Name: 用于荧光标记大促卵体定量的自动成像和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习使用自动化荧光显微镜成像技术定量分析大胞饮作用，该方法采用96孔板高通量格式，可提升实验重现性并减少变异，适用于癌症代谢与细胞生物学研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助（R01CA207189，R21CA243701）支持，授予C.C.。KMO.G. 获得了加州烟草相关疾病研究计划博士后奖学金（T30FT0952）资助。BioTek Cytation 5 属于桑福德-伯纳姆-普雷比斯细胞成像中心的一部分，该中心获得了国家癌症研究所癌症中心支持基金（P30 CA030199）的财政支持。图1-3使用BioRender绘制。

<ol><li>Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+different+cell+types%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences.</a> Membranes. 10 (8), 21(2020).</li>
<li>Recouvreux, M. V., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+a+metabolic+adaptation+to+nutrient+stress+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li>
<li>Zhang, Y. J., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer%3A+a+complex+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network.</a> Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+deficiency+and+AMPK+activation+promote+nutrient+scavenging+and+anabolism+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells.</a> Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).</li>
<li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li>
<li>Kamphorst, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+cancer+tumors+are+nutrient+poor+and+tumor+cells+actively+scavenge+extracellular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein.</a> Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).</li>
<li>Olivares, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-derived+proline+promotes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cell+survival+under+nutrient+limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Seguin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%2C+a+druggable+vulnerability+for+KRAS-addicted+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).</li>
<li>Redelman-Sidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Wnt+pathway+drives+macropinocytosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer.</a> Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).</li>
<li>Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+canonical+pathway+activates+macropinocytosis+and+lysosomal+degradation+of+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).</li>
<li>Schmees, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+the+PDGF+beta-receptor+promotes+fibroblast+transformation+by+H-RasG12V%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).</li>
<li>Lee, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).</li>
<li>Recouvreux, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+depletion+regulates+Slug+to+promote+EMT+and+metastasis+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2%2FARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+escape+autophagy+inhibition+via+NRF2-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis.</a> Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).</li>
<li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBar-Sagi%2C+D+%22Science%22">Science</a>. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).</li>
<li>Mishra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+epigenetic+alterations+drive+metabolic+and+neuroendocrine+prostate+cancer+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).</li>
<li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li>
<li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).</li>
<li>Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinosome+quantitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Macropinosome quantitation assay.</a> MethodsX. 1, 36-41 (2014).</li>
<li>Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).</li>
<li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).</li>
</ol>

C.C. 是一项已授权专利的发明人，该专利名为“与巨胞饮作用相关的癌症诊断、治疗及药物发现”，专利号：9,983,194。

实验质量和数据采集结果在很大程度上取决于试剂的质量、仪器参数的优化以及盖玻片和微孔板的清洁程度。最终结果应在重复样本之间表现出尽可能小的差异；然而，生物学变异可能自然发生，或由多种因素引起。细胞密度可能影响细胞对大胞饮诱导剂或抑制剂的反应程度。因此，严格遵循本方案中建议的80%汇合度至关重要。此外，微孔板制造商已有明确说明，在96孔微孔板中会发生培养基蒸发现象。其中，边缘孔的蒸发程度高于中心孔，从而可能影响大胞饮作用。因此，可选择不在分析中纳入边缘孔，而将这些孔中加入PBS，形成“缓冲屏障”，以减少中心孔的过度蒸发。
强烈建议对每种条件下的图像进行目视检查，以确定图像采集是否成功完成。可在采集第一组条件时即进行此项检查，以确认所用设置是否正确，并在必要时及时干预。可能出现的具体问题包括：图像过曝（图7A）、图像失焦（图7B）、图像中出现荧光葡聚糖斑块（图7C）或残留物（<strong class="xfi...

