用于荧光标记巨胞饮体定量的自动化成像与分析

巨胞饮作用是一种内吞途径，在多种细胞过程中发挥重要作用，包括癌症代谢。本方案可定量检测体外培养细胞中巨胞饮作用的程度。该自动化流程旨在最大限度地提高实验的可重复性、生产效率，并减少实验变异。

此外，荧光显微镜可让您直观检查样品，以评估实验质量并分析巨胞饮小泡的其他特征。与我共同演示该实验步骤的是我实验室的研究助理 Cheska Marie Galapate。对于置于24孔板中的盖玻片样品，需使用镊子从乙醇浴中夹取单个盖玻片。

轻敲盖玻片内壁以去除多余乙醇，并将盖玻片平放于孔底部。待乙醇挥发后，用DPBS洗涤盖玻片两次，然后通过向每孔加入500 µL细胞悬液，将细胞接种于盖玻片表面。将细胞置于37°C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养，直至大胞饮标记前一天细胞融合度达到60%至80%。

在进行巨胞饮体标记的前一天，将孔板中的培养基更换为500微升预热的无血清培养基，并将细胞置于培养箱中孵育16至24小时。对于96孔微孔板格式，首先将细胞悬液转移至25毫升试剂储液槽中，然后使用多通道移液器将100微升细胞悬液接种至每孔，接种于底部为光学透明环烯烃或玻璃材质的黑色96孔高内涵筛选微孔板中。

在进行巨胞饮体标记前一天，将细胞培养至细胞融合度达到60%至80%。巨胞饮体标记前一天，使用连接真空泵的多通道吸液接头（适配标准吸头）从每个孔中移除并弃去培养基。也可使用多通道移液器完成此步骤。

使用试剂储液槽和多通道移液器，向每个孔中轻柔加入 100 微升预热的无血清培养基，然后将细胞放入细胞培养箱中孵育 16 至 24 小时。对于含盖玻片的 24 孔板，将孔中的培养基更换为 200 微升含有荧光标记的高分子量葡聚糖的无血清培养基，并将细胞放入细胞培养箱中孵育 30 分钟。孵育结束后，吸除培养基，并使用预冷的冲洗瓶，用冰上预冷的 PBS 轻柔而迅速地洗涤细胞 5 次。

洗涤过程中用手用力振荡培养板，以帮助去除粘附在盖玻片上的葡聚糖聚集体。接着，加入 350 µL 的 3.7% 多聚甲醛固定细胞，孵育 20 分钟，然后吸除固定液，并用 PBS 洗涤细胞两次。用 350 µL 含 DAPI 的 PBS 溶液对细胞核进行染色。

孵育20分钟后，吸除DAPI溶液，并用PBS洗涤细胞三次。将硅胶隔离器并排粘附在显微镜载玻片上，以获得均匀的间距和成像自动化所需的盖玻片可重复定位。然后针对每个盖玻片，在隔离器的开放区域内，于载玻片上滴加一滴硬性荧光封片介质。

用镊子夹取盖玻片，并通过将盖玻片边缘轻轻在无绒擦拭纸上轻触以去除多余的 PBS。接着，将盖玻片倒置在封片剂液滴上，用闭合的镊子轻轻敲击盖玻片以排除封片剂中的气泡。将载玻片置于避光环境中，并在室温下静置，使封片剂干燥，通常需要 16 至 24 小时。

成像前，从显微镜载玻片上移除防震垫。待载玻片平衡至室温后，使用浸有无氨玻璃清洁剂的棉签擦拭盖玻片。随后，使用浸有70%乙醇的洁净棉签清洁盖玻片，并使其自然晾干。

对于96孔微孔板，按照前述方法吸除各孔中的液体后，向各孔中加入40 µL无血清培养基，并加入荧光标记的高分子量葡聚糖，然后将细胞置于细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，通过手动将微孔板倒置甩动，将孔内液体弃入一个空的5 L烧杯中；随后将微孔板以轻微倾斜的角度垂直缓慢浸入盛有冰冷PBS的2 L烧杯中，清洗细胞和微孔板两次，每次清洗后均通过倒置甩动的方式将微孔板中的PBS弃入5 L烧杯中。最后一次PBS清洗后，使用25 mL试剂储液槽和多通道移液器，向每孔加入100 µL含3.7%甲醛的PBS溶液，以固定细胞。

室温孵育20分钟后，去除固定液，使用浸入和轻弹的方法用PBS洗涤细胞。第二次PBS洗涤后，每孔加入100 µL含DAPI的PBS溶液对细胞核进行染色。20分钟后，如前所述，用预冷的PBS冲洗细胞三次。

将微孔板倒置轻敲在无绒布上，以去除残留的 PBS。然后使用 25 毫升试剂储液槽和多通道移液器，向每孔加入 100 微升新鲜 PBS。成像前，让微孔板平衡至室温，再用无绒布将细胞培养板擦拭干燥。

或者，将培养板覆盖后避光保存于4°C，可保存长达一周。对于自动化的巨胞饮泡成像，需创建自动化程序，使用40倍空气物镜，在葡聚糖荧光染料和DAPI的波长通道采集图像。接下来，利用预计巨胞饮活性最高的样本优化曝光参数，以避免过度曝光，过度曝光可能导致信号饱和并丢失强度数据。

使用能够快速且稳定地定位样本的对焦设置，以获得高质量的图像。在每个孔或盖玻片上采集多张图像，以涵盖样本的变异性并准确反映样本的真实情况。为计算大胞饮指数，需通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）对DAPI图像及其对应的葡聚糖图像进行背景扣除。

调整参数设置，使背景噪声最小化，同时对 DAPI 和葡聚糖信号的减除效应尽可能小或无影响。接着，利用葡聚糖信号较强的视野，确定用于选择细胞核的强度信号设置（通常称为阈值函数），然后确定仅选择巨胞饮小泡所需的最低强度信号设置。对于葡聚糖图像，计算在所创建的巨胞饮小泡选区内总的荧光强度，或使用该选区确定葡聚糖阳性区域的总面积。

对于 DAPI 图像，使用选区确定图像中细胞核的数量，以反映存在的细胞数量。然后通过将葡聚糖荧光总量或面积除以 DAPI 确定的细胞数量，计算大胞饮指数。在 AsPC-1 PDAK 细胞中，在加入葡聚糖前，添加 100 纳克/毫升 EGF 并作用 5 分钟，可激活大胞饮作用。

此外，通过剥夺谷氨酰胺16至24小时可诱导自分泌EGF激活巨胞饮作用。MIA PaCa-2细胞表现出组成型巨胞饮活性，该活性可被75微摩尔EIPA处理30分钟或10微摩尔EHop-016处理2小时所抑制。在剂量反应实验中，随着EHop-016和EIPA药物浓度的升高，巨胞饮指数逐渐降低，从而证实了组成型Rac1依赖性巨胞饮作用的存在。

您可以调整本实验方案，以评估其他荧光标记的物质（如白蛋白）的巨胞饮作用。此外，建议通过细胞活力检测来评估白蛋白的巨胞饮摄取是否影响细胞适应性。该技术在鉴定癌细胞和基质细胞中巨胞饮营养供应方面发挥了关键作用，而自动化操作显著提高了我们进行条件测试的能力。