Name: 用于免疫组化的合成抗原对照 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解如何使用BSA抗原凝胶制备免疫组化合成抗原对照的方法。该技术利用标准组织学和IHC试剂，可适应多种抗原浓度，为实验室提供可重复的标准化工具，用于校准和标准化IHC检测流程。

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作者们衷心感谢同事 Jeffrey Tom 和 Aimin Song 在多肽合成方面的帮助，Nianfeng Ge 在 TMA 构建方面的协助，Shari Lau 在免疫组化染色方面的支持，Melissa Edick 在数字显微扫描方面的贡献，以及 Hai Ngu 在数字图像定量分析方面的协助。

1. 储备液和工具的准备
<ol>
	<li>在50 mL锥形管中，将5 g BSA粉末加入14 mL、pH 7.2的PBS中，配制20 mL 25% w/v BSA溶液，搅拌至均匀分散。必要时使用涡旋振荡器帮助分散BSA粉末。
	<ol>
		<li>将溶液在4 °C下静置过夜，以确保完全溶解。用PBS定容至20 mL，得到25% w/v的储存液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在50 mL锥形管中，将6.26 g BSA粉末加入13 mL、pH 7.2的PBS中，配制20 mL 31.3% w/v BSA溶液，搅拌至均匀分散。将溶液在4 °C下静置过夜，以确保完全溶解。用PBS定容至20 mL，得到31.3% w/v的储存液。</li>
	<li>将金属加热块预热至85 °C。 
	注意：以下方案在1.5 mL微量离心管中制备体积为1.26–1.4 mL的肽/BSA凝胶。若需使用更小体积（例如抗原储备量有限时），可在PCR管中制备凝胶，并使用设定为85 °C的PCR仪作为加热装置。</li>
	<li>通过将700 µL 25% BSA溶液与700 µL 37%甲醛混合，检测BSA/甲醛混合物是否能按预期形成凝胶。在5–10秒内上下吹打5次，充分混匀，避免产生气泡。 
	警告：浓甲醛具有毒性，请采取适当的安全防护措施。</li>
	<li>BSA溶液与甲醛溶液混合后立即封闭微量离心管，置于85 °C加热块中加热10分钟。取出后让其自然冷却。确认凝胶已按预期形成。</li>
</ol>
2. 肽的制备与稀释
<ol>
	<li>获取5-20 mg所需序列的冻干多肽。 
	注意：4B5 所识别的人 ERBB2 胞内区 C 末端的 16 个氨基酸序列为 TPTAENPEYLGLDVPV-COOH。
	<ol>
		<li>在肽的N端添加4个氨基酸acetyl-YGSG，C端添加GSGC-amide，以促进肽与BSA的交联，并在BSA分子与肽表位之间提供空间间隔。 
		注意：完整序列为 acetyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide。</li>
		<li>必要时，可使用其他N端和C端氨基酸序列来延伸核心肽表位。 
		注意：不同序列的影响因抗体/表位组合的不同而有所差异。添加C端肽段可能会降低某些抗体与C端表位的结合。在此类情况下，应省略该序列。</li>
		<li>确认来自商业来源的多肽是否按以下方式提供： &#62;纯度95%，其组成经HPLC和质谱分析确认。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算5倍浓度（1.25 × 10⁻² M）肽段储备溶液所需的体积。参考 表1，列 C-E，输入抗原分子量（g/mol）、抗原纯度百分比（0-100）和抗原质量（mg）的数值。 
	注意：将样品重悬以配制 1.25 × 10⁻² M 储备溶液所需的溶剂体积（µL）为 800 × 抗原分子量 × 抗原纯度百分比 / 抗原质量。
	<ol>
		<li>准备八个1.5 mL微量离心管，并清晰标记。 
		注意：各管中将包含5倍浓度的肽段储备液（溶于溶剂中）、1倍浓度的肽段储备液（溶于溶剂中）、五组10倍系列稀释的肽段/BSA/甲醛凝胶（浓度从2.5 × 10⁻⁴ M至2.5 × 10⁻⁸ M），以及不含添加抗原的BSA/甲醛阴性对照凝胶。所有凝胶样品外观相同。在同时制备多组肽段稀释液时，务必正确标记并识别所有试管和包埋盒。应尽可能使用不同颜色编码的微量离心管和包埋盒，以减少误识别风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冻干肽（ERBB2 肽为 20 mg）的全部质量溶于 60 µL 适当溶剂中，配制成 1.25 × 10⁻² M 的 5 倍肽储备液。 
