Name: 烧伤诱导的疼痛和小鼠抑郁样行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 了解热水烫伤诱导的ICR小鼠疼痛反应、步态障碍及抑郁样行为的评估方法。该模型可用于研究烧伤后神经生物学机制及开发相关治疗方案。

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本研究由忠南国立大学和韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（NRF-2019R1A6A3A01093963 和 NRF-2021R1F1A1062509）。

所有实验方案均经韩国忠南国立大学机构动物护理和使用委员会审查批准，并依据国际疼痛研究协会的伦理指南进行18。
1. 在后肢足部诱导烫伤损伤
<ol>
	<li>将体重为20-25 g的雄性ICR小鼠饲养在光照和温度受控的房间内（12/12小时明暗循环，22.5 °C ± 2.5 °C），相对湿度为40%-60%。 
	注：本实验方案可使用雄性或雌性小鼠。</li>
	<li>让动物自由摄取食物和水，并在实验开始前至少适应环境1周。 
	注：所有动物均采用群养方式，以排除隔离应激等干扰因素。</li>
	<li>将小鼠随机分配至实验组或对照组，并使用动物编号作为代码进行盲法实验。</li>
	<li>在烧伤造模当天，通过腹腔（i.p.）注射300 µL阿法沙龙（剂量为100 mg/kg）对小鼠进行麻醉。进行烧伤造模操作时，需穿戴手术服、手套和口罩。</li>
	<li>在小鼠深度麻醉后，用70%乙醇对右后足进行消毒。 
	注：通过夹捏后肢脚趾或尾部检查无反应，以确认小鼠处于深度麻醉状态。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉后角膜干燥。</li>
	<li>将深度麻醉的小鼠右后足浸入65 °C ± 0.5 °C的热水中持续3秒。在将后足浸入热水前，先在每只小鼠的踝部做标记，以确保烧伤面积的一致性。</li>
	<li>完成烧伤造模后，将小鼠转移至清洁的饲养笼中，并置于加热垫上，直至其从麻醉中恢复。 
	&#8203;注：自烧伤当天起，每日一次腹腔注射镇痛剂对乙酰氨基酚（200 mg/kg），连续给药7天（仅限“烧伤+对乙酰氨基酚”组）。烧伤组则给予生理盐水作为溶剂对照。本实验依据先前研究中描述的方法进行4。</li>
</ol>
2. 机械性异常性疼痛的测量
<ol>
	<li>将小鼠转移至行为学测试室，在测试前至少使其适应环境30分钟。进行测试时需穿戴手术服、手套和口罩。</li>
	<li>将小鼠放入一个方形箱体（直径：13 cm，高度：12 cm）中，箱底为金属网状结构（网孔尺寸：0.7 cm × 0.7 cm），并让其至少适应30分钟。</li>
	<li>采用上升刺激法评估后肢足底的机械阈值19,20。</li>
	<li>使用一系列von Frey纤维丝，以5–8秒的间隔轻触刺激后肢足底。在烧伤造模前一天获取基线数值。 
	注：本实验中分别使用0.16–1.2 g的von Frey纤维丝测定所有动物的足缩回阈值。足缩回反应测试从最低弯曲力的von Frey纤维丝（本方案中为0.16 g）开始；若无反应，则使用下一级弯曲力的纤维丝继续测试。</li>
	<li>对每只同侧（受伤）后肢足底进行五次测试，以评估机械阈值。 
	注：在每只动物的五次测试中，引起至少三次反应的von Frey纤维丝的弯曲力被定义为足缩回阈值（PWT，g）。机械阈值在烧伤前1天以及烧伤后第1、3、5和7天进行测量。在动物给予对乙酰氨基酚后1小时评估镇痛效果。</li>
</ol>
3. 自动化步态分析
<ol>
	<li>在烧伤损伤前5天开始，每天一次将小鼠放入步态分析系统中适应10-15分钟。进行步态分析时需穿戴手术服、手套和口罩。</li>
	<li>测试当天，将小鼠带入行为测试室，并在测试前至少适应30分钟。 