巨胞饮作用作为一种非特异性的内吞途径，可使细胞通过大量摄取细胞外液体及其成分，内化多种细胞外物质，包括营养物质、蛋白质、抗原和病原体1。尽管该过程在多种细胞类型的生物学中具有重要作用，但越来越多的研究表明，巨胞饮通路在肿瘤生物学中也发挥着关键作用：肿瘤细胞可通过巨胞饮摄取，在营养匮乏的微环境中维持存活并增殖2,3。通过摄取细胞外大分子物质（如白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片，可在巨胞饮体与溶酶体融合介导的货物降解过程中生成氨基酸、糖类、脂质和核苷酸，从而为生物大分子合成提供替代性营养来源4,5,6,7,8。
巨胞饮作用的诱导与调控机制十分复杂，且可能因细胞环境的不同而有所差异。迄今为止，已鉴定出多种巨胞饮作用的诱导剂，包括表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和Wnt3A等配体9,10,11,12,13此外，模拟肿瘤微环境的培养条件可触发该通路的活化。胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤处于营养匮乏状态，尤其缺乏氨基酸谷氨酰胺，这使得癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）均依赖巨胞饮作用以维持生存。7,13,14,15此外，肿瘤微环境中的应激因素（如缺氧和氧化应激）可激活这一清除通路16除了多种可诱导大胞饮作用的外在影响因素外，还有多种细胞内信号通路调控大胞饮体的形成。致癌性Ras介导的转化足以启动大胞饮机制，且多种癌症类型均表现出由致癌性Ras驱动的组成性大胞饮作用4,5,9,17或者，已发现野生型Ras激活以及Ras非依赖性通路可在癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）中激活巨胞饮作用10,11,15,18. 各种方法的使用 体外 结合抑制剂处理的模型已鉴定出多个巨胞饮调节因子，包括钠氢交换体、小GTP酶Rac1、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p21活化激酶（Pak）以及AMP活化蛋白激酶（AMPK）。4,13,15然而，鉴于目前已知的调控巨胞饮作用的因素和条件众多，很可能仍有许多调节因子和刺激信号尚未被发现。通过在单次实验中自动化评估多种条件，有助于发现新的调节因子和刺激物。该方法可揭示参与巨胞饮体形成的相关因素，并可能促进靶向此通路的新型小分子或生物制剂的发现。
此处，我们改进了先前建立的用于测定癌细胞中巨胞饮作用程度的实验方案 体外 96孔微孔板格式以及自动化成像与定量分析19,20该方案基于荧光显微镜技术，该技术已成为确定巨胞饮作用领域的标准方法。 体外 和 体内4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22巨胞饮体可通过其内化大分子物质的能力与其他内吞途径相区分，例如可内化高分子量的葡聚糖（如70 kDa）。2,3,4,20,21,22,23因此，可通过细胞对外源性荧光标记的70 kDa葡聚糖的摄取来定义巨胞饮体。结果表明，巨胞饮囊泡表现为细胞内荧光斑点的聚集，其大小范围为0.2-5 µm这些斑点可通过显微成像并进一步定量，以确定细胞中巨胞饮作用的程度——即“巨胞饮指数”。
本方案中观察贴壁细胞内巨胞饮泡的关键步骤 体外 使用标准实验室设备在96孔微孔板和盖玻片上进行的操作步骤 (图1)此外，本文提供了使用细胞成像多功能酶标仪自动进行图像采集及大胞饮指数定量的操作步骤。相较于我们此前描述的实验方案，该自动化方法可显著节省时间、降低成本并减少操作工作量。19,20此外，该方法可避免成像采集与分析过程中无意引入的偏差，从而提高实验的可重复性与可靠性。该方法可轻松适用于不同细胞类型或酶标仪，也可用于测定巨胞饮体的其他特征参数，如大小、数量和位置。本文所述方法特别适用于筛选诱导巨胞饮作用的细胞培养条件、鉴定新型调控因子，或优化已知抑制剂的药物浓度。
<img alt="荧光标记葡聚糖摄取示意图，包含24孔板、96孔板格式及成像过程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62828/62828fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：测定贴壁细胞“大胞饮指数”的自动化检测示意图。 使用 BioRender 制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62828/62828fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>25053CI</td><td>HBSS 中含 0.1% EDTA，不含钙、镁和碳酸氢钠</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>2 L 烧杯</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-33</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>25 mL 试剂储液槽</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>28-121</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 烧杯</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 组织培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>CELLSTAR</td></tr><tr><td>8 通道吸液适配器</td><td>Integra Biosciences</td><td>155503</td><td></td></tr><tr><td>适用于标准吸头的 8 通道吸液适配器</td><td>Integra Biosciences</td><td>159024</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>4355226</td><td></td></tr><tr><td>无氨玻璃清洁剂</td><td>Sparkle</td><td>FUN20500CT</td><td></td></tr><tr><td>黑色 96 孔高内涵筛选微孔板</td><td>PerkinElmer</td><td>6055300</td><td>CellCarrier-96 Ultra</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td>直径 12 mm</td></tr><tr><td>Cytation 5 细胞成像多功能读板仪</td><td>Biotek</td><td>CYT5FW</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore Sigma</td><td>5.08741</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa 右旋糖酐-FITC</td><td>Life Technologies</td><td>D1822</td><td>可被赖氨酸交联固定</td></tr><tr><td>70 kDa 右旋糖酐-TMR</td><td>Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1435</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td>不含钙和镁</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>甲醛，37%</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-250A</td><td>ACS 试剂级</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>硬化型荧光封片介质</td><td>Agilent Tech</td><td>S302380-2</td><td>DAKO</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Millipore Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-212</td><td>经认证的 ACS Plus，36.5%&amp;ndash;38.0%</td></tr><tr><td>无尘擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-1</td><td>优质普通玻璃</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10013</td><td>8 通道，0.5&amp;ndash;10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10012&amp;nbsp;</td><td>12 通道，20&amp;ndash;200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td>8 通道，20&amp;ndash;200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Pechiney</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>塑料保鲜膜</td><td>Kirkland Signature</td><td>208733</td><td>Stretch-Tite</td></tr><tr><td>硅胶隔离器</td><td>Grace Bio Labs Inc</td><td>664107</td><td>内径 13 mm × 深度 0.8 mm，25 mm × 25 mm</td></tr><tr><td>载玻片适配器</td><td>Biotek</td><td>1220548</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0340922C</td><td></td></tr></tbody></table>