	注意：本示例中，将二甲基甲酰胺（DMF）直接加入供应商提供的容器中。
	<ol>
		<li>检查溶液以确保多肽完全溶解。如有必要，添加额外溶剂和/或对样品进行超声处理，直至多肽完全溶解，注意不要超过在 表1 用于5倍浓度的肽段储备液。 
		注意：DMF 有毒性；使用时应采取适当的预防措施。 
		注意：根据氨基酸序列及其相应的疏水性和电荷特性，多肽可能溶于二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、纯水，或乙酸、甲酸、碳酸氢铵的稀溶液中。多肽的特性可通过多种在线工具进行计算17某些多肽供应商可能会推荐适用于特定序列的溶剂。</li>
		<li>根据计算结果，必要时加入溶剂，将5倍浓度的肽段储备液调整至最终体积 表1涡旋5秒，室温下5000 × g离心 g 5 秒。肽段储备液可保存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参考 表 2，C列，通过将5倍浓度的肽储备液30 µL加入120 µL溶剂（本例中为DMF）中，配制150 µL的1倍浓度肽储备液（2.5 × 10⁻³ M）。涡旋混匀5秒，室温下以5000 × g离心 g 5 秒。</li>
	<li>参考 表 2，D列，通过将140 µL的1倍肽原液加入560 µL的31.3% BSA/PBS（pH 7.2）中，配制700 µL的5 × 10⁻⁴ M肽/BSA溶液（稀释液1）。涡旋混匀5秒，并在室温下以5000 × g离心 g 5 秒。 
	注意：该溶液中 BSA 的最终浓度为 25%（w/v）。</li>
	<li>参考 表 2，E-H列中，取5 × 10⁻⁴ M肽/BSA储备液，加入70 µL至630 µL pH 7.2的25% BSA/PBS溶液中，依次进行四次10倍系列稀释。涡旋混匀5秒，并在室温下以5000 × g离心 g 5 秒。 
	注意：此步骤之后，将在 pH 7.2 的 25% BSA/PBS 中得到五份肽的 10 倍系列稀释液（5 × 10⁻⁴ M 至 5 × 10⁻⁸ M）。前四份样品每份体积为 630 µL，最后一份样品体积为 700 µL。</li>
	<li>参考 表 2第 I 列，准备一个含 700 µL 25% BSA/PBS（pH 7.2）的阴性对照 BSA 样品（图1A).</li>
</ol>
3. 准备 BSA-多肽凝胶
<ol>
	<li>确认加热块或热循环仪已稳定在 85 °C。</li>
	<li>参考表3中的B至E列。每次处理一个样本，向第一个25% BSA/多肽样本（稀释1）中加入630 µL的37%甲醛。在5-10秒内用移液器上下吹打5次，充分混匀。避免产生气泡。 
	警告：浓甲醛具有毒性；操作时应采取适当的安全防护措施。
	<ol>
		<li>在混合多肽/BSA溶液与甲醛溶液后，将封闭的微量离心管置于85 °C加热块中加热10分钟。 
		注意：应彻底混合BSA-多肽溶液与甲醛，但在将样本放入加热装置前，移液操作时间不得超过10秒。由于甲醛交联反应立即开始，若不同样本的操作流程存在差异，可能导致凝胶形成不一致。这些凝胶中的最终BSA浓度为12.5%（w/v）。最终BSA浓度低于10%可能导致凝胶无法凝固；高于16%则可能导致凝胶过于脆硬，后续处理和切片困难。</li>
		<li>对稀释2至4的各样本重复步骤3.2和3.2.1。</li>
		<li>对稀释5重复步骤3.2和3.2.1，但加入700 µL的37%甲醛，体积与700 µL的BSA-抗原溶液相等。</li>
		<li>参考表3中G列；对阴性对照样本重复步骤3.2和3.2.1，加入700 µL的37%甲醛，体积与700 µL的阴性对照BSA溶液相等。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加热10-12分钟后，从加热块中取出离心管。每个样本的加热时间应尽可能保持一致。让凝胶在实验台面上冷却5-10分钟（图1B）。</li>
	<li>使用洁净、柔韧的一次性实验刮刀，将凝胶样本完整地从微量离心管中取出，并放入密封容器中，每个样本使用独立的容器，容器内至少含有15 mL中性缓冲福尔马林（NBF）。
	<ol>
		<li>或者，使用新的单刃剃须刀片切去微量离心管底部，然后用空气或合适的探针从底部将凝胶推出（图1C-G）。 
