以便在不引入气泡的情况下进行适当混合。称取400毫克二氧化硅，加入10%丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液中，形成0.2%的二氧化硅和丙烯酰胺溶液。通过从塑料转移移液器上切断吸头并用实验室胶带将其支撑在模具中，准备带有圆柱形内含物的方形模具。
向烧杯中加入两毫升10%过硫酸铵溶液，使终浓度为0.1%，并向幻影溶液中加入250微升TEMED。让溶液搅拌不到一分钟。快速将溶液倒入模具中，同时注意不要将气泡引入溶液中。
溶液应在10分钟内聚合。通过将实验室刮刀的平端绕模具边缘并倒置模具来去除幻影。按照制造商的说明打开并预热脉冲激光系统约 20 分钟。
确保光纤束正确连接到激光输出，并且两个支腿正确放置在光纤束支架内。打开超声成像系统后，将阵列成像换能器连接到系统，并将换能器固定在支架内，使其成像平面与激光横截面对齐。将激光系统的脉冲重复频率设置为 10 赫兹，并在光纤束的末端放置一个功率计以测量能量。
调整 Q 开关延迟，直到估计的通量为每平方厘米 70 毫焦耳。使用一毫升塑料滑头注射器用超声凝胶和PFCnD混合物回填聚丙烯酰胺模型中的一个通道。用超声波凝胶自由覆盖通道顶部，并用一毫升塑料滑头注射器去除任何气泡。
最后，将聚丙烯酰胺模型放在换能器和光纤束下方。PFCnDs的成功配制和离心分离产生直径约为200至300纳米的液滴。由于在称为奥斯特瓦尔德成熟过程中的聚结和扩散，液滴的大小随着时间的推移而增加。
发现末端脉冲的内含物对比度大约是P脉冲的3.2倍，提高了220%。计算每帧的高回声面积，并通过第一帧的高回声面积归一化，然后拟合到指数衰减模型。归一化高回声区的特征衰减时间在N脉冲成像中比P脉冲长3.5倍。
B模差分图像帧在每次N脉冲和P脉冲成像中及时记录。最重要的事情之一是排出烧瓶底部的脂质，以确保它们被正确掺入脂质饼中。
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概述
本文介绍了一种合成光学汽化全氟碳纳米液滴并增强其成像性能的协议。该方法允许通过声学调制来提高信号对比度，而无需额外的设备。
关键研究组成部分
科学领域
- 成像应用
- 纳米技术
- 超声技术
背景
- 全氟碳纳米液滴在血管系统外的成像方面具有前景。
- 声学调制可以增强成像信号。
- 合成过程简单高效。
- 实施过程中不需要专门的设备。
研究目的
- 展示全氟碳纳米液滴的合成。
- 提供一种增强成像性能的方法。
- 促进这些颗粒在各种成像应用中的使用。
使用的方法
- 用氯仿冲洗和准备注射器。
- 向圆底烧瓶中添加特定的脂质和染料。
- 交联聚丙烯酰胺幻影。
- 声学调制液滴以增强信号。
主要结果
- 成功合成光学汽化全氟碳纳米液滴。
- 展示了成像对比度的增强。
- 该协议可以在标准的可编程超声系统上执行。
- 在非血管成像背景下的潜在应用。
结论
- 光学激活的全氟碳纳米液滴在成像中有效。
- 该方法易于实现，且不需要专门的设备。
- 值得进一步探索在各种成像领域的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optically vaporized perfluorocarbon nanodroplets enable non-vascular ultrasound imaging by extravasating to target sites and generating on-demand contrast through laser-triggered vaporization. This approach supports mechanistic de-risking in target validation by providing repeatable, background-free signal for preclinical imaging studies. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing multiplexed, super-resolution imaging without vascular confinement limitations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in extravasated tissue compartments using optically triggered nanodroplets.
- Operational Value: Supports biological de-risking through repeatable contrast generation for longitudinal target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantifiable acoustic readouts after optical droplet vaporization for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates screening readiness via consistent submicron droplet size (200–300 nm) post-centrifugal separation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by enabling contrast enhancement in deep tissue models via optical and acoustic modulation.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation through reprocessable "blinking" nanodroplets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical imaging, supporting lead identification with enhanced signal specificity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling non-vascular imaging of target-rich tissues via extravasatable nanodroplets.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible droplet synthesis and size-selective centrifugation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., hyperechoic area, decay time) for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via recondensable droplets that allow repeated imaging sessions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for contrast-enhanced ultrasound across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through background-free, on-demand contrast for mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardization and scalability via probe sonication and centrifugal purification workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false positives in preclinical imaging through multiplexing capability.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by super-resolution imaging of target modulation in extravasated spaces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid nanoparticle formulation and probe sonication parameters.
- Needs access to programmable ultrasound systems and pulsed laser systems for optical triggering.
- Demands cross-team standardization of lipid synthesis and phantom preparation for consistent results.
- Involves adaptation considerations for varying perfluorocarbon core boiling points and optical absorber loading.
- Practical limitation: Droplet size increases over time due to Ostwald ripening, requiring timely use post-synthesis.