	注意：适应和步态分析测试应在黑暗环境中进行。按以下方式设置程序菜单的条件：
	<ol>
		<li>运行程序后，点击创建新实验菜单，指定用于保存数据的文件夹。</li>
		<li>指定文件夹后，将最大运行时间设置为5秒，最大允许速度变化设置为50%。</li>
		<li>在程序的设置选项卡中，选择已注册的摄像头，并将跑道长度设置为30 cm。</li>
		<li>在程序菜单的采集选项卡中，选择打开采集。</li>
		<li>根据状态信息提示，点击拍摄背景按钮，获取空跑道的背景图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击开始采集按钮，然后将小鼠放置在可左右穿行的跑道入口处。系统将自动开始记录小鼠自由活动时的运动过程。 
	注意：如果动物的步态被成功记录且所有足印均被检测到，则该次记录将被标记为“合规运行”，并显示绿色图标；如果软件未检测到任何足印，则显示红色图标，此时建议重新进行记录。作者建议收集并分析至少五次以相似速度完成的成功合规运行数据。</li>
	<li>在程序菜单的采集选项卡中，选择分类运行。 
	注意：选择上述成功合规运行所获得的数据后，进入视频分析界面，查看小鼠的步态模式记录。</li>
	<li>选择需要分析的运行记录，然后点击自动分类按钮。</li>
	<li>完成自动分类后，删除每次运行中的鼻部、生殖器识别以及足部误识别的数据点，并将其归为无效数据，然后进行数据分析。 
	&#8203;注意：所有统计参数将由程序自动分析并保存，原始数据值可在实验者的分析菜单中查看。自动步态分析在烧伤前以及烧伤后第1、3、5和7天进行。在“烧伤+对乙酰氨基酚”组中，评估在给予对乙酰氨基酚后30分钟进行；在“烧伤”组中，评估在生理盐水处理后30分钟进行。本实验依据先前研究中描述的方法进行4,21,22。</li>
</ol>
4. 抑郁样行为的测量
注意：通过强迫游泳实验测定基于绝望行为的水中不动时间。
<ol>
	<li>将小鼠带入行为测试室，在测试前至少适应环境30分钟。进行强迫游泳实验时，需穿戴手术服、手套和口罩。</li>
	<li>将小鼠放入一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯圆柱形容器（10 cm × 25 cm）中，容器内盛有15 cm深的水（25 °C ± 0.5 °C），持续15分钟。</li>
	<li>24小时后，将小鼠再次放入相同条件的容器中，测定其不动时间。 
	注意：不动时间记录持续5分钟，当小鼠停止攀爬或游泳，仅漂浮以保持头部露出水面时的时间即为不动时间。强迫游泳实验在烧伤后第7天进行。烧伤+对乙酰氨基酚组在给予对乙酰氨基酚后1小时进行评估，烧伤组在生理盐水处理后1小时进行评估。本实验依据既往研究中描述的方法进行23,24。</li>
</ol>
5. 正常运动功能的测量
注意：通过转棒实验来区分烧伤后异常的运动功能。
<ol>
	<li>将小鼠带入行为测试室，在测试前至少适应环境30分钟。进行强迫游泳实验时，需穿戴手术服、手套和口罩。</li>
	<li>将动物放置于一个可旋转的圆柱形平台（宽5.7 cm，直径3 cm）上，平台悬置于装置底部上方16 cm处。</li>
	<li>在诱导烧伤损伤前，每天让每只动物在转棒仪上训练一次，持续至少5天。</li>
	<li>给药后每20分钟进行一次转棒实验，持续2小时。设定截止时间为2分钟。</li>
	<li>测量小鼠在以每分钟15转的恒定速度旋转的转棒上不跌落所持续的时间。 
	注：转棒实验在诱导烧伤损伤后第7天进行。烧伤+对乙酰氨基酚组在给予对乙酰氨基酚后立即进行评估，烧伤组则在生理盐水处理后进行评估。本实验中使用阿法沙龙作为实验性治疗药物的阳性对照。在转棒实验期间，记录小鼠在旋转棒上不跌落的持续时间。实验操作依据既往研究中描述的方法进行22,25。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

