使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV）2载体的工艺开发
2022年1月13日
在该协议中，通过将 Spodoptera frugiperda（Sf9） 昆虫细胞与杆状病毒（BV）-AAV2-绿色荧光蛋白（GFP）或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap感染的Sf9细胞在悬浮培养物中共同培养来产生AAV2载体。使用洗涤剂从细胞中释放AAV颗粒，澄清，通过亲和柱色谱纯化，并通过切向流过滤浓缩。
该协议对于想要使用杆状病毒 - 昆虫细胞培养系统开发AAV生产和纯化方法的研究人员非常有用。使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产AAV是一种具有成本效益的方法，易于放大，并且与当前的良好生产规范兼容。该协议的某些部分将由我实验室的研究助理Alan Heizer演示。
首先解冻一小瓶Sf9细胞，并立即将它们接种在15毫升昆虫细胞培养基中。在轨道振荡器培养箱中以125 RPM和28摄氏度在圆底烧瓶中以松散的盖子培养Sf9细胞，用于交换空气。在含有200毫升培养基的一升烧瓶中繁殖细胞，以获得足够的细胞用于TIPS细胞生产。
在两个烧瓶中，以2倍10向每毫升第6个功率电池添加50毫升Sf9细胞。用0.5毫升杆状病毒-AAV2-GFP感染一个Sf9细胞瓶，用0.5毫升杆状病毒-AAV2-rep-cap感染另一个烧瓶细胞。三天后，收获一小块等分试样的杆状病毒感染的Sf9细胞，也称为TIPS细胞。
用0.5微克小鼠抗杆状病毒gp64抗体在100微升封闭缓冲液中在100微升封闭缓冲液中在黑暗的环境温度下染色2次10至5次方的未感染和杆状病毒感染的Sf9细胞。用PBS洗涤细胞以除去抗体后，将染色的细胞重新悬浮在含有0.5牛血清白蛋白的300微升PBS中。使用流式细胞术分析细胞上的杆状病毒gp64表达。
当细胞存活80%至90%时，随着直径的增加，收获细胞并在一毫升昆虫培养基中冷冻保存1倍10至7个功率细胞，在负80摄氏度的慢速冷冻容器中用10%胎牛血清和10%二甲基亚砜代替。第二天，将含有TIPS细胞的管转移到液氮冰箱中长期储存。在含有400毫升昆虫细胞培养基的两升烧瓶中，在腺相关病毒或AAV生产所需的振荡器培养箱中，以2倍10至每毫升28摄氏度培养至第6个功率电池，培养并培养幼稚的Sf9细胞。
三到四天后，细胞密度增加到每毫升10到第6次方电池的5至6倍。对于在轨道振荡器培养箱中的烧瓶中生产AAV，请使用移液器或蠕动泵以每毫升10至第6个功率细胞的2倍将400毫升Sf9培养物无菌地接种到两升烧瓶中。将轨道振动器设置为125 RPM和28摄氏度。
解冻每个杆状病毒-AAV-GFP和杆状病毒-AAV-rep-cap TIPS细胞的一小瓶。用20毫升昆虫培养基稀释细胞，并使用台盼蓝对细胞进行活力计数。相对于在摇瓶或生物反应器中培养的幼稚Sf9细胞，以1比10， 000的比例接种两个TIPS细胞。
第二天，无菌收获一毫升Sf9培养物，并用台盼蓝染料染色，以分析细胞计数，活力和形态。在第三天，重复第二天执行的步骤，并在染色Sf9细胞后检查杆状病毒感染的状态。在第五天，重复第二天执行的步骤，然后在Sf9活力降至50%左右时收获培养基和细胞旋转后收集上清液和细胞沉淀，并将其储存在负80摄氏度。
一旦AAV生产者细胞沉淀解冻，加入细胞裂解缓冲液并剧烈混合。在环境温度下孵育重新悬浮的沉淀30分钟以释放AAV颗粒。离心后，将细胞裂解物转移到新容器中。
解冻后混合细胞裂解物和细胞培养物上清液。向细胞裂解物中每毫升20单位的核酸酶和10毫摩尔氯化镁以消化DNA和RNA，并在37摄氏度下孵育2至4小时。使用泵通过0.8微米和0.2微米聚醚砜双过滤系统过滤裂解物。
将澄清的细胞裂解物储存在四摄氏度下过夜，或立即纯化AAV。将10毫升AVB Sepharose柱安装到色谱机上，并将管道插入AAV样品，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中。将管插入色谱机的馏分收集槽中，以收集含有AAV颗粒的柱直通溶液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的馏分。
以每分钟5毫升的流速将AVB Sepharose柱与五列体积的PBS平衡。使用配备样品泵的色谱机将含有AAV颗粒的过滤细胞裂解物加载到AVB Sepharose亲和柱上。以每分钟3毫升的流速运行样品。
以每分钟3毫升的流速运行PBS，直到280纳米处的紫外线吸光度曲线返回基线并变得稳定。用50毫摩尔柠檬酸钠缓冲液pH 3以每分钟3毫升的流速洗脱AVB Sepharose柱中的AAV颗粒。立即用五分之一体积的500毫摩尔Tris HCl pH 8.0稀释AAV上清液，以中和含有AAV的酸性洗脱缓冲液。
这可以防止酸性pH 3.0洗脱缓冲液可能发生的pH介导的降解。然后用PBS将AAV上清液稀释十倍，使AAV颗粒在生理缓冲液中。储存每列跑过样品的一毫升，洗涤缓冲液和100微升洗脱的AAV上清液，以评估靶细胞感染引起的AAV的存在。
设置切向流过滤系统，配备具有100千道尔顿分子量截止值的聚醚砜膜盒以浓缩AAV。运行200毫升PBS10分钟，以平衡切向流过滤模块。通过控制泵的流量来加载AAV样品，直到样品减少到所需的体积。
用100毫升PBS透析滞留物。将AAV样品浓缩至所需体积后，收集AAV样品，通过0.2微米聚醚砜过滤器过滤，并等分。然后将AAV样品储存在负80摄氏度。
由于多轮感染，大多数Sf9细胞在三到四天内感染杆状病毒，杆状病毒糖蛋白gp64表达证明。大多数细胞也显示出直径的增加。细胞的直径增加，细胞病变效应，大约一半的细胞在感染后五天内死亡，这是AAV生产完成的迹象。
在用对应于AAV级分的酸性缓冲液洗脱时观察到蛋白质的峰值。纯化的AAV样品在SDS-PAGE和银染色后显示出三种不同的衣壳蛋白:VP1，VP2和VP3。最关键的步骤是在冷冻保存之前收获TIPS细胞，当大多数细胞感染杆状病毒时，细胞死亡次数最少。
我们在这里描述了血清型2的AAV载体的生产和纯化作为模型。然而，该协议也可以应用于其他AAV血清型。
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概述
本协议介绍了一种使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV2）的方法。该技术采用玉米青螟（Sf9）细胞，旨在具有成本效益和可扩展性，兼容良好制造规范。
关键研究组成部分
研究领域
- 病毒学
- 基因治疗
- 细胞培养技术
背景
- AAV是基因治疗中常用的病毒载体。
- 杆状病毒-昆虫细胞系统在大规模生产中具有优势。
- 高效的纯化方法对于治疗应用至关重要。
使用的方法
- 与杆状病毒共培养Sf9细胞以生产AAV。
- 基于洗涤剂的裂解和亲和纯化技术。
- 流式细胞术用于评估细胞活力和杆状病毒表达。
主要结果
- 成功生产了AAV2颗粒。
- 在整个过程中维持了Sf9细胞的高活力。
- 方法展示了可重复性和易于扩大规模的特点。
结论
- 该研究建立了一种适用于研究和治疗应用的AAV生产的稳定方法。