用于荧光标记巨胞饮体定量的自动化成像与分析

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

巨胞饮作用是一种非特异性的液相内吞途径，可使细胞通过大量内吞作用摄取大分子胞外物质，例如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在多种细胞过程中发挥关键作用，包括免疫应答调控和癌细胞代谢。鉴于其在生物学功能中的重要性，研究细胞培养条件可为识别该途径的调控因子以及优化条件以用于发现新型治疗策略提供有价值的信息。本研究描述了一种利用常规实验设备和细胞成像多功能酶标仪的自动化成像与分析技术，用于快速定量贴壁细胞的巨胞饮指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以便在单次实验中评估多种条件，也可用于固定后置于玻璃盖玻片上的样品。该方法旨在最大限度提高可重复性、减少实验变异，同时兼具省时和经济高效的特点。

若严格按照上述方案的步骤和调整进行操作，最终的实验结果应能提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或抑制目标细胞系巨胞饮作用的信息。为了增强这些发现的可靠性，设置对照条件有助于对结果进行严格评估，以确定实验是否成功完成。巨胞饮诱导对照可提供关于巨胞饮相对水平的信息。为此，最常用的配体是表皮生长因子（EGF）13。在AsPC-1胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中，在加入葡聚糖前添加100 ng/mL EGF处理5分钟，可激活巨胞饮作用（图5A）。此外，通过将细胞在无谷氨酰胺培养基中培养16–24小时，可诱导自分泌EGF介导的巨胞饮激活（图5A）。根据细胞类型和现有文献，也可采用其他诱导剂，例如PDGF或Wnt3A10,11,12。并非所有细胞的行为都相同，携带KRAS突变...

