Name: 从成人小鼠腭中分离和培养原代口腔角质形成细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习从成年C57BL/6J小鼠腭部分离和培养原代口腔角质形成细胞的方法。该技术可维持细胞干性特征，适用于口腔基底干细胞生物学及相关疾病研究的分子和生化实验。

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本研究得到了科学研究费补助金（B）（20H03266）（授予A.S.）、早稻田科学家研究费补助金（18K14709）（授予A.S.）、日本医疗研究开发机构（AMED）资助项目JP21gm6110016和21bm0704067（授予A.S.），以及武田科学财团研究基金的支持。感谢熊本大学动物资源与开发中心和筑波大学动物资源中心在小鼠饲养管理方面的大力支持。感谢熊本大学IRCMS核心设施在共聚焦成像方面提供的技术支持。

所有动物实验均按照熊本大学和筑波大学机构动物实验委员会的指南进行。
1. 试剂与培养基的制备
<ol>
	<li>准备 40 mL 含 60 µM 钙和 600 µL 抗生素-抗真菌溶液的角质形成细胞培养基。另准备 20 mL 0.025% 胰蛋白酶和 400 µL 抗生素-抗真菌溶液。
	<ol>
		<li>在室温下解冻胰蛋白酶抑制液，并在使用前（步骤 4.1）置于 4 °C 保存。 
		注意：分离试剂的配制量适用于五只小鼠的组织分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为配制培养基，取 500 mL 基础培养基，加入 5 mL 生长补充液（见材料表）（以下简称完全培养基）和 20% 去钙螯合处理胎牛血清（FBS）33（以下简称螯合-FBS）。</li>
</ol>
2. 成年小鼠腭组织的解剖
<ol>
	<li>根据机构有关动物福利的规定，通过颈椎脱位法处死一只成年C57BL/6J小鼠（雄性或雌性均可）。
	<ol>
		<li>使用剃毛器去除口周毛发。用剪刀从两侧脸颊向颌部剪开。 
		注意：小鼠在处死前需进行麻醉。使用甲苯噻嗪、咪达唑仑和丁丙诺啡的麻醉混合物（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子将小鼠口腔充分打开，并用棉签吸除任何血液。为消毒腭部，使用含10%聚维酮碘的棉签擦拭口腔内侧。</li>
	<li>为获取小鼠腭组织，首先使用外科手术刀片沿上颌牙齿的腭侧做全层边缘切口。然后使用骨膜剥离器小心分离整个腭部组织。 
	注意：骨膜剥离器是一种用于掀起黏骨膜瓣的工具（见材料表）（图1B）。</li>
	<li>迅速将腭组织转移至含有4 mL完全培养基加抗生素-抗真菌溶液的15 mL离心管中。将组织置于冰上保存，直至准备进行孵育。 
	&#8203;注意：若从多只小鼠收集组织，腭组织可在冰上保存最多4小时。</li>
</ol>
3. 腭组织的预处理
<ol>
	<li>在超净工作台中，将组织转移至含有 4 mL 完全培养基加抗生素-抗真菌素溶液的 60 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用短而钝的镊子和手术刀片，轻轻去除组织上的血液。用完全培养基洗涤组织 10 次。</li>
	<li>将组织转移至含有 4 mL 0.025% 胰蛋白酶加抗生素-抗真菌素溶液的 35 mm 培养皿中，使上皮面朝下。 
	注意：应使向内弯曲的上皮面浸入胰蛋白酶溶液中；固有层应朝上。应尽可能将组织展平，以确保完全浸入胰蛋白酶溶液中进行孵育。</li>
	<li>在室温下的培养罩中，用 0.025% 胰蛋白酶孵育组织约 16 小时。</li>
</ol>
4. 原代细胞的收集与培养
<ol>
	<li>使用一对钝头镊子将组织从35 mm培养皿中的胰蛋白酶溶液中取出，并转移至盛有4 mL胰蛋白酶抑制剂溶液的60 mm培养皿中，使上皮面朝上。</li>
	<li>用镊子夹住腭部边缘，使用手术刀片轻轻刮除位于固有层之上的上皮层。 
	注意：结缔组织不会被胰蛋白酶消化，因此在刮取过程中不会脱落。</li>
	<li>为从组织中收集尽可能多的上皮细胞，将组织转移至另一含有4 mL完全培养基的60 mm培养皿中，并重复刮取步骤。 
	注意：务必避免使用刀片尖端刮取组织，应使用刀片边缘。每份组织刮取时间为5–10分钟。</li>
	<li>将无菌的100 µm细胞筛置于50 mL锥形离心管顶部。</li>
	<li>使用无菌移液器，将2 mL胰蛋白酶溶液（来自步骤4.1）加入筛网中以润湿其表面。</li>
	<li>使用移液器将60 mm培养皿中的细胞悬液（来自步骤4.2–4.3）反复吹打数次，并通过步骤4.4–4.5中已准备好的100 µm细胞筛进行过滤。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。准备15 µL台盼蓝溶液，并加入15 µL细胞悬液（步骤4.6）。取10 µL细胞与台盼蓝的混合液滴加至血细胞计数板，计数细胞数量。 
	注意：一只小鼠的腭部组织最多可获得100万个细胞。</li>
	<li>在计数的同时，将步骤4.6所得离心管在室温下以100 × g 离心5分钟。</li>
	<li>用移液器吸除上清液。向离心管中加入2 mL完全培养基 + 去除金属离子的胎牛血清（chelexed-FBS）。使用5 mL移液器反复吹打数次，重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将一只小鼠来源的2–5 × 105个细胞接种至已预先包被I型胶原蛋白（见材料表）的24孔板的一个孔中。</li>