烫伤是一种由高温液体引起的热力烧伤。大多数情况下为一度或二度烧伤，但长时间接触热源可导致三度烧伤26。在本研究中，通过将小鼠右后足置于65 °C热水中3秒以诱导烧伤损伤4,26。在烧伤的足部可观察到组织损伤，表现为红肿、皮肤脱皮和肿胀等典型的烧伤症状（补充图1）4。
机械性异常性疼痛测量是动物疼痛模型中常用的一种疼痛反应识别方法，本研究采用von-Frey细丝进行测量。使用von Frey细丝的上升刺激法可确定引起动物足爪回缩反应所需的机械阈值19,20。实验从刺激强度最小的细丝开始，记录细丝在设定次数（本方案中为三次）引起反应时的弯曲力，作为足爪回缩阈值。
在自由行...

组织损伤（如烧伤和创伤）通常伴随急性疼痛的发生。据估计，烧伤每年导致约18万人死亡，其中绝大多数发生在中低收入国家，且由不同类型的烧伤引起1。根据一项全球性报告，烧伤在儿童中较为常见，占住院患者总数的约40%–60%2,3。这类损伤尤其严重，因为它们可能在日常生活中发生，例如因沸水或洗澡水烫伤4,5。尽管在大多数情况下，急性疼痛会随着组织损伤的恢复而自行缓解，但由于神经系统发生异常变化，仍有可能转变为慢性疼痛6,7。
最近有研究表明，急性疼痛可诱发情绪低落，而慢性疼痛则可能导致焦虑和抑郁8,9,10,11。疼痛与抑郁共存使得患者治疗更加困难。抑郁还往往增加疼痛敏感性，这可能进一步引发更严重的抑郁和疼痛12。在周围炎症的动物模型中已观察到疼痛与抑郁的并发情况13,14,15,16。然而，目前对疼痛诱发抑郁的详细机制尚不明确17。因此，有必要开发更有效的烧伤治疗方法，以减轻其副作用和症状。
因此，本研究旨在建立一种动物模型，用于研究小鼠烧伤后急性疼痛及类似抑郁行为。为此，检测了与烧伤相关的异常触觉敏感性、步态模式改变以及类似抑郁的行为表现。此外，本研究还尝试使用非甾体抗炎药（NSAIDs）对该模型进行验证。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>307809</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>对乙酰氨基酚 BioXtra，&amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7085-100G</td><td>该镇痛剂用作阳性对照。</td></tr><tr><td>Alfaxan 多剂量（Alfaxalone）</td><td>JUROX Pty.Limited</td><td></td><td>本实验中，该材料用于动物麻醉，并在转棒实验中作为实验处理药物的阳性对照。</td></tr><tr><td>CatWalk 自动步态分析系统</td><td>Noldus</td><td>CatWalk XT</td><td>自由行走啮齿类动物的步态分析用于研究感觉运动功能障碍模型中肢体运动和位置的变化</td></tr><tr><td>OPTISHIELD（环孢素眼膏）</td><td>Ashish Life Science</td><td></td><td>该材料用作眼膏，以防止麻醉诱导后角膜干燥。</td></tr><tr><td>有机玻璃圆筒</td><td>SCITECH KOREA</td><td>定制产品</td><td>用于强迫游泳实验</td></tr><tr><td>转棒系统</td><td>SCITECH KOREA</td><td>加速转棒</td><td>用于正常运动功能的测定</td></tr><tr><td>von Frey 纤维丝</td><td>North Coast Medical</td><td>NC12775</td><td>用于机械性异常性疼痛的测定</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>CHANGSHIN SCIENCE</td><td>C-WBE</td><td>用于烧伤损伤的诱导</td></tr></tbody></table>