采用多孔微孔板的自动化检测方法具有显著优势，可通过单次实验评估多种条件，从而有效鉴定信号通路调控因子。本文中，我们将已建立的大胞饮囊泡成像与定量检测方案优化为适用于96孔微孔板的格式，并提供了利用多功能酶标仪进行自动化操作的全面流程说明。

大胞饮作用是一种非特异性的液相摄取途径，可使细胞内化大量细胞外物质，例如蛋白质、病原体和……

巨胞饮作用是一种内吞途径，在多种细胞过程中发挥重要作用，包括癌症代谢。本方案可定量检测体外培养细胞中巨胞饮作用的程度。该自动化流程旨在最大限度地提高实验的可重复性、生产效率，并减少实验变异。此外，荧光显微镜可让您直观检查样品，以评估实验质量并分析巨胞饮小泡的其他特征。与我共同演示该实验步骤的是我实验室的研究助理 Cheska Marie Galapate。对于置于24孔板中的盖玻片样品，需使用镊子从乙醇浴中夹取单个盖玻片。轻敲盖玻片内壁以去除多余乙醇，并将盖玻片平放于孔底部。待乙醇挥发后，用DPBS洗涤盖玻片两次，然后通过向每孔加入500 µL细胞悬液，将细胞接种于盖玻片表面。将细胞置于37°C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养，直至大胞饮标记前一天细胞融合度达到60%至80%。在进行巨胞饮体标记的前一天，将孔板中的培养基更换为500微升预热的无血清培养基，并将细胞置于培养箱中孵育16至24小时。对于96孔微孔板格式，首先将细胞悬液转移至25毫升试剂储液槽中，然后使用多通道移液器将100微升细胞悬液接种至每孔，接种于底部为光学透明环烯烃或玻璃材质的黑色96孔高内涵筛选微孔板中。在进行巨胞饮体标记前一天，将细胞培养至细胞融合度达到60%至80%。巨胞饮体标记前一天，使用连接真空泵的多通道吸液接头（适配标准吸头）从每个孔中移除并弃去培养基。也可使用多通道移液器完成此步骤。使用试剂储液槽和多通道移液器，向每个孔中轻柔加入 100 微升预热的无血清培养基，然后将细胞放入细胞培养箱中孵育 16 至 24 小时。对于含盖玻片的 24 孔板，将孔中的培养基更换为 200 微升含有荧光标记的高分子量葡聚糖的无血清培养基，并将细胞放入细胞培养箱中孵育 30 分钟。孵育结束后，吸除培养基，并使用预冷的冲洗瓶，用冰上预冷的 PBS 轻柔而迅速地洗涤细胞 5 次。洗涤过程中用手用力振荡培养板，以帮助去除粘附在盖玻片上的葡聚糖聚集体。接着，加入 350 µL 的 3.7% 多聚甲醛固定细胞，孵育 20 分钟，然后吸除固定液，并用 PBS 洗涤细胞两次。用 350 µL 含 DAPI 的 PBS 溶液对细胞核进行染色。孵育20分钟后，吸除DAPI溶液，并用PBS洗涤细胞三次。将硅胶隔离器并排粘附在显微镜载玻片上，以获得均匀的间距和成像自动化所需的盖玻片可重复定位。然后针对每个盖玻片，在隔离器的开放区域内，于载玻片上滴加一滴硬性荧光封片介质。用镊子夹取盖玻片，并通过将盖玻片边缘轻轻在无绒擦拭纸上轻触以去除多余的 PBS。接着，将盖玻片倒置在封片剂液滴上，用闭合的镊子轻轻敲击盖玻片以排除封片剂中的气泡。将载玻片置于避光环境中，并在室温下静置，使封片剂干燥，通常需要 16 至 24 小时。成像前，从显微镜载玻片上移除防震垫。待载玻片平衡至室温后，使用浸有无氨玻璃清洁剂的棉签擦拭盖玻片。随后，使用浸有70%乙醇的洁净棉签清洁盖玻片，并使其自然晾干。