	<li>将细胞在37 °C条件下孵育2天，期间不更换培养基。</li>
	<li>接种后两天，更换一半培养基为完全培养基 + 去除金属离子的胎牛血清。在显微镜下观察细胞形态。此后每2天以完全培养基 + 去除金属离子的胎牛血清换液一次。 
	注意：接种后可观察到不同大小的细胞。接种后约3–5天，可观察到具有铺路石样形态的角质形成细胞（图2）。通常需要培养1–2周后方可进行首次传代，再经过1–2周的培养后细胞方可用于第二次和第三次传代。此后细胞生长速度加快，可准备进行冻存。首次传代时可将细胞重新接种至24孔板的一个孔中，第二次传代时接种至6孔板的一个孔中。后续传代应根据细胞生长状态和密度决定。第三次传代后可采用1:2或1:3的传代比例。</li>
</ol>
5. 角质形成细胞传代
<ol>
	<li>从培养皿中收集 2 mL 上清液，加入预冷的 15 mL 圆底离心管中（置于冰上）。用无菌 1× PBS 洗涤细胞两次。 
	注意：当细胞融合度达到约 70%–80% 时，即可进行传代。</li>
	<li>向 6 孔板的一个孔中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 5–15 分钟；5 分钟后检查细胞是否从培养皿上脱落。&#160;</li>
	<li>加入 1 mL 胰蛋白酶抑制液和 2 mL 完全培养基（含去螯合胎牛血清），轻轻吹打以中和反应。随后，将细胞悬液转移至与步骤 5.1 相同的 15 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 100 × g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，将 1 mL 细胞悬液接种至新的 24 孔或 6 孔培养板中。 
	&#8203;注意：早期传代的部分细胞可冻存于由 70% 完全培养基 + 20% 去螯合胎牛血清 + 10% DMSO 组成的冻存液中。从一个完全融合的培养板中可收集 1–2 支冻存管的细胞。</li>
</ol>
6. 角质形成细胞的冷冻保存与复苏
<ol>
	<li>细胞冻存
	<ol>
		<li>将角质形成细胞培养至 80%–90% 汇合度。 
		注意：切勿让细胞过度生长，以免降低其增殖能力和存活率。</li>
		<li>按照步骤 5.1–5.5 所述方法，用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 处理培养皿中的角质形成细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板对角质形成细胞进行计数。根据计算出的细胞数量准备冻存管，使每管中加入 1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>将细胞悬液在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 10% DMSO + 20% 螯合处理的 FBS + 70% 完全培养基的溶液中（9 mL 完全培养基 + 螯合处理的 FBS 与 1 mL DMSO）。</li>
		<li>每支冻存管中加入 1 mL 细胞悬液。将冻存管置于低温冻存容器中，于 -80 °C 过夜。次日将冻存管转移至液氮罐中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞复苏
	<ol>
		<li>从液氮罐中取出一支冻存管，在室温下部分解冻。在 15 mL 离心管中，将 1 mL 细胞悬液与 3 mL 完全培养基 + 螯合处理的 FBS 混合。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 完全培养基 + 螯合处理的 FBS 中。</li>
		<li>将细胞悬液接种至新的 I 型胶原蛋白包被的 60 mm 培养皿中。每 2–3 天更换一次培养基，待细胞汇合后进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>在6孔板中，将口腔角质形成细胞接种于方形盖玻片（22 mm × 22 mm）上（每孔 5 × 105 个细胞），培养2天。</li>
	<li>室温下用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定角质形成细胞20分钟，随后用1× PBS洗涤3次。</li>
	<li>用含0.1% Triton的PBS溶液对细胞进行透化处理。室温下用封闭液（2.5%山羊血清、2.5%驴血清）孵育1小时，随后加入一抗（见材料表）于4 °C过夜孵育。 
	注：一抗稀释比例如下：兔抗K14（1:1000）、大鼠抗α6-整合素（1:100）、兔抗p63（1:500）、兔抗K13（1:100）和山羊抗PDGFRα（1:100）。</li>
	<li>用含0.1% Triton的PBS溶液洗涤样本，随后室温下与二抗孵育1小时。 
	注：二抗（Alexa 488或555标记）按1:300稀释使用。</li>
	<li>所有样本用Hoechst溶液复染10分钟，然后将细胞封片至载玻片上。 
	注：Hoechst溶液用于细胞核染色。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜进行样本成像。 
	注：通过图像处理软件将图像的亮度和对比度调整至相同强度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