小鼠烧伤损伤诱导的疼痛与抑郁样行为

Burn Injury-Induced Pain and Depression-Like Behavior in Mice

烫伤是老年人群和年轻人群烧伤损伤最常见的原因。由于在中低收入国家具有较高的死亡率和后遗症，烧伤是主要的临床挑战之一。烧伤常引起剧烈的自发性疼痛、持续性异常性疼痛以及危及生命的问题。更重要的是，过度疼痛常伴随抑郁症状，可能显著降低生活质量。本文介绍如何建立动物模型以研究烧伤引起的疼痛及类抑郁行为。在麻醉后，将小鼠的一只后肢足掌浸入热水（65 °C ± 0.5 °C）中持续 3 秒，以诱导烧伤损伤。烧伤后每 2 天进行一次 von Frey 试验和自动步态分析。此外，采用强迫游泳试验评估类抑郁行为，并通过转棒试验区分烧伤后是否存在运动功能异常。本研究的主要目的是描述一种用于研究小鼠烧伤损伤所致疼痛及类抑郁行为的动物模型的建立方法。

为了遵循“3R原则”（替代、减少和优化），最大限度地减少动物痛苦并降低实验所需的动物数量，本研究通过预实验确定了获取显著数据所需的最少动物数量，并据此设计实验方案。本研究的行为学实验独立重复进行了两次，具体分组如下：步态分析、机械性异常性疼痛以及抑郁样行为测试分别设置了对照组（n = 5）、烧伤组（n = 7；溶剂对照；生理盐水）和烧伤+对乙酰氨基酚组（n = 7）。在转棒实验中，设置了对照组（n = 3）、烧伤组（n = 4；溶剂对照；生理盐水）、烧伤+对乙酰氨基酚组（n = 4）以及阳性对照组（n = 4；Alfaxalone）。Alfaxalone 是一种神经活性类固醇类麻醉剂，目前在兽医学中用作注射型全身麻醉诱导剂。本研究中，Alfaxalone 用于烧伤造模过程中的动物麻醉，并在转棒实验中作为运动功能障碍的阳性对照药物。
数据以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。此外，不同时点获得的实验数据被独立分析。疼痛行为反应计算为曲线下面积（AUC）。采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）评估机械性异常疼痛、步态分析和转棒实验数据随时间变化的差异。事后分析采用 Dunnett ...

单侧后肢足垫短暂烫伤（65 °C ± 0.5 °C，持续3秒）可降低同侧von Frey纤维刺激的痛觉阈值（g），并改变步态模式。此外，烧伤还会在强迫游泳实验中诱发类似抑郁的行为。

