利用光遗传学TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中诱导GFP表达
2021年8月19日
光遗传学是一种具有广泛应用的强大工具。本方案展示了如何利用对蓝光响应的TAEL/C120系统，在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。
本方案具有重要意义，因为它是一种光遗传学方法，即在完整生物体（在本例中为斑马鱼胚胎）中通过光激活来诱导基因表达的方法。该技术的优势在于使用光作为诱导剂，从而能够对诱导过程实现高度精确的时间和空间控制。
该方案适用于任何需要诱导型基因表达的实验场景，包括谱系示踪、基因功能获得性检测或挽救实验。首先，将LED面板相对于含有胚胎的培养皿进行定位，以便同时向多个胚胎递送每平方厘米1.5毫瓦的光照功率。
若光照时间超过三小时，为降低光对尾部转录激活因子造成光损伤的风险，请使用定时继电器每隔一小时开启和关闭光源一次。移去培养皿盖子，以减少冷凝水引起的光散射。将含有对照组胚胎的培养皿以及避光盒（用于暗对照）一同放置。
在达到所需的激活时间后，将胚胎移出光照环境。进行总RNA提取时，使用RNA提取试剂盒。将胚胎转移至1.5毫升微量离心管中，并吸除多余的卵水。
加入裂解缓冲液后，使用塑料研磨棒匀浆胚胎。将裂解液转移至试剂盒提供的柱子中，并按照制造商说明书纯化RNA。将纯化的RNA在负20至负80摄氏度保存，直至使用；或立即取1微克总RNA，按照cDNA合成试剂盒的说明书合成cDNA。
将一微克 RNA 加入含有四微升五倍浓度 cDNA 反应主混合液的薄壁 0.2 毫升 PCR 管中，随后加入一微升二十倍浓度的逆转录酶溶液。接着用无核酸酶水补足至终体积为 20 微升。将反应管放入程序控温的热循环仪中进行 cDNA 合成。
将合成的cDNA于-20°C保存，直至使用或立即用于定量分析。配制含有Cyber Green酶预混液的定量PCR反应体系，加入5倍稀释的cDNA以及终浓度为325 nmol/L的GFP引物，每个样本设三个复孔，并在程序设定的实时定量PCR仪中进行扩增反应。
反应完成后，分析熔解曲线以确定反应的特异性。使用双ΔCT法计算相对于对照胚胎的光激活诱导倍数变化。并利用统计学软件确定其显著性。
将胚胎从光照环境中取出后，用含有0.01%三卡因的3%甲基纤维素在玻璃凹玻片中固定胚胎，以进行成像。使用连接数码相机的荧光体视显微镜，并采用标准GFP滤光片设置，采集荧光和明场图像。通过图像处理软件在采集后将明场图像与荧光图像合并。
GFP表达的定量分析表明，在蓝光照射后30分钟即可检测到表达的诱导。随后，GFP表达水平持续上升，至激活后6小时达到稳定。此外，通过检测激活后相同时间点的荧光强度，对GFP的诱导效果进行了定性评估。
在激活后三小时首次观察到高于背景水平的GFP荧光，激活后六小时荧光明显增强。在所有时间点的对照胚胎中（始终避光保存），未观察到任何显著的GFP荧光。激活光必须处于可见光谱的蓝光范围内。
室内光和阳光均含有部分蓝光，因此请注意保护阴性对照，避免暴露于任何环境光源下。TAEL C120 系统采用基因编码，具有模块化特性，可驱动任何目的基因的表达。
因此，结合其他技术，可用于解答多种生物学问题。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案展示了利用光遗传学技术在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达的方法。蓝光响应的TAEL/C120系统可在完整生物体内精确调控基因表达。
关键研究组成部分
科学领域
- 光遗传学
- 基因表达
- 斑马鱼模型
背景
- 光遗传学是一种通过光激活诱导基因表达的方法。
- 该技术可实现对诱导过程的空间和时间精确控制。
- 该方法在谱系示踪和功能获得性实验中尤为有用。
- 斑马鱼胚胎是研究体内基因表达的常用模型。
研究目的
- 展示一种光诱导基因表达的方法。
- 为对光遗传学应用感兴趣的研究人员提供实验方案。
- 促进需要精确控制基因表达的实验开展。
使用的方法
- 将LED面板相对于含有胚胎的培养皿进行定位。
