Name: 光学汽化全氟化碳纳米液滴的配方和声学调制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习光学汽化全氟化碳纳米液滴的合成配方与声学调制方法，用于增强超声成像对比度。该技术无需额外设备，可在标准可编程超声系统上实现，适用于非血管成像应用。

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本工作部分由乳腺癌研究基金会（资助号：BCRF-20-043）资助。

1. 全氟碳纳米液滴的配制
<ol>
	<li>用氯仿冲洗一个10 mL的圆底烧瓶，并用氯仿清洗一支10 µL和一支1 mL的气密玻璃注射器，通过反复抽吸和排出注射器的全部体积，共操作三次。 
	注意：氯仿具有挥发性，吸入后可能有毒。所有涉及该溶剂的操作均应在通风橱中进行。</li>
	<li>使用注射器将200 µL的DSPE-mPEG2000（25 mg/mL）、6.3 µL的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC，25 mg/mL）和1 mL的IR 1048（1 mg/mL，溶于氯仿）加入圆底烧瓶中。在不同脂质或染料之间使用前请务必清洗注射器，以防止原液污染。 
	注意：红外染料对光敏感，操作应在避光条件下进行，或将烧瓶用铝箔包裹。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪除去溶剂。确保将真空度缓慢调节至332 mbar，以防止暴沸。5分钟后，将压力进一步降低至42 mbar，以去除可能进入溶液的水分。 
	注意：脂质薄膜可在4 °C、用封口膜密封的圆底烧瓶中过夜保存。</li>
	<li>将脂质薄膜用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，并在室温下超声或涡旋5分钟，直至脂质完全溶解。再额外超声2分钟以均质化溶液。</li>
	<li>将溶液转移至一个7 mL玻璃小瓶中，并将小瓶置于盛有冰块的玻璃容器中，使溶液冷却5分钟，然后使用气密玻璃注射器加入50 µL全氟己烷。在将全氟己烷注入小瓶前，请务必先用其冲洗注射器。</li>
	<li>将含有脂质并置于冰浴中的玻璃小瓶放入探头式超声仪腔体内，将探头尖端浸入液面以下。确保超声探头侧面不接触玻璃小瓶瓶口。</li>
	<li>按以下参数进行探头超声处理：振幅1，处理时间20秒，脉冲开启1秒，脉冲关闭5秒。随后按以下参数继续超声：振幅50，处理时间5秒，脉冲开启1秒，脉冲关闭10秒。</li>
	<li>将纳米液滴溶液转移至1.5 mL离心管中，在300 × g条件下离心3分钟，以分离较大液滴（&#62;1 µm）与较小液滴。</li>
	<li>弃去沉淀，将上清液转移至另一支1.5 mL离心管中。通过在3000 × g条件下离心5分钟洗涤上清液，使所有液滴沉淀。用移液器反复吹打将PFCnDs重悬于1 mL PBS中，随后在水浴超声仪中处理1分钟。</li>
	<li>使用动态光散射（DLS）测量液滴粒径。将PFCnDs原液稀释100倍（10 µL PFCnDs原液加入990 µL PBS），并在测量前进行水浴超声以分散PFCnDs。典型结果见图1。</li>
	<li>使用纳米颗粒追踪分析仪（见材料表）测定PFCnDs浓度。将PFCnDs稀释100–1000倍，以确保浓度测量准确。该方案通常可获得浓度约为1010 个颗粒/mL的液滴。</li>
	<li>在50 mL离心管中配制10 mL超声耦合凝胶，并加入1%（v/v）或100 µL的PFCnDs，制成约含108 个颗粒/mL的溶液。涡旋混匀后，在4000 × g条件下离心3分钟以去除气泡。</li>
</ol>
2. 聚丙烯酰胺仿体制备
<ol>
	<li>脱气处理：将400 mL去离子水加入500 mL抽滤瓶中，用橡胶塞密封后连接至真空管线。打开真空管线，并将烧瓶底部浸入超声波清洗仪中，超声处理5分钟，或直至肉眼观察不到气泡产生为止。</li>
	<li>配制10%过硫酸铵（APS）溶液：将500 mg过硫酸铵溶解于5 mL已脱气的水中。若过硫酸铵未完全溶解，可轻轻旋转混匀溶液。</li>
	<li>在装有磁力搅拌子的400 mL烧杯中，置于磁力搅拌器上，加入150 mL脱气水和50 mL 40%（w/v）丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，配制成200 mL 10%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。以200 rpm速度搅拌，确保充分混匀且不引入气泡。 
	警告：丙烯酰胺为致癌物，所有操作均应在通风橱内进行，并佩戴手套，尤其是处理丙烯酰胺粉末时。</li>