		&#8203;注意：固化后的甲醛/BSA凝胶可在室温下保留在微量离心管中最多24小时。若超过24小时，凝胶可能变脆，后续处理和切片将更加困难。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. BSA 凝胶的修剪、处理与包埋
<ol>
	<li>使用洁净的单刃剃刀将凝胶锥体修整成厚度约为 5 mm 的圆柱形薄片（图 1H，I）。用活检包埋纸包裹这些薄片，将一个较大的凝胶片放入一个包埋盒中（用于第 5 步的预实验），其余的凝胶片共同放入第二个包埋盒中（图 2A，E），用于第 6 步组织微阵列（TMA）的构建。将包裹好的凝胶片放入明确标记的组织处理包埋盒中。
	<ol>
		<li>在处理前，将装有凝胶的包埋盒置于至少 15 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中，每个样品使用单独的 NBF 容器。凝胶可在 10% NBF 中保存 6–48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动组织学组织处理机对凝胶进行处理，采用适用于大组织的程序，并施加压力与真空。每一步持续 1 小时：10% NBF、70% 乙醇、95% 乙醇（重复两次）、100% 乙醇（重复两次）、二甲苯（重复三次）、60 °C 石蜡（重复三次）。 
	注意：若研究者选择手动处理样品，应遵循相同的试剂顺序和时间。</li>
	<li>样品处理完成后，从组织处理机中取出包埋盒，并转移至石蜡包埋中心。</li>
	<li>将凝胶从活检包埋纸中取出，并包埋于石蜡中。每个样品中，将一个凝胶圆片包埋于一个较小的 15 mm × 15 mm 包埋模具中（图 2B–D），其余的凝胶片共同包埋于第二个较大的模具中（图 2F–H）。第一个仅含一个样品的蜡块将用于预实验中检测肽凝胶性能，第二个蜡块可用于构建组织微阵列（TMA）。</li>
</ol>
5. 肽段稀释系列的初步评估
<ol>
	<li>针对每种肽段稀释系列，计划制备两张载玻片，每张载玻片包含6个独立的切片区：分别来自五个稀释系列样品中的各一个切片区，以及一个仅含BSA的阴性对照样品切片区。
	<ol>
		<li>在第一张载玻片上，从含有凝胶圆片且肽段浓度最高的三个较小包埋块中，各切取一个厚度为4 µm的切片。</li>
		<li>在第二张载玻片上，从含有两个最低肽段浓度（2.5 E-7 M 和 2.5 E-8 M）的包埋块中各切取一个4 µm厚的切片，并从仅含BSA的对照包埋块中切取一个切片。记录载玻片上各样品的排列顺序。 
		注意：预期石蜡包埋的凝胶可顺利切片，产生均匀、无碎裂、撕裂或震颤伪影的切片。若某些石蜡包埋凝胶样品切片困难，可在切片前将包埋块表面短暂浸入冰冻蒸馏水中。如有必要，可尝试不同的浸泡时间或不同溶液（例如氨水）。</li>
		<li>切片完成后，将载玻片在室温（约23 °C）下干燥24小时，随后在60 °C下干燥30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照标准IHC操作流程，使用目标抗体对为每种肽段制备的两张载玻片进行染色。 
	注意：本实验中兔单克隆抗体4B5在载玻片上的使用浓度为1.5 µg/mL。
	<ol>
		<li>预期每个凝胶切片内的信号相对均匀，不同凝胶样品显示出与肽段稀释浓度相对应的信号强度梯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若预实验结果满意，则按照本方案后续步骤所述，使用含有不同浓度肽段抗原的凝胶供体块构建组织微阵列（TMA）。</li>
</ol>
6. BSA 凝胶 TMA 构建
<ol>
	<li>构建组织芯片，其中包含来自供体蜡块的重复1 mm直径组织芯，供体蜡块中分别含有仅含BSA凝胶的样本，以及含有五种不同浓度ERBB2肽段的BSA凝胶。 
	注：如需要，可额外加入含有相同五种浓度非靶向肽段的BSA凝胶作为阴性对照。如需要，还可加入代表性ERBB2表达细胞系的组织芯作为阳性对照。</li>
	<li>对组织芯片切取厚度为4 µm的切片，并按照实验室标准操作流程，使用1.5 µg/mL的抗ERBB2/HER2/neu兔单克隆抗体4B5（见材料表）进行染色。</li>
	<li>通过肉眼观察定性评估染色强度，或通过数字图像扫描与分析进行定量评估（图3A，B）。 
	注：由于数字图像分析并非本实验方案的重点，相关步骤由读者根据自身偏好自行完成。</li>
</ol>