多年来，研究人员已在科研和临床应用中使用从人或小鼠皮肤表皮分离的原代角质形成细胞12,13,15,18,27,28,29。相比之下，目前建立的从成年小鼠分离和培养口腔原代角质形成细胞的方案较少30,31,32。本研究采用商业化的完全培养基和Chelex处理的胎牛血清（chelexed-FBS），以维持角质形成细胞处于增殖状态或类似干细胞的状态。该培养系统可用于分子和生化实验，以进一步理解口腔上皮干细胞的特性及其相关疾病。
本方案包含若干关键步骤。首先，胰蛋白酶浓度和孵育时间对于获得可用于后续培养的活细胞至关重要。我们始终在室温下的培养皿罩内使用0.025%的胰蛋白酶溶液，并孵育16小时。若孵育时间不足，角质形成细胞将无法从组织中充分解离，导致最终细胞得率降低。其次，在第二天轻柔地吹打细胞悬液对细胞活力有显著影响。刮取操作应从上皮侧开始，且每份组织样本的刮取时间不应超过10分钟。最后，初次分离得到的细胞悬液中含有成纤维细胞及其他细胞类型；这些不需要的细胞通常会在后续培养中逐渐消失。
在细胞分离和培养过程中发现了潜在的局限性。在极少数情况下，成纤维细胞可能在分离过程中发生污染，且这些成纤维细胞可能在后续传代中抑制角质形成细胞的生长（图2H）。因此，有必要选用含有成纤维细胞生长抑制剂的商用培养基，以消除培养中的此类污染。由于小鼠腭部及其他口腔黏膜组织相对较小，单只小鼠获得的初始细胞产量可能较低。因此，本实验方案的整个培养周期——直至冷冻保存阶段——比原代皮肤角质形成细胞更长。分离得到的口腔角质形成细胞最好在10代以内使用，因为更长时间的培养可能改变细胞特性，并减少干细胞的数量。
目前的方法显示，小鼠口腔角质形成细胞在增殖条件下表现出紧密排列的鹅卵石样形态，并形成单层集落。这些细胞还高表达基底标记物α6-整合素、K14以及干细胞标记物p63。在后续研究中，除了免疫荧光染色外，还将采用RNA测序、RT-PCR和蛋白质印迹分析来验证口腔角质形成细胞的细胞异质性和纯度，这将进一步加深我们对这些细胞特性的理解。
经过2-3次传代后，口腔角质形成细胞已足够稳定，可用于进一步的功能实验。重要的是，该培养方案可与转基因小鼠品系结合使用，包括基因敲除、Cre-loxP和四环素诱导系统，也可用于细胞和分子检测。因此，本方案为研究人员提供了一种基础且高效的方法，可用于进一步理解口腔角质形成细胞干细胞生物学。