对于96孔微孔板，按照前述方法吸除各孔中的液体后，向各孔中加入40 µL无血清培养基，并加入荧光标记的高分子量葡聚糖，然后将细胞置于细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，通过手动将微孔板倒置甩动，将孔内液体弃入一个空的5 L烧杯中；随后将微孔板以轻微倾斜的角度垂直缓慢浸入盛有冰冷PBS的2 L烧杯中，清洗细胞和微孔板两次，每次清洗后均通过倒置甩动的方式将微孔板中的PBS弃入5 L烧杯中。最后一次PBS清洗后，使用25 mL试剂储液槽和多通道移液器，向每孔加入100 µL含3.7%甲醛的PBS溶液，以固定细胞。室温孵育20分钟后，去除固定液，使用浸入和轻弹的方法用PBS洗涤细胞。第二次PBS洗涤后，每孔加入100 µL含DAPI的PBS溶液对细胞核进行染色。20分钟后，如前所述，用预冷的PBS冲洗细胞三次。将微孔板倒置轻敲在无绒布上，以去除残留的 PBS。然后使用 25 毫升试剂储液槽和多通道移液器，向每孔加入 100 微升新鲜 PBS。成像前，让微孔板平衡至室温，再用无绒布将细胞培养板擦拭干燥。或者，将培养板覆盖后避光保存于4°C，可保存长达一周。对于自动化的巨胞饮泡成像，需创建自动化程序，使用40倍空气物镜，在葡聚糖荧光染料和DAPI的波长通道采集图像。接下来，利用预计巨胞饮活性最高的样本优化曝光参数，以避免过度曝光，过度曝光可能导致信号饱和并丢失强度数据。使用能够快速且稳定地定位样本的对焦设置，以获得高质量的图像。在每个孔或盖玻片上采集多张图像，以涵盖样本的变异性并准确反映样本的真实情况。为计算大胞饮指数，需通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）对DAPI图像及其对应的葡聚糖图像进行背景扣除。调整参数设置，使背景噪声最小化，同时对 DAPI 和葡聚糖信号的减除效应尽可能小或无影响。接着，利用葡聚糖信号较强的视野，确定用于选择细胞核的强度信号设置（通常称为阈值函数），然后确定仅选择巨胞饮小泡所需的最低强度信号设置。对于葡聚糖图像，计算在所创建的巨胞饮小泡选区内总的荧光强度，或使用该选区确定葡聚糖阳性区域的总面积。对于 DAPI 图像，使用选区确定图像中细胞核的数量，以反映存在的细胞数量。然后通过将葡聚糖荧光总量或面积除以 DAPI 确定的细胞数量，计算大胞饮指数。在 AsPC-1 PDAK 细胞中，在加入葡聚糖前，添加 100 纳克/毫升 EGF 并作用 5 分钟，可激活大胞饮作用。此外，通过剥夺谷氨酰胺16至24小时可诱导自分泌EGF激活巨胞饮作用。MIA PaCa-2细胞表现出组成型巨胞饮活性，该活性可被75微摩尔EIPA处理30分钟或10微摩尔EHop-016处理2小时所抑制。在剂量反应实验中，随着EHop-016和EIPA药物浓度的升高，巨胞饮指数逐渐降低，从而证实了组成型Rac1依赖性巨胞饮作用的存在。您可以调整本实验方案，以评估其他荧光标记的物质（如白蛋白）的巨胞饮作用。此外，建议通过细胞活力检测来评估白蛋白的巨胞饮摄取是否影响细胞适应性。该技术在鉴定癌细胞和基质细胞中巨胞饮营养供应方面发挥了关键作用，而自动化操作显著提高了我们进行条件测试的能力。

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生物学

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