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</ol>

Charles A. Havnar、Kathy J. Hötzel、Charles A. Jones、Carmina M. Espiritu、Linda K. Rangell 和 Franklin V. Peale 是基因泰克（Genentech）和罗氏（Roche）的员工及股东。其关联公司生产本研究中使用的试剂和仪器。

该方法允许用户利用大多数组织学实验室常见的材料和技术，制备具有已知组成和抗原浓度的均匀样品，作为免疫组化（IHC）反应中的标准品。最关键的步骤是确定目标抗体所结合的表位。本方案描述了使用来自ERBB2/HER2胞内区（ICD）的线性肽抗原进行操作。相同的方案也可用于制备含有寡核苷酸、荧光标记、蛋白质结构域或全长蛋白质的BSA凝胶。后一种方法对于识别构象性表位的抗体尤为有用，因为单一线性肽序列无法重建此类表位。例如，含有0.1 mg/mL小鼠、大鼠和兔源性天然IgG的BSA凝胶标准品可作为流程对照，以确认二抗检测和染色步骤按预期正常进行。
本文所述的抗原-BSA凝胶方法可与其他技术相互补充，用于控制和标准化免疫组化（IHC）反应。具有明确目标抗原表达水平的细胞系和组织样本对于严格控制的IHC实验方案至关重要1,3,4。已有研究提出将偶联在玻片或玻璃微珠表面的多肽作为定量对照<sup class="x...

