从成人小鼠腭中分离和培养原代口腔角质形成细胞

近年来，口腔角质形成细胞因其独特的性质而受到关注。我们提供一种方案，用于培养适合下游应用的干细胞样状态的小鼠口腔角质形成细胞。小鼠口腔角质形成细胞的培养物与皮肤角质形成细胞的特征不同。

在该协议中，我们成功地分离出原代小鼠口腔角质形成细胞，并开发了一种长期培养技术。该培养系统可用于分子和生化测定，以进一步了解口腔基底干细胞的特征及其相关疾病。牺牲成年C57BLK6J小鼠后，用剃须刀去除嘴巴周围的毛发，并用剪刀从脸颊向两侧的下颌切割。

接下来，使用镊子张开嘴巴，用棉签吸收任何血液，然后用含有10%聚维酮碘的棉签擦拭口腔内部，对调色板进行消毒。要收获鼠标调色板，首先使用手术刀刀片，沿着上颌牙齿的调色板侧做一个全厚度的边缘切口。然后使用覆盆，仔细解剖整个调色板。

快速将调色板组织转移到含有4毫升补充抗生素和抗真菌剂的完全培养基的15毫升管中。将组织保持在冰上，直到准备好孵育。在层流罩中，将组织转移到含有4毫升完整培养基的60毫米培养皿中，并含有抗生素和抗真菌剂。

然后使用短钝镊子和手术刀刀片，轻轻地从组织上取出任何血液，并用完整的培养基清洗组织10次。最后一次洗涤后，将组织转移到含有4毫升0.025%胰蛋白酶的35毫米培养皿中，并补充抗生素和抗真菌药。将上皮表面朝下的组织置于培养罩中，并在室温下在培养罩中孵育16小时。

胰蛋白酶消化过夜后，使用一对钝钳从胰蛋白酶溶液中取出组织，并将其转移到含有胰蛋白酶抑制剂溶液的60毫米培养皿中，上皮表面朝上。接下来，用镊子抓住调色板的边缘，使用手术刀刀片轻轻地刮掉下层上的上皮层。为了从组织中收集最大数量的上皮细胞，将组织转移到另一个60毫米的培养皿中，其中有四毫升的完整培养基并重复刮擦，如前所述。

接下来，将无菌的100微米细胞过滤器放在50毫升锥形管的顶部。并使用无菌移液管，将两毫升胰蛋白酶溶液转移到过滤器中以润湿其表面。然后使用移液管，将细胞悬浮液在60毫米培养皿中混合几次，并通过100微米细胞过滤器过滤细胞。

为了计数细胞的数量，将15微升的细胞悬浮液加入50微升的台盼蓝溶液中，然后将10微升的细胞台盼蓝混合物转移到血细胞计数器中并计数细胞的数量。接下来，离心细胞悬浮液，除去上清液，并向管中加入两毫升含有Chelex FBS的完整培养基。通过使用5毫升移液器滴定几次来重悬细胞沉淀。

然后将2至5倍10至5个细胞从一只小鼠接种到预先包被有第一型胶原蛋白的24孔板的一孔中，并在37摄氏度下孵育细胞两天而不改变培养基。原代口腔角质形成细胞生长为单层，并显示出鹅卵石形态。小的角质形成细胞集落在三天和五天后可见。

经过一周的孵化，这些菌落变大并形成紧密的菌落。第一次传代在初始接种后两周进行，在后来的传代中，角质形成细胞表现出稳定的生长和较短的培养期。如果在分离过程中发生显着的成纤维细胞污染，角质形成细胞停止生长。

培养后，角质形成细胞表达角蛋白14和α6-整合素。早期和晚期传代细胞表现出P63的均匀表达，证实了它们的干性。然而，用高钙处理的角质形成细胞表现出P63表达降低，表明高钙处理抑制干细胞相关基因。

分化标志物角蛋白13在早期和晚期传代中罕见或无表达，但在高钙治疗中显着表达。成纤维细胞标志物PDGFR α在角质形成细胞培养物中未表达，表明该方案可以成功分离基底角质形成细胞并将这些细胞维持在未分化状态。诱捕应从硬膜外侧开始，每个组织样本10分钟。

通常，细胞移液对于提高细胞活力也很重要。经过两到三次通过后，口腔角质形成细胞变得稳定，以进行进一步的功能实验。重要的是，该协议可以与转基因小鼠寿命相结合，用于体外细胞和分子测定。

最近的研究报道了口服基底干细胞的动力学和异质性。这种方法将有助于口腔干细胞生物学的研究，并导致对口腔疾病的更好理解。