烫伤是老年人和青少年群体中最常见的烧伤原因。由于……，它一直是临床上的主要挑战之一。

本方案适用于烧伤疼痛及其治疗的多方面研究和结果分析，有望为该研究领域提供重要信息。本方案建立了一种由热水诱发的烧伤动物模型，并提出了一种测量相关疼痛、步态异常及类似抑郁行为反应的方法。该实验操作将由金博士实验室的硕士研究生 Jaehyuk Kim 进行示范。首先，将体重为20至25克的雄性ICR小鼠饲养在光照和温度可控的环境中。给予小鼠自由摄食和饮水的条件，并在实验开始前至少适应环境一周。一周后，将小鼠随机分配至实验组或对照组，并以动物编号作为代码进行盲法实验。进行烧伤诱导前，需穿戴手术服、手套和口罩。随后，将小鼠深度麻醉后，用70%乙醇对右后足进行消毒，并在眼睛上涂抹眼药膏以防止角膜干燥；然后在每只小鼠的踝部做标记，将右后足浸入65°C热水中持续三秒钟。烧伤后，将小鼠置于清洁的饲养笼内，放在加热垫上，直至其从麻醉状态恢复。将小鼠带入行为测试室，在测试前至少让其适应环境30分钟。在小鼠适应环境的同时，穿戴手术服、手套和口罩。随后，将小鼠放入一个底部为金属网的方形箱中，再让其适应环境30分钟。然后采用上升刺激法，通过一系列Von Frey细丝以5至8秒的间隔轻刺后足，刺激后肢足底，以评估后足的机械阈值。每侧同侧后足进行5次试验，以评估其机械阈值。对于步态分析，从烧伤前5天开始，每天让小鼠在步态分析系统中适应10至15分钟。测试当天，穿戴好手术服、手套和口罩后，将小鼠带入行为测试室，让其在测试前适应环境30分钟。随后启动步态分析程序，点击“创建新实验”菜单以指定保存数据的文件夹。指定完成后，将最大运行时间设置为5秒，最大允许速度波动设置为50%。接下来，在程序的“设置”选项卡中，选择已注册的摄像头，并将跑道长度设置为30厘米。然后在程序菜单的“采集”选项卡中，选择“打开采集”，并根据状态消息提示，点击“拍摄背景”按钮，获取空跑道的背景图像。接下来，单击开始采集按钮，并将小鼠放置于左侧/右侧可穿越走道的入口处。系统将自动开始记录小鼠的自由活动。成功记录后，在程序菜单的“已采集”选项卡中选择“分类运行”，然后选择要分析的运行记录，单击“自动分类”按钮。自动分类完成后，去除每次运行中的鼻子、生殖器识别以及足部误识别等无效数据，然后分析数据。在行为测试室中经过30分钟的适应期后，将小鼠放入一个装有15厘米深水的透明聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）圆柱形容器中，持续15分钟。次日，在相同条件下再次将小鼠放入该容器中，测量其静止时间，即小鼠停止攀爬或游泳，仅漂浮于水面、头部保持在水面之上的时间。接下来，为了评估正常的运动功能，将动物放置在距离装置底部16厘米高的旋转圆柱平台上。在诱导烧伤损伤之前，让小鼠每天在转棒仪上训练一次，持续至少五天。给药后，每20分钟进行一次转棒实验，持续两小时，截止时间为两分钟。测量小鼠在以每分钟15转的恒定速度旋转的转棒上持续奔跑而不掉落的

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烧伤诱导的疼痛和小鼠抑郁样行为

本视频展示了通过反复固定小鼠以诱导慢性应激的方法，该方法可导致皮质酮释放，并降低神经元中谷氨酸受体的活性，从而引发类似抑郁的行为。...

通过固定应激在小鼠中诱导类似抑郁行为

来源：Yan, Z.，等．逍遥散对慢性应激小鼠抗抑郁作用的评价．J. Vis. Exp.

通过慢性应激暴露诱导和评估小鼠抑郁状态

通过立体定位注射表达 cDNA 或 shRNA...

应用立体定位注射技术研究基因对动物行为的影响

我们开发了一种评估小鼠在全身麻醉过程中福利状况的方案。该方案分析了一系列反映福利水平的行为学参数以及糖皮质激素代谢物。本方案可作为一种通用工具，以科学且以动物为中心的方式评估实验操作的严重程度。...

使用全身麻醉的小鼠程序中系统性评估其健康状况

本文提供了一种使用固定装置对慢性固定小鼠诱导类抑郁行为的简化且标准化的实验方案。此外，还介绍了用于验证抑郁状态诱导的行为学和生理学技术。...

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小鼠疼痛行为的机械性避冲突检测法

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尿激酶型纤溶酶原激活物诱导的小鼠背痛模型

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一种用于雌性C57BL/6J小鼠精神疾病研究的多重整合社会应激模型

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基于数字加热装置的小鼠棋盘样烧伤创面愈合模型

本文介绍了一种嗅觉偏好测试方案，可用于评估抑郁小鼠模型对具有吸引力和厌恶性气味刺激的负面嗅觉偏向。...

一种用于测量抑郁小鼠模型中嗅觉享乐偏好的嗅觉偏好测试

了解热水烫伤诱导的ICR小鼠疼痛反应、步态障碍及抑郁样行为的评估方法。该模型可用于研究烧伤后神经生物学机制及开发相关治疗方案。

小鼠烧伤损伤诱导的疼痛与抑郁样行为

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