	<li>称取400 mg二氧化硅，加入步骤2.3中所得的10%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液中，形成含0.2%（w/v）二氧化硅的丙烯酰胺溶液。 
	警告：吸入二氧化硅可能具有致癌性，所有操作（包括称量）均应在通风橱内进行。</li>
	<li>制备一个尺寸为58 mm × 58 mm × 78 mm的方形模具，并通过剪去塑料移液管的尖端并用实验室胶带将其固定于模具中，形成圆柱形内嵌结构。参见图2。</li>
	<li>向烧杯中加入2 mL 10% APS溶液，使APS终浓度为0.1%，再加入250 µL四甲基乙二胺（TEMED）至模体溶液中。短暂搅拌（少于1分钟）。</li>
	<li>迅速将溶液倒入模具中，注意避免引入气泡。溶液应在10分钟内完成聚合。使用实验室刮刀的平头沿模具边缘划一圈后翻转模具，即可取出模体。 
	&#8203;注意：此类模体可多次重复使用，使用后应浸没于水中并于4°C保存。</li>
</ol>
3. 全氟碳纳米液滴成像
<ol>
	<li>根据制造商说明，开启脉冲激光系统并预热约 20 分钟。确保光纤束已正确连接至激光输出端，且两根光纤腿已妥善放置于光纤束支架内。</li>
	<li>开启超声成像系统，将阵列成像换能器（L11-4v）连接至系统，并将其固定在支架上，使其成像平面与激光横截面保持对齐。</li>
	<li>将激光系统的脉冲重复频率设置为 10 Hz，并在光纤束末端放置功率计以测量能量。调节 Q 开关延迟，直至估算的光通量达到 70 mJ/cm2。 
	警告：发射激光时必须佩戴适当的护目镜，且激光防护帘必须完全围蔽操作区域。</li>
	<li>使用 1 mL 塑料滑动接头注射器，将超声耦合剂/PFCnD 混合物填充至聚丙烯酰胺仿体的其中一个通道内。在通道顶部充分覆盖超声耦合剂，并用 1 mL 塑料滑动接头注射器去除所有气泡。将聚丙烯酰胺仿体置于换能器和光纤束下方，如图 3所示。</li>
	<li>使用基于软件20的激光超声与弹性联合成像（CLUE）平台，对与光学激活同步的 PFCnD 进行成像。在Param结构中修改通用用户自定义参数：将起始/终止深度设为 0/40 mm，中心频率设为 6.9 MHz，换能器名称设为 'L11-4v'。</li>
	<li>定义一个新的RunCase，并设计一个用于重复光学激活/再凝结及 PFHnD 超声成像的模块序列。通过列出预定义模块（如超快成像（mUF）、外部激光（mExtLaser）和空闲（mIdle））来完成此操作。
	<ol>
		<li>将序列组mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF重复两次，以获取 n 脉冲和 p 脉冲的成像数据。 
		注：每个序列中的第一个mExtLaser模块通过将ExtLaser.Enable设为 0 设置为伪激光；加入'mIdle'模块是为了最小化背景超声图像与激光激活后 n/p 脉冲超声图像之间的时间间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为当前运行案例的模块序列中每个模块设置模块参数。通过模块在序列中的顺序索引访问各模块参数。模块将根据此处用户设定的参数执行预定义操作。
	<ol>
		<li>在外部激光模块中，将ExtLaser.QSdelay设置为步骤 3.3 中调节好的激光 Q 开关延迟值，单位为微秒。该模块等待激光系统的闪光灯触发输出，并在QSdelay指定的延迟后生成 Q 开关触发信号。</li>
		<li>在超快成像模块中，将Resource.numFrame设为 100，将SeqControl.PRI设为 200（µs），并将TW.polarity设为 1（对应 P 脉冲）或 -1（对应 N 脉冲）（参见图 4中相应的脉冲波形）。该模块将发射脉冲类型由TW.polarity指定的 0 度平面超快波。
		<ol>
			<li>以Resource.numFrame指定的帧数和SeqControl.PRI指定的脉冲重复间隔，采集宽度为 38.8 mm 的全孔径成像窗口，然后保存数据以供离线处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在空闲模块中，将SeqControl.lastPRI_Module设置为激光脉冲间隔时间（100 ms）减去 Q 开关延迟、成像数据采集时间（20 ms）以及信号传输所需的 20 µs 余量。该模块使系统在SeqControl.lastPRI_Module指定的时间内保持“无操作”状态，以填补成像数据采集结束与下一次激光脉冲激发之间的时间间隙。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