- 提供每平方厘米1.5毫瓦的光照强度。
- 同时在多个胚胎中诱导基因表达。
- 利用TAEL/C120光遗传学系统进行基因调控。
主要结果
- 在斑马鱼胚胎中成功诱导了基因表达。
- 实现了对基因激活的空间和时间控制。
- 为未来的光遗传学研究提供了可靠的实验方案。
- 突显了使用光作为诱导剂的优势。
结论
- 光遗传学为研究基因功能提供了强大的工具。
- TAEL/C120系统在体内诱导基因表达方面具有高效性。
- 该方法可应用于多种生物研究场景。
常见问题
行业重要性概述
光遗传学控制基因表达能够在活体中对生物靶点进行精确的时空干预，有助于在早期发现阶段降低机制性风险。TAEL/C120系统提供了一种可遗传编码、光控开关的平台，可用于验证具有定量读数的治疗假设。该方法通过在斑马鱼胚胎中实现可逆、剂量依赖性的基因表达调控，提高了靶点验证的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在完整的脊椎动物模型中实现可诱导且可逆的基因激活，能够验证治疗假设。
- 操作价值：通过将光诱导表达与GFP报告基因和qRT-PCR定量的表型读数关联，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：促进在与疾病相关的背景下进行功能获得和挽救实验，以评估靶点的充分性及通路的相关性。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可通过荧光显微镜和qRT-PCR检测由光照依赖性GFP表达产生的定量信号，适用于化合物或条件筛选。
- 可重复性：采用标准化诱导方案，通过设定明确的光照强度（1.5 mW/cm²）和时间控制，最大限度减少重复实验间的变异性。
- 可扩展性：兼容多孔板格式，可使用LED面板在受控光照条件下同时处理多个胚胎。
转化与临床前研究
- 疾病建模：支持基于斑马鱼的临床前模型，通过可诱导的基因表达时间控制来模拟可诱导的治疗干预。
- 生物标志物匹配：GFP 和 qRT-PCR 检测结果可作为通路激活和靶点调控的可转化药效学读数。
- 风险降低：在开展哺乳动物研究之前，通过可诱导的功能获得和挽救实验设计验证靶点的必要性和充分性，从而实现靶点风险的降低。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导物鉴定的发现连续过程，能够在脊椎动物体系中对分子靶点进行迭代验证。
- 发现生物学：通过在活体中进行定时的光诱导表达，检测靶点充分性及通路激活情况。
- 筛选：提供定量且标准化的输出结果（倍数变化的GFP），用于比较不同遗传或药理条件。
- 分析：采用双ΔΔCT qRT-PCR和荧光强度对诱导组与避光对照组进行统计学比较。
- 转化研究：将可诱导表达与斑马鱼的表型结果相联系，支持向临床前药效测试的衔接。
- 企业级复用：模块化的TAEL/C120系统可驱动任何目的基因表达，实现在多个靶点和项目间的重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在复杂生物体中精确控制基因表达的时间，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的光照递送和内部暗对照，消除环境变异的影响，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过实现快速、可逆的靶点调控以评估表型后果，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：在资源投入较大的后续阶段之前，于生理相关且可诱导的系统中验证靶点，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备斑马鱼养殖、显微注射以及光遗传学硬件设置方面的专业知识。
- 依赖能够精确控制蓝光强度和照射时间的LED照明系统。
- 需要建立标准化的光照持续时间及暗期对照维持方案，以确保数据的可比性。
- 在扩展至不同胚胎发育阶段或遗传背景时，需考虑相应的适应性调整。
- 受限于光在不透明组织中的穿透能力，但在光学通透性良好的斑马鱼胚胎中该问题有所缓解。