口腔上皮在保护机体免受化学或物理损伤以及细菌和病毒感染等环境应激因素侵害方面起着第一道屏障的作用1,2。口腔黏膜由外层的复层鳞状上皮和其下方称为固有层的结缔组织构成，其中上皮主要由角质形成细胞组成，固有层则主要由成纤维细胞和细胞外基质组成。小鼠口腔黏膜大致可分为三种亚型：咀嚼黏膜（硬腭和牙龈）、特殊黏膜（舌背）和被覆黏膜（颊黏膜、舌腹、软腭、唇）2,3（图1A）。咀嚼黏膜和特殊黏膜中的口腔上皮为角化上皮，而被覆黏膜中的上皮为非角化上皮。尽管解剖位置不同，口腔上皮在结构上与皮肤表皮相似，均由紧密排列的上皮细胞构成，并表现出不同程度的分化：包括含有未分化细胞的基底层；形成角化上皮的棘层、颗粒层和角化层，或形成非角化上皮的中间层和表层4。转基因小鼠模型促进了对腭部、颊黏膜、舌和牙龈中口腔上皮干细胞的细胞与分子特征的研究5,6,7,8,9,10,11。然而，这些研究大多主要依赖于体内小鼠实验，由于缺乏成熟且高效的实验方案，细胞培养系统通常未被采用。
一种体外培养系统可用于干细胞调控因子的分子与生化分析、基于细胞的检测以及药物筛选。目前，已建立皮肤表皮原代角质形成细胞的培养方案，在这些方案中，基底层角质形成细胞可被成功分离并培养，用于临床和科研目的12,13,14,15。1980年，Hennings 等人发现，培养基中低钙浓度（&#60; 0.09 mM Ca2+）有助于细胞增殖，并使细胞维持在未分化状态；而较高浓度的钙则促进细胞分化并抑制增殖16。随后，针对新生及成年小鼠表皮角质形成细胞的培养方法相继建立，并广泛应用于具有不同遗传背景的多种小鼠模型的体外研究17,18,19。尽管皮肤与口腔上皮具有共同的特征，但二者也存在内在差异，例如在角化状态、更新速率、基因表达以及伤口愈合能力等方面3,11,20,21,22,23,24,25,26。
尽管人源口腔角质形成细胞的培养已成功实现27,28,29，但由于目标组织体积较小，且其细胞特性与皮肤表皮角质形成细胞存在显著差异，关于小鼠口腔角质形成细胞培养的文献报道仍较为有限30,31,32。本实验方案详细描述了小鼠原代口腔角质形成细胞的分离及长期培养技术。