探针超声是一种相对简单且易于掌握的制备全氟碳纳米点（PFCnDs）的方法。操作过程中有几个步骤需要特别注意。在处理氯仿时，必须使用正向置换移液器或玻璃注射器，因为氯仿具有挥发性，会 &#34;泄漏&#34; 使用正向置换移液器时，应确保使用合适的吸头，因为氯仿会溶解大多数塑料吸头，可能向溶液中引入污染物。对于全氟己烷，同样推荐使用正向置换移液器或玻璃注射器，因其具有挥发性且密度大于水。通常情况下，空气置换移液器可通过预润洗来减少挥发性带来的影响，而通过称重校正移液器设定体积可减轻高密度造成的影响。然而，全氟己烷同时具备这两种特性，其挥发性将导致准确称重困难，因此正向置换移液器或玻璃注射器是最可行的选择。
在对溶液进行探头超声处理之前，必须将脂质和全氟碳化合物溶液在冰浴中孵育，使其充分冷却，以防止超声过程中全氟碳化合物沸腾。此步骤对于沸点较低的全氟碳化合物（如全氟戊烷）尤为重要。此外，在使用探头超声处理溶液时需格外小心。超声探头的尖端应浸入液面以下，但不得接触玻璃小瓶的底部或侧壁，以免损坏探头或导致小瓶破裂，使脂质溶液泄漏至冰浴中。
<p class="jove_conten...