免疫组织化学（IHC）能够在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织切片中，对目标抗原进行灵敏、特异且空间定位精确的检测。然而，IHC染色结果可能受到多种变量的影响，包括热缺血和冷缺血时间、组织固定、组织预处理、抗体活性与浓度、检测体系的化学反应以及反应时间1。因此，为确保IHC反应结果的可重复性并实现准确判读，必须严格控制这些变量，并使用经过充分表征的阳性与阴性对照样本。常用的对照包括已知表达目标抗原的石蜡包埋组织或细胞系，这些信息通常来自独立的分析结果，但此类样本并非总是可获得1。此外，组织和细胞系对照中目标抗原的表达水平通常仅能定性了解，且可能存在变异。含有可重复、浓度精确已知的目标抗原的对照样本，有助于优化IHC反应条件。作者已描述一种通用方法，可适用于多种抗原类型，并在生理相关浓度范围内制备合成IHC对照样本2。本文提供了该类标准品制备与使用的详细实验方案。
适当的对照对于正确解读免疫组化（IHC）检测结果至关重要1,3,4。根据研究人员的具体需求，已采用组织、培养细胞以及包被多肽的基质作为IHC对照。使用组织作为IHC对照的优势与局限性已有广泛讨论1,4。对于许多抗体而言，可从特定的正常组织中选择合适的对照，这些组织中的细胞群体表达目标抗原，且表达水平具有较宽的动态范围。然而，当目标抗原的表达部位或丰度尚未明确，或潜在的交叉反应抗原在同一细胞或组织部位共表达时，组织对照的适用性较差。在这些情况下，表达目标抗原的培养细胞系切块可能更为有用。为了进一步验证靶标特异性，可对细胞系进行改造，使其过表达或低表达目标抗原。例如，近期有研究利用表达不同水平PD-L1抗原的同基因型细胞系组织微阵列，评估了多种抗PD-L1检测方法5。然而，细胞系切块在常规应用中存在实际限制，包括培养足够数量细胞所需的成本和时间，以及某些抗原的表达水平可能不够稳定，即使在克隆来源的细胞系中也可能存在变异6。合成多肽是针对识别短线性表位抗体的第三种IHC对照选择。Steven Bogen及其同事已发表大量关于将多肽偶联至玻片表面7,8或玻璃微珠9作为对照的研究。该团队的一项研究显示，基于多肽的IHC对照的定量分析能够检测到平行分析的组织对照在定性评估中未能发现的染色过程变异10。尽管基于微珠抗原的标准品可能具有广泛适用性，但其许多技术细节由作者专有，限制了其广泛应用。
另一种IHC标准方法是将靶抗原掺入人工制备的蛋白质凝胶中。这一概念最早由Per Brandtzaeg于1972年在一项研究中提出，该研究使用戊二醛使正常兔血清发生聚合11。将所得凝胶切成小块后，浸泡于含不同浓度目标免疫球蛋白抗原的溶液中1至4周。经酒精固定和石蜡包埋后，结果显示，这些对照切片的染色强度与浸泡所用抗原溶液浓度的对数值相对应。随后，研究人员制备了稀释BSA或脑组织匀浆溶液中特定氨基酸的戊二醛偶联物，作为免疫电镜研究中的阳性对照12,13。近期有研究探讨了使用甲醛固定的蛋白质溶液制成的凝胶作为FFPE组织在质谱分析中的替代物14。另一项近期研究则考察了在不同浓度和pH条件下加热人血清白蛋白或牛血清白蛋白溶液所形成凝胶的结构与特性15。这些作者发现，血清白蛋白可形成三种类型的凝胶，其机械弹性、二级结构保留程度以及脂肪酸结合能力因实验条件不同而异。综上所述，这些文献证明了本研究中所采用方法的总体可行性：成分明确的蛋白质溶液可形成类似组织的凝胶，能够进一步通过常规组织学方法进行处理、切片和染色。
本方案描述了一种由牛血清白蛋白（BSA）经加热和甲醛交联聚合形成的合成型免疫组化对照物的制备方法。该凝胶可掺入多种抗原，包括全长蛋白、蛋白结构域和线性肽段，以及非蛋白抗原&#160;如寡核苷酸2。本示例使用一种抗原&#160;即编码人ERBB2（HER2/neu）蛋白C端16个氨基酸的线性肽段TPTAENPEYLGLDVPV-COOH（见材料表）。该序列包含三个 commercially available、具有诊断意义的抗体所识别的表位&#160;包括Herceptest多克隆试剂（ENPEYLGLDVP）以及单克隆抗体CB11（AENPEYL）和4B5（TAENPEYLGL）（见材料表）16。
本文所展示的方法采用常规组织学实验室中易于获取的试剂，并使用任何实际操作的组织学实验室都熟悉的技术和流程。最主要的局限性在于需要鉴定并购买目标抗原，但在许多情况下，这一过程的成本相对较低。由于这些合成对照品的组成完全明确，且制备方法简单，因此可在众多实验室中实现并获得可重复的结果。它们的应用可能有助于对免疫组化（IHC）染色结果进行客观、可量化的评估，并提高实验室内部及不同实验室之间的可重复性。

<table><tbody><tr><td>抗 HER2/neu 克隆 4B5</td><td>Ventana</td><td>5278368001</td><td></td></tr><tr><td>活检包埋盒</td><td>Leica</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，超纯</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>BSA #9998</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模（15 mm x 15 mm）</td><td>Fisher</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模&lt;br/&gt;（24 mm x 24 mm）</td><td>Fisher</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>一次性刮勺</td><td>VWR</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td></td></tr><tr><td>ERBB2 / HER2 肽段</td><td></td><td></td><td>UniProt P04626-1；氨基酸 1240-55</td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT 全片图像扫描仪</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶微离心管 1.5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 石蜡</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>肽段参数计算器</td><td>Pep-Calc&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td>https://www.pep-calc.com/</td><td></td></tr><tr><td>肽段供应商</td><td>ABclonal Science</td><td></td><td>用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。</td></tr><tr><td></td><td>Anaspec Peptide</td><td></td><td>用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。</td></tr><tr><td></td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。</td></tr><tr><td></td><td>New England Peptide</td><td></td><td>用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂级乙醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃刀</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 带正电荷载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>TMA 组织阵列仪（Tissue Grand Master）</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫组织化学的合成抗原对照

Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

免疫组织化学（IHC）检测可提供有关蛋白质表达模式的重要信息，其可靠解读依赖于经过充分表征的阳性和阴性对照样本。由于合适的组织或细胞系对照并不总是可获得，因此建立一种简便的方法来制备合成的IHC对照可能具有重要意义。本文介绍了一种适用于多种抗原类型（包括蛋白质、多肽或寡核苷酸）且浓度范围广泛的合成IHC对照制备方法。本方案以人红细胞白血病致癌基因B2（ERBB2/HER2）胞内区（ICD）的一段多肽为例，该多肽可被多种具有诊断意义的抗体识别。将HER2 ICD多肽在牛血清白蛋白（BSA）溶液中进行系列稀释后，加入甲醛并在85 °C加热10分钟，使多肽与BSA混合物凝固并发生交联。所得凝胶可像组织样本一样进行处理、切片和染色，从而获得一系列已知抗原浓度的样本，其染色强度覆盖较宽的范围。
该简易方案与常规组织学实验室操作流程一致。本方法仅要求使用者具备足量的目标抗原。可自行合成或商业制备编码相关表位的重组蛋白、蛋白结构域或线性肽段。自行制备抗体的实验室可保留免疫原性抗原的等分试样，作为合成对照靶标。通过制备浓度范围广泛的明确定义的阳性对照，使用者可评估实验室内及实验室间检测的性能，深入了解其检测方法的动态范围和线性关系，并针对特定实验目标优化检测条件。

肽应在室温下完全溶解于适当的溶剂中，形成光学澄清的溶液。如果在30-60分钟后仍存在可见的颗粒物质，可尝试加入额外体积的原始溶剂或替代溶剂，但总体积不得超过表1中计算的5倍浓度肽储备液的预定体积。同样，肽与BSA的混合溶液应保持半透明状态（图1A）。
肽/BSA 凝胶样品在与 37% 甲醛加热后应形成不透明的橡胶状凝块（图 1B-I）。在从微量离心管中取出时，凝胶样品可能出现轻微断裂（图 3A），但不应影响后续步骤。石蜡包埋的凝胶样品应能顺利切片，无撕裂或震颤现象。若凝胶出现不规则撕裂（图 3B），可通过减少修块面的修切强度和/或在冰水或氨水中短暂浸泡来改善。当一种或多种染色试剂分布不均时，可能出现水印样模式的信号减弱区域（<strong cla...

本研究记录了一种用于免疫组织化学的合成抗原对照品的简便制备方法。该技术可适用于多种抗原，并能在较宽的浓度范围内进行调整。所制备的样品可作为参考，用于评估实验内和实验间的一致性及可重复性。

