免疫组织化学的合成抗原对照

BSA抗原凝胶是经过充分表征且可重复的免疫组化（IHC）标准品，可作为现有对照的补充。本方案采用常规组织学和免疫组化试剂及方法，制备成分明确、可重复的标准品。这些对照品可帮助不同实验室对多种具有诊断意义的免疫组化检测进行校准和标准化。

选择合适的溶剂来溶解多肽或蛋白质至关重要。在不引入气泡的情况下快速混合抗原和甲醛溶液可能具有挑战性。首先，在50毫升锥形管中，将5克BSA粉末加入14毫升PBS中，配制20毫升25%（重量/体积）的BSA溶液，搅拌至均匀分散。

涡旋溶液以溶解BSA粉末。将溶液在4°C下静置过夜，以确保完全溶解。次日，用PBS将终体积调至20毫升。

同样，通过将 6.26 克 BSA 粉末溶于 13 毫升 PBS 中，配制 20 毫升 31.3%（质量/体积）的 BSA 溶液。在完全溶解的过夜孵育后，用 PBS 将终体积调至 20 毫升。为检测 BSA-甲醛混合物是否形成凝胶，将金属浴预热至 85 摄氏度。

然后取700 µL的25% BSA溶液与700 µL的37%甲醛混合，通过上下吹打5次，在5到10秒内充分混匀，避免产生气泡。混合后立即把封闭的微量离心管放入预热至85 °C的加热块中。

10 分钟后，将试管从加热块中取出，使其冷却，并确认凝胶已按预期形成。准备八个 1.5 毫升微量离心管并做好清晰标记。

然后配制5倍浓度的多肽储备液，通过将释放出的多肽全部溶解于60微升适当的溶剂中，得到12.5毫摩尔/升的浓度。观察溶液，确保多肽完全溶解。然后根据多肽的分子量、质量及纯度，必要时加入额外的溶剂体积，以制成12.5毫摩尔/升的溶液。

在此示例中，5x 肽储备液的最终体积为 626.9 µL。其他肽样品可能需要不同的最终体积。接下来，通过将 30 µL 的 5x 肽储备液加入 120 µL 溶剂中，配制 150 µL 浓度为 2.5 mM 的 1x 肽储备液。

涡旋溶液5秒，室温下离心。接下来，将140微升1倍浓度的肽储备液加入560微升31.3% BSA溶液中，稀释后制备700微升0.5毫摩尔的肽-BSA溶液。涡旋混匀后，室温下离心该溶液。

类似地，通过将70微升肽-B SA溶液加入630微升25% BSA溶液中，对肽-B SA储备液进行连续四次10倍系列稀释。为制备B SA肽凝胶，按1:1比例将37%甲醛加入肽-B SA稀释液中，每次处理一个样品。用移液器上下吹打5次，在5至10秒内充分混匀，注意避免产生气泡。

混合后，将封闭的微量离心管置于85 °C的加热块中孵育10分钟。待所有肽-BSA与甲醛溶液完成配制并加热后，将凝胶在实验台面上冷却5至10分钟。接着，使用洁净、柔韧的一次性实验室刮刀，将凝胶样品完整地从微量离心管中取出。

将其放入一个密封容器中，容器内需含有至少15毫升中性缓冲福尔马林，每份样本使用单独的容器。或者，使用新的单刃剃须刀片切下微量离心管的底部，并用空气或合适的探针从底部将凝胶推出。使用洁净的单刃剃须刀片将凝胶锥体修整成厚度约为5毫米的圆柱形切片。

将凝胶圆片用活检包埋纸包裹后，将一个较大的凝胶圆片放入一个包埋盒中，其余的凝胶圆片共同放入第二个包埋盒中，用于组织微阵列构建。处理前，将每个包埋盒中的凝胶置于至少15毫升的10%中性缓冲福尔马林溶液中，每份样本使用单独的容器。随后，按照大组织程序并结合压力与真空条件，在自动组织学组织处理仪中处理这些凝胶。

样本处理完成后，将包埋盒从组织处理机中取出，并转移至石蜡包埋台。将凝胶从活检包埋纸中取出后，将凝胶包埋于石蜡中，或将每个样本的一片凝胶置于一个较小的 15 × 15 毫米模具中，其余的凝胶片则共同放入第二个较大的模具中。

针对每种肽段稀释系列，制备两张载玻片，每张载玻片上包含总共六个独立区域：五个分别来自各稀释系列样本的区域，以及一个仅含牛血清白蛋白（BSA）的阴性对照样本区域。切片并干燥载玻片后，使用目标一抗对为每种肽段制备的两张载玻片进行染色。

根据标准免疫组织化学实验方案，每个凝胶切片内应观察到相对均匀的信号，不同凝胶样品的信号强度范围应与肽段稀释浓度相对应。对于BSA凝胶组织微阵列构建，需切取四微米厚的组织微阵列切片，并根据实验室标准操作流程使用兔单克隆抗体进行染色。

通过目测或数字图像扫描与分析对染色结果的强度进行定性或定量评估。在与相应抗体反应后，仅含牛血清白蛋白（BSA）的阴性对照凝胶样品显示出极低的信号。单个凝胶样品中的信号强度相对均匀，并随抗原浓度的增加而增强。

超过10%的MDA-MB-175细胞呈现微弱且不完整的环周膜染色。相比之下，超过10%的SKBR-3细胞则显示强阳性、完整的环周膜染色。加入甲醛后需迅速操作，因为溶液即使在室温下也会开始凝胶化。我们在测试新抗体时使用该方法制备免疫组化对照，以确保检测结果符合预期，即使待测抗体未显示信号时也能提供可靠验证。

组织或细胞系对照具有内在的变异性。合成抗原对照使我们能够更精确地测量改变特定 ISD 反应条件的影响。