由于微泡具有良好的生物相容性，并且与软组织相比具有优异的回声特性，因此成为最常用的超声造影剂。这使得微泡在血流可视化、器官边界显示及其他应用中具有重要价值1。然而，其尺寸（1–10 µm）虽然使其在基于共振频率的成像中表现出色，但也限制了其应用范围，仅限于血管系统2。
这一局限性促使了全氟碳化物纳米乳剂（PFCnDs）的开发，PFCnDs是由表面活性剂包裹液态全氟碳核心所构成的纳米乳剂。这些纳米颗粒可合成至小至200 nm的粒径，并被设计用于利用 &#34;渗漏的&#34; 肿瘤血管中的血管结构、孔隙以及开放的窗孔结构。尽管这些结构异常依赖于肿瘤类型，但其通透性可使纳米颗粒从约200 nm至1.2 µm的尺寸范围内发生外渗，具体范围取决于肿瘤类型3,4在初始状态下，这些颗粒产生的超声造影效果极弱或几乎无造影效果。在受到声学或光学诱导发生汽化后，其核心由液相转变为气相，导致直径增大2.5至5倍。5,6,7 并产生光声和超声对比效应。尽管声致汽化是最常见的激活方式，但该方法会产生声学伪影，限制了对汽化过程的成像。此外，大多数全氟碳化合物需要使用机械指数超过安全阈值的聚焦超声才能实现汽化8这促使了低沸点全氟碳纳米液滴（PFCnDs）的发展，其可通过将微米气泡冷凝成纳米液滴来合成。9然而，这些液滴更具挥发性，容易发生自发蒸发。10.
另一方面，光致液滴汽化（ODV）需要添加光学触发剂，例如纳米颗粒11,12,13或染料6,14,15，并可在ANSI安全能量密度限值内汽化高沸点的全氟碳化物11。采用高沸点核心合成的全氟碳纳米液滴（PFCnDs）更稳定，汽化后可重新冷凝，从而实现无背景成像16、多重检测17和超分辨率成像18。这些技术的主要局限之一在于，高沸点PFCnDs在汽化后仅在毫秒量级的短时间内具有回声信号19，且信号相对较弱。尽管通过重复汽化和信号平均可在一定程度上缓解该问题，但液滴信号的检测与分离仍具挑战性。
借鉴脉冲反转技术，通过改变超声成像脉冲的相位可增强成像持续时间和对比度19。若以稀疏相位（负相脉冲，n-pulse）启动超声成像脉冲，可使汽化的全氟碳纳米液滴（PFCnDs）的持续时间延长且对比度提高。相反，若以压缩相位（正相脉冲，p-pulse）启动超声成像脉冲，则会导致对比度降低且持续时间缩短。本文将介绍如何合成可光学触发的全氟碳纳米液滴、成像中常用的聚丙烯酰胺仿组织体模，并通过声学调制展示对比度增强和信号持续时间的改善。

<table><tbody><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>VWR</td><td>97064-592</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td>脂质，可购买氯仿悬浮液或粉末形式。长期储存建议使用粉末形式，但氯仿溶液更便于使用。</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（DSPE-PEG）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120C</td><td>脂质，可购买氯仿悬浮液或粉末形式。长期储存建议使用粉末形式，但氯仿溶液更便于使用。</td></tr><tr><td>丙烯酰胺：双丙烯酰胺溶液（19:1）40%（w/v），OmniPur&amp;reg;</td><td>VWR</td><td>EM-1300</td><td>丙烯酰胺溶液，低浓度/粉末</td></tr><tr><td>IR-1048</td><td>Sigma</td><td>405175</td><td>红外染料</td></tr><tr><td>L11-4v</td><td>Verasonics</td><td>-</td><td>超声线性阵列换能器</td></tr><tr><td>Microtip 1/8&quot;</td><td>Qsonica LLC</td><td>4418</td><td>探头式超声破碎仪用微尖</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>VWR</td><td>97064-902</td><td>在过硫酸铵存在下通过生成自由基促进聚丙烯酰胺聚合</td></tr><tr><td>Nova II</td><td>Ophir-Spiricon</td><td>7Z01550</td><td>激光功率计</td></tr><tr><td>全氟己烷</td><td>Fluoromed</td><td>APF-60M</td><td>全氟碳液体</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>VWR</td><td>97062-732</td><td>用于配制PBS的片剂</td></tr><tr><td>Q500</td><td>Qsonica LLC</td><td>Q500-110</td><td>探头式超声破碎仪</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288500</td><td>2–25 &amp;mu;m 粒径</td></tr><tr><td>Tempest 30</td><td>New Wave Research</td><td>-</td><td>脉冲激光系统</td></tr><tr><td>Vantage 128</td><td>Verasonics</td><td>-</td><td>科研用超声成像系统</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>-</td><td>基于动态光散射技术进行粒径测量</td></tr></tbody></table>