<table><tbody><tr><td>0.025% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.4 w/v% 台盼蓝溶液</td><td>Wako</td><td>207-17081</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 尼龙细胞滤网</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 无菌锥形管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 吸液移液管</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>96 孔培养板（U 型底）</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂 100 倍浓缩液</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biocoat I 型胶原细胞培养皿（60 mm）</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>AS ONE</td><td>1-8187-03</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td></td><td>Vetorphale</td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>低温储存</td></tr><tr><td>棉球</td><td>AS ONE</td><td>63-1452-97</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22 × 22 &amp;mu;m 正方形</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL 冻存管</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-0012</td><td></td></tr><tr><td>定义型胰蛋白酶抑制剂（DTI）</td><td>Gibco</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td></td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife 定义型生长添加剂（EDGS）</td><td>Gibco</td><td>S0120</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife，含 60 &amp;micro;M 钙</td><td>Gibco</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 PDGF 受体 &amp;alpha;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>半弯镊子</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3376</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te</td><td>8100204</td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>Muromachi Kikai</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td></td><td>Domitor</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Astellas Pharma</td><td></td><td>Dormicum</td></tr><tr><td>15 号一次性手术刀片</td><td>Feather</td><td>219AABZX00136000</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Y's Square</td><td>872612</td><td></td></tr><tr><td>兔抗细胞角蛋白 13 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 K14 抗体</td><td>BioLegend</td><td>905301</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 p63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>刮匙 #14</td><td>AS ONE</td><td>8-4599-01</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 &amp;alpha;6-整合素</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Wako</td><td>581-81705</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原包被的 24 孔板</td><td>Corning</td><td>354408</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原包被的 60 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原包被的 6 孔板</td><td>Corning</td><td>355400</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠成年腭部分离和培养原代口腔角质形成细胞

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

多年来，大多数涉及角质形成细胞的研究都是使用人和小鼠皮肤表皮角质形成细胞进行的。近年来，口腔角质形成细胞因其独特的功能和特性而受到关注。它们维持口腔上皮的稳态，并可作为再生治疗应用的资源。然而 体外 由于缺乏高效且成熟的培养方案，利用成年小鼠口腔原代角质形成细胞的研究一直较为有限。本文中，我们从成年小鼠腭部组织分离口腔原代角质形成细胞，并在添加了经chelex处理的血清的商用低钙培养基中进行培养。在此条件下，角质形成细胞维持在增殖状态或类似干细胞的状态，即使经过多次传代，其分化仍受到抑制。标志物表达分析显示，培养的口腔角质形成细胞表达基底细胞标志物p63、K14和α6-整合素，而不表达分化标志物K13和成纤维细胞标志物PDGFRα。该方法可获得具有活力且可培养的细胞，适用于口腔上皮干细胞功能研究中的后续实验应用

口腔原代角质形成细胞，成年小鼠，低钙培养基，chelex处理血清，干细胞样状态，p63，K14，α6-整合素，K13，PDGFRα 体外.