- 该系统增强了AAV在基因研究和治疗中的可行性。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables scalable, cost-effective production of AAV vectors using a baculovirus-insect cell system, supporting early-stage gene therapy development with compatibility to GMP requirements. It provides a reproducible platform for preclinical AAV manufacturing, reducing technical risk in vector production workflows. The method supports translational continuity from discovery to preclinical stages by delivering purified AAV particles suitable for functional validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables production of AAV-GFP or therapeutic gene vectors for target validation and pathway interrogation in mammalian cells.
- Operational Value: Uses Sf9 cells and baculovirus co-infection to generate high-titer AAV particles for functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified AAV particles allow standardized transduction assays for screening gene therapy constructs.
- Operational Value: Affinity chromatography and TFF provide scalable, reproducible purification compatible with assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers clinical-grade AAV2 vectors for preclinical biodistribution, safety, and efficacy studies.
- Operational Value: Neutralization, buffer exchange, and concentration steps ensure vector stability for in vivo applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting AAV production for target validation, assay development, and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supplies AAV vectors for validating therapeutic gene expression and pathway modulation in disease models.
- Screening: Enables production of consistent AAV batches for high-throughput screening of gene therapy candidates.
- Analytics: Purified AAV allows quantification via ELISA, qPCR, or functional titer assays for comparative analysis.
- Translational Research: Provides purified AAV for bridging in vitro findings to preclinical models via standardized dosing.
- Enterprise Reuse: The baculovirus-Sf9 platform is reusable across multiple AAV serotypes and therapeutic genes, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-purity AAV with intact capsid profiles (VP1, VP2, VP3) ensures reliable biological activity.
- Operational Value: Serum-free suspension culture, scalable bioreactor use, and TFF concentration support process consistency.
- Strategic Value: Cost-effective scaling reduces early-stage manufacturing burden and accelerates go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of AAV candidates based on reproducible vector yield and purity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect cell culture, baculovirus handling, and AAV purification techniques.
- Needs access to shakers, bioreactors, chromatography systems, and tangential flow filtration equipment.
- Demands standardization of MOI, harvest timing, and lysis conditions across production runs.
- Requires adaptation of buffer conditions and serotype-specific purification parameters for other AAV variants.
- Limited by shear sensitivity in large-scale bioreactors and potential baculovirus contamination risks requiring rigorous clearance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Generation of Baculovirus-infected TIPS Cells
3:05
Production of AAV Vector
5:08
Lysis of Cells and Release of AAV
6:07
Purification of AAV Vector Using Affinity Column Chromatography System
8:03
Concentration and Diafiltration of AAV Vector Using Tangential Flow Filtration (TFF)
8:54
Results: Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector Using Baculovirus-Insect Cell Culture System
9:48
Conclusion