光触发汽化全氟碳纳米液滴的制备及声学调控

Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets

微泡是超声成像中最常用的造影剂。然而，由于其尺寸限制，微泡仅能局限于血管腔内。这些微泡可以被压缩或配制成全氟碳纳米液滴（PFCnDs），其尺寸足够小，能够发生血管外渗，并可在靶部位通过声学手段触发。通过添加光学吸收剂（如近红外有机染料或纳米颗粒，例如硫化铜纳米颗粒或金纳米颗粒/纳米棒），可进一步增强这些纳米颗粒的性能。经光学标记的PFCnDs可通过激光照射实现液滴汽化，该过程称为光学液滴汽化（ODV）。这种激活方式使得高沸点全氟碳核得以应用，而这类核在诊断成像允许的最大机械指数阈值下无法通过声学方式汽化。高沸点核形成的液滴在汽化后会重新冷凝，从而产生“闪烁”型PFCnDs——即在汽化后短暂产生造影信号，随后重新冷凝为纳米液滴状态。该过程可重复进行，实现按需造影，从而支持无背景干扰成像、多重检测、超分辨率成像，并通过光学与声学双重调控实现造影增强。本文将演示如何利用探头超声法合成可光学触发的脂质壳PFCnDs，制备聚丙烯酰胺模体以表征纳米液滴，并在ODV后通过声学调控PFCnDs以提升造影效果。

成功配制并经离心分离的PFCnDs应产生直径约为200-300 nm的液滴（图1A）。分离不当的液滴可能在约1 µm处出现小峰。这些溶液可进一步通过水浴超声处理以破碎较大的液滴。由于聚并和/或扩散作用，液滴尺寸会随时间增加，该过程称为奥斯特瓦尔德熟化21,22（图1B）。
通过调控成像脉冲对液滴进行声学调制，提高了气化全氟碳化物纳米液滴（PFCnDs）的对比度。该效果通过减去波束成形图像相邻帧后重建的PFCnD图像得以展示，使得仅来自气化PFCnDs的信号可见，同时抑制了静止背景信号。对比度通过圆形包含区域的平均信号与平均背景信号之差与平均背景信号的比值进行量化。背景信号由两个与包含区域深度相同、面积相等的矩形背景感兴趣区域（ROI）的信号定义。N脉冲模式下包含区域的对比度约为即，220% 的提升）高于 P 脉冲（<strong ...