成年小鼠腭部口腔角质形成细胞的分离与解剖过程概述 
从成年小鼠腭部分离获得单细胞悬液的口腔角质形成细胞，并在含20%经chelex处理的胎牛血清（FBS）的定制培养基中进行培养。小鼠腭部由硬腭和软腭组成（图1C）。小鼠口腔角质形成细胞的分离流程总结于图1D。首先解剖获取腭部组织，转移至含有抗生素-抗真菌素溶液的培养基中，随后在4 °C条件下用0.025%胰蛋白酶溶液过夜孵育。次日，以等体积的胰蛋白酶抑制剂溶液和完全培养基处理腭部组织。接着使用外科手术刀片刮取组织以收集口腔角质形成细胞。细胞悬液经100 µm细胞滤网过滤后离心。最后将细胞接种于含有2 mL完全培养基加chelex处理FBS的I型胶原蛋白包被的24孔板中。
小鼠口腔角质形成细胞成功分离的代表性结果 
原代口腔角质形成细胞以单层形式生长，并呈现铺路石样形态（图2）。在培养3–5天后可见小型角质形成细胞克隆（图2A、B）；培养1周后，克隆逐渐增大并形成致密的细胞集落（图2C）。角质形成细胞克隆表现出基底角质形成细胞典型的形态学特征，表明其生长状态良好。在含0.06 mM Ca2+16,28的完全培养基中，人源口腔角质形成细胞可在多代传代过程中保持未分化状态。首次传代约在初次接种后2周进行（图2D）。后续传代过程中，角质形成细胞表现出稳定的增殖能力，且培养周期更短（图2E–G）。若分离过程中出现明显的成纤维细胞污染，则角质形成细胞的生长将停止（图2H）。
分离的小鼠口腔角质形成细胞表达基底细胞标志物 
为确认原代口腔角质形成细胞的状态，采用基底细胞标志物角蛋白14（K14）和α6-整合素进行免疫染色34。培养后的角质形成细胞表达K14和α6-整合素（图3A、B）。同时使用干细胞标志物p63对细胞进行染色，以确认其干性特征。早期传代（第4代）和晚期传代（第7代）细胞均显示p63的均一表达（图3C、D）。相比之下，经高钙（1.2 mM诱导2天）处理的角质形成细胞p63表达降低（图3E），表明高钙处理可抑制原代角质形成细胞中与干细胞相关的基因表达，这与先前报道一致16。分化标志物角蛋白13（K13）在早期和晚期传代细胞中几乎不表达或无表达，而在高钙处理条件下则呈现显著表达（图3F–H）。为检测角质形成细胞培养物中可能存在成纤维细胞污染，使用成纤维细胞标志物PDGFRα对同一组角质形成细胞进行染色，并与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行比较。结果显示，角质形成细胞培养物中无PDGFRα表达，而MEF细胞中则呈现高表达（图3I–L）。上述结果表明，该方案能够成功分离基底角质形成细胞并维持其未分化状态。
<img alt="小鼠腭部解剖示意图、工具设置及组织制备流程；包含胰蛋白酶消化步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：解剖操作及小鼠口腔角质形成细胞分离的总体流程。（A）小鼠口腔的示意图。（B）用于解剖腭部并分离小鼠口腔角质形成细胞的器械。（C）小鼠腭部的明场图像。比例尺：100 µm。（D）实验方案概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养随时间的生长示意图，从3天至2周，传代1至3次；成纤维细胞污染。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2小鼠口腔角质形成细胞成功分离的代表性结果 (A-G) 培养的原代口腔角质细胞在第3天的时间过程图像（A），第5天（B），1 周（C），以及2周（D) 培养后形态。小鼠口腔角质形成细胞在初次分离后（E），第二（F），以及第三（G) 代表示意。H) 小鼠口腔角质形成细胞培养中成纤维细胞污染的示例。比例尺： 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养中角蛋白和整联蛋白表达的荧光显微镜图像；可见Hoechst染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：分离的小鼠口腔角质形成细胞表达基底细胞标志物。（A-B）第4代细胞中K14（A；红色）和α6-整联蛋白（B；绿色）免疫荧光染色的代表性图像。（C-E）第4代（C）、第7代（D）和高钙处理（E）条件下第4代细胞中p63（绿色）免疫荧光染色的代表性图像。（F-H）第4代（F）、第7代（G）和高钙处理（H）条件下K13（绿色）免疫染色图像。（I-L）第4代（I）、第7代（J）、高钙处理（K）以及MEFs（L）中PDGFRα（红色）免疫染色图像。细胞核经Hoechst染色（蓝色）。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案描述了从小鼠成年腭部分离和培养口腔角质形成细胞的方法。同时报道了一种使用免疫染色进行评估的方法。