免疫组织化学（IHC）检测可提供有关蛋白质表达模式的重要信息，其可靠解读需要……

BSA抗原凝胶是经过充分表征且可重复的免疫组化（IHC）标准品，可作为现有对照的补充。本方案采用常规组织学和免疫组化试剂及方法，制备成分明确、可重复的标准品。这些对照品可帮助不同实验室对多种具有诊断意义的免疫组化检测进行校准和标准化。选择合适的溶剂来溶解多肽或蛋白质至关重要。在不引入气泡的情况下快速混合抗原和甲醛溶液可能具有挑战性。首先，在50毫升锥形管中，将5克BSA粉末加入14毫升PBS中，配制20毫升25%（重量/体积）的BSA溶液，搅拌至均匀分散。涡旋溶液以溶解BSA粉末。将溶液在4°C下静置过夜，以确保完全溶解。次日，用PBS将终体积调至20毫升。同样，通过将 6.26 克 BSA 粉末溶于 13 毫升 PBS 中，配制 20 毫升 31.3%（质量/体积）的 BSA 溶液。在完全溶解的过夜孵育后，用 PBS 将终体积调至 20 毫升。为检测 BSA-甲醛混合物是否形成凝胶，将金属浴预热至 85 摄氏度。然后取700 µL的25% BSA溶液与700 µL的37%甲醛混合，通过上下吹打5次，在5到10秒内充分混匀，避免产生气泡。混合后立即把封闭的微量离心管放入预热至85 °C的加热块中。10 分钟后，将试管从加热块中取出，使其冷却，并确认凝胶已按预期形成。准备八个 1.5 毫升微量离心管并做好清晰标记。然后配制5倍浓度的多肽储备液，通过将释放出的多肽全部溶解于60微升适当的溶剂中，得到12.5毫摩尔/升的浓度。观察溶液，确保多肽完全溶解。然后根据多肽的分子量、质量及纯度，必要时加入额外的溶剂体积，以制成12.5毫摩尔/升的溶液。在此示例中，5x 肽储备液的最终体积为 626.9 µL。其他肽样品可能需要不同的最终体积。接下来，通过将 30 µL 的 5x 肽储备液加入 120 µL 溶剂中，配制 150 µL 浓度为 2.5 mM 的 1x 肽储备液。涡旋溶液5秒，室温下离心。接下来，将140微升1倍浓度的肽储备液加入560微升31.3% BSA溶液中，稀释后制备700微升0.5毫摩尔的肽-BSA溶液。涡旋混匀后，室温下离心该溶液。类似地，通过将70微升肽-B SA溶液加入630微升25% BSA溶液中，对肽-B SA储备液进行连续四次10倍系列稀释。为制备B SA肽凝胶，按1:1比例将37%甲醛加入肽-B SA稀释液中，每次处理一个样品。用移液器上下吹打5次，在5至10秒内充分混匀，注意避免产生气泡。混合后，将封闭的微量离心管置于85 °C的加热块中孵育10分钟。待所有肽-BSA与甲醛溶液完成配制并加热后，将凝胶在实验台面上冷却5至10分钟。接着，使用洁净、柔韧的一次性实验室刮刀，将凝胶样品完整地从微量离心管中取出。将其放入一个密封容器中，容器内需含有至少15毫升中性缓冲福尔马林，每份样本使用单独的容器。或者，使用新的单刃剃须刀片切下微量离心管的底部，并用空气或合适的探针从底部将凝胶推出。使用洁净的单刃剃须刀片将凝胶锥体修整成厚度约为5毫米的圆柱形切片。将凝胶圆片用活检包埋纸包裹后，将一个较大的凝胶圆片放入一个包埋盒中，其余的凝胶圆片共同放入第二个包埋盒中，用于组织微阵列构建。处理前，将每个包埋盒中的凝胶置于至少15毫升的10%中性缓冲福尔马林溶液中，每份样本使用单独的容器。随后，按照大组织程序并结合压力与真空条件，在自动组织学组织处理仪中处理这些凝胶。样本处理完成后，将包埋盒从组织处理机中取出，并转移至石蜡包埋台。将凝胶从活检包埋纸中取出后，将凝胶包埋于石蜡中，或将每个样本的一片凝胶置于一个较小的 15 × 15 毫米模具中，其余的凝胶片则共同放入第二个较大的模具中。针对每种肽段稀释系列，制备两张载玻片，每张载玻片上包含总共六个独立区域：五个分别来自各稀释系列样本的区域，以及一个仅含牛血清白蛋白（BSA）的阴性对照样本区域。切片并干燥载玻片后，使用目标一抗对为每种肽段制备的两张载玻片进行染色。根据标准免疫组织化学实验方案，每个凝胶切片内应观察到相对均匀的信号，不同凝胶样品的信号强度范围应与肽段稀释浓度相对应。对于BSA凝胶组织微阵列构建，需切取四微米厚的组织微阵列切片，并根据实验室标准操作流程使用兔单克隆抗体进行染色。通过目测或数字图像扫描与分析对染色结果的强度进行定性或定量评估。在与相应抗体反应后，仅含牛血清白蛋白（BSA）的阴性对照凝胶样品显示出极低的信号。单个凝胶样品中的信号强度相对均匀，并随抗原浓度的增加而增强。超过10%的MDA-MB-175细胞呈现微弱且不完整的环周膜染色。相比之下，超过10%的SKBR-3细胞则显示强阳性、完整的环周膜染色。加入甲醛后需迅速操作，因为溶液即使在室温下也会开始凝胶化。我们在测试新抗体时使用该方法制备免疫组化对照，以确保检测结果符合预期，即使待测抗体未显示信号时也能提供可靠验证。组织或细胞系对照具有内在的变异性。合成抗原对照使我们能够更精确地测量改变特定 ISD 反应条件的影响。

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