光激活的全氟碳纳米液滴在血管系统外的成像应用中展现出良好的前景。本文将演示如何合成这些颗粒、交联聚丙烯酰胺仿组织体模，并通过声学调控增强其信号。

微泡是超声成像中最常用的造影剂。然而，由于其尺寸限制，它们仅能局限于血管腔内。这些……

该方案可实现光学汽化全氟碳纳米液滴的简单快速合成，并提供一种增强这些颗粒性能的方法。Person 版本仅需调节超声成像相位即可增强对比度。该方法无需额外设备，可在任何可编程超声系统上实施。首先用氯仿冲洗一个10毫升的圆底烧瓶，并用氯仿清洗一支10微升和一支1毫升的气密玻璃注射器，通过反复吸取并排出满量程体积，共操作三次。使用注射器将200微升浓度为25毫克/毫升的DSPE-mPEG-2000、8微升浓度为10毫克/毫升的DSPC，以及1毫升浓度为1毫克/毫升的IR-1048加入圆底烧瓶中。注意在吸取不同脂质或染料之间应彻底清洗注射器，以防止储备液受到污染。使用旋转蒸发仪除去溶剂。确保缓慢调节真空至332毫巴，以防止暴沸。五分钟后，将压力降至42毫巴，以除去可能进入溶液的水分。将脂质饼溶于1毫升PBS中，在室温下超声或涡旋5分钟，或直至所有脂质饼完全悬浮并溶解于溶液中。将溶液转移至7毫升玻璃小瓶中，将小瓶置于盛有冰块的玻璃皿中，使溶液冷却5分钟。用全氟己烷冲洗一支无泄漏玻璃注射器。然后使用注射器向小瓶中加入 50 µL 全氟己烷。将混合物进行探头超声处理，超声参数设置为：振幅 1，处理时间 20 秒，脉冲开启时间 1 秒，脉冲关闭时间 5 秒。随后按照文本稿件中所述更改设置，再次对混合物进行超声处理。将纳米液滴溶液转移至1.5毫升离心管中，在300g条件下离心3分钟，以分离粒径大于1微米的大液滴与较小的液滴。弃去沉淀，将上清液转移至另一支1.5毫升离心管中。通过在3,000g条件下离心5分钟洗涤上清液，使溶液中所有液滴形成沉淀。用移液器反复吹打，将PFCnDs在1毫升PBS中重新悬浮，然后在水浴超声仪中处理1分钟。取10微升PFCnDs原液加入990微升PBS中，稀释100倍，并进行水浴超声处理以分散PFCnDs，随后测量其粒径。使用动态光散射法测定液滴的粒径。通过将400毫升去离子水加入500毫升真空烧瓶中，用橡胶塞密封，并将烧瓶连接至真空管线，以去除水中的气体。打开真空管线，将烧瓶底部浸入浴式超声波仪中。超声处理5分钟，或直至观察不到气体气泡产生为止。通过将500毫克过硫酸铵溶解于5毫升脱气水中，配制10%过硫酸铵溶液。若过硫酸铵未完全溶解，可轻轻旋涡混匀。取一个400毫升烧杯，放入磁力搅拌子并置于磁力搅拌器上，加入150毫升脱气水和50毫升40%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，混合形成200毫升10%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。以 200 RPM 的转速搅拌混合物，以充分混匀且避免引入气泡。称取 400 毫克二氧化硅，加入 10% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液中，形成含 0.2% 二氧化硅的丙烯酰胺溶液。通过剪去塑料移液管的尖端，并用实验室胶带将其固定在模具中，制备带有圆柱形内嵌结构的方形模具。向烧杯中加入2毫升10%过硫酸铵溶液，使终浓度为0.1%，并向模拟溶液中加入250微升TEMED。让溶液搅拌不到一分钟。迅速将溶液倒入模具中，注意避免将气泡引入溶液。溶液应在10分钟内发生聚合。用实验室刮刀的平头端沿模具边缘划一圈，然后将模具倒置，取出模型。根据制造商说明，打开脉冲激光系统并预热约20分钟。确保光纤束已正确连接至激光输出端，并将光纤束的两个分支正确放置在光纤束支架内。开启超声成像系统后，将阵列成像换能器连接至系统，并将其固定在支架上，以使成像平面与激光横截面保持对齐。将激光系统的脉冲重复频率设置为 10 赫兹，并在光纤束末端放置功率计以测量能量。调节Q开关延迟，直至估计的注量达到70毫焦每平方厘米。使用1毫升塑料滑动接头注射器，将超声凝胶与PFCnD混合物填充至聚丙烯酰胺模拟体的其中一个通道内。在通道顶部充分覆盖超声凝胶，并用1毫升塑料滑动接头注射器去除任何气泡。最后，将聚丙烯酰胺仿组织体置于换能器和光纤束下方。全氟碳纳米液滴经成功制备及离心分离后，可获得直径约200至300纳米的液滴。由于奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）过程中的聚并和扩散作用，液滴的尺寸会随时间逐渐增大。与P脉冲相比，包含末尾脉冲的对比度大约提高了3.2倍，即提升了220%。对每一帧的强回声区域进行计算，并通过第一帧的强回声区域进行归一化，然后拟合为指数衰减模型。在N脉冲成像中，归一化强回声区域的特征衰减时间最长可达P脉冲的3.5倍。以时间为序记录每次N脉冲和P脉冲成像的B模式差分成像帧。其中最重要的一点是将烧瓶底部的脂质排出，以确保其能够充分整合到脂质膜中。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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学习光学汽化全氟化碳纳米液滴的合成配方与声学调制方法，用于增强超声成像对比度。该技术无需额外设备，可在标准可编程超声系统上实现，适用于非血管成像应用。

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