多年来，大多数涉及角质形成细胞的研究都是使用人和小鼠皮肤表皮角质形成细胞进行的。近年来，口腔角质形成细胞已……

近年来，口腔角质形成细胞因其独特的特性而受到关注。本文提供了一种在类似干细胞状态下培养小鼠口腔角质形成细胞的实验方案，适用于后续应用。小鼠口腔角质形成细胞的培养及其与皮肤角质形成细胞的不同特征。在本实验方案中，我们成功分离了原代小鼠口腔角质形成细胞，并建立了一种长期培养技术。该培养体系可用于分子和生化检测，以进一步了解口腔基底层干细胞的特性及其相关疾病。处死一只成年 C57BLK6J 小鼠后，使用剃刀去除口周毛发，并用剪刀从两侧颊部向颌部剪开。接下来，使用镊子将口腔充分张开，并用棉签吸去血液，然后用含有10%聚维酮碘的棉签擦拭口腔内侧，对腭部进行消毒。为获取小鼠腭部组织，首先使用外科手术刀片沿上颌牙齿的腭侧做全层边缘切口，然后使用刮匙小心地分离整个腭部组织。迅速将腭部组织转移至含有4毫升添加了抗生素和抗真菌剂的完全培养基的15毫升离心管中。将组织置于冰上保存，直至准备进行孵育。在超净工作台内，将组织转移至含有4毫升添加了抗生素和抗真菌剂的完全培养基的60毫米培养皿中。然后使用短柄钝头镊子和手术刀片，轻轻去除组织上的血液，并用完全培养基将组织洗涤10次。最后一次洗涤后，将组织转移至一个35毫米的培养皿中，内含4毫升添加了抗生素和抗真菌剂的0.025%胰蛋白酶溶液。将组织的上皮面朝下放置，在室温下的培养罩中孵育16小时。经胰蛋白酶过夜消化后，使用一对钝头镊子将组织从胰蛋白酶溶液中取出，并转移至含有胰蛋白酶抑制剂溶液的60毫米培养皿中，使上皮面朝上。接着，用镊子夹住刮刀边缘，用手术刀片轻轻刮除上皮层与下方固有层之间的连接。为从组织中收集尽可能多的上皮细胞，将组织转移至另一含有4毫升完全培养基的60毫米培养皿中，并重复如前所述的刮取操作。接下来，将一个无菌的100微米细胞筛置于50毫升锥形管上方。使用无菌移液器，将2毫升胰蛋白酶溶液转移至筛网上，以润湿其表面。然后用移液器将60毫米培养皿中的细胞悬液反复吹打混匀，并通过100微米细胞筛过滤细胞。为了计数细胞数量，取15微升细胞悬液加入50微升台盼蓝溶液中，然后将10微升细胞与台盼蓝的混合液转移至血细胞计数板，进行细胞计数。接着，将细胞悬液离心，弃去上清液，并向管中加入2毫升含Chelex处理胎牛血清的完全培养基。使用5毫升移液器反复吹打数次，重悬细胞沉淀。然后将一只小鼠的 2 × 10⁵ 至 5 × 10⁵ 个细胞接种到预先包被 I 型胶原的 24 孔板的单个孔中，在 37°C 下培养 2 天，期间不更换培养基。原代口腔角质形成细胞以单层形式生长，呈现铺路石样形态。接种后第 3 天和第 5 天可见小型角质形成细胞克隆集落。培养一周后，这些克隆体积增大，形成致密的克隆。首次传代在初次接种后两周进行；后续传代时，角质形成细胞表现出稳定的生长特性，且培养周期较短。若在分离过程中出现明显的成纤维细胞污染，角质形成细胞的生长将停止。培养后，角质形成细胞表达角蛋白14和α6-整合素。早期和晚期传代细胞均一表达P63，证实其具有干细胞特性。然而，经高钙处理的角质形成细胞P63表达降低，表明高钙处理可抑制干细胞相关基因的表达。分化标志物角蛋白13在早期和晚期传代细胞中表达极少或不表达，但在高钙处理条件下表达显著。成纤维细胞标志物PDGFRα在角质形成细胞培养物中未见表达，表明本方案能够成功分离基底角质形成细胞并维持其未分化状态。捕获应从硬膜外侧开始，每个组织样本耗时10分钟。此外，通常情况下，细胞的移液操作对于提高细胞存活率至关重要。经过两到三次传代后，口腔角质形成细胞即可稳定，适用于后续的功能实验。重要的是，本方案可与转基因小鼠模型结合，用于体外的细胞和分子检测。近期研究报道了口腔基底干细胞的动态特性及其异质性。该方法将促进对口腔干细胞生物学的研究，并有助于更深入理解口腔疾病。

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科研

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Biology

生物学

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