利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

本方案将对希望利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统开发腺相关病毒（AAV）生产与纯化方法的研究人员具有重要参考价值。采用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产AAV是一种成本效益高、易于放大且符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的方法。本方案的部分操作步骤将由本实验室研究助理Alan Heizer进行演示。

首先解冻一管 Sf9 细胞，并立即将其接种于 15 毫升昆虫细胞培养基中。将 Sf9 细胞置于 28 摄氏度、125 转/分钟的轨道摇床培养箱中，在带有松盖的圆底培养瓶中进行培养，以利于气体交换。在含有 200 毫升培养基的 1 升培养瓶中扩增细胞，以获得足够数量的细胞用于 TIPS 细胞制备。

在两个培养瓶中各加入50毫升浓度为2×10⁶个细胞/毫升的Sf9细胞。其中一个培养瓶的Sf9细胞用0.5毫升杆状病毒-AAV2-GFP感染，另一个培养瓶的细胞用0.5毫升杆状病毒-AAV2-rep-cap感染。三天后，收集少量感染了杆状病毒的Sf9细胞（也称为TIPS细胞）样品。

取未感染和杆状病毒感染的Sf9细胞各2 × 10⁵个，加入含0.5 µg小鼠抗杆状病毒gp64抗体（标记荧光染料）的100 µL封闭缓冲液，避光、室温孵育30分钟，染色两次。用PBS洗涤细胞以去除未结合的抗体后，将染色后的细胞重悬于含0.5%牛血清白蛋白的300 µL PBS中。通过流式细胞术分析细胞表面杆状病毒gp64的表达情况。

当细胞活力达到80%至90%，且细胞直径增大时，收集细胞，并将1×10⁷个细胞用含10%胎牛血清和10%二甲基亚砜的1毫升昆虫细胞培养基悬浮，置于-80摄氏度的程序降温冻存盒中进行慢速冷冻。次日，将含有TIPS细胞的冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。为进行腺相关病毒（AAV）的生产，需在摇床培养箱中，于28摄氏度条件下，在多个装有400毫升昆虫细胞培养基的2升培养瓶中培养和扩增 naive Sf9 细胞，细胞密度为2×10⁶个细胞/毫升。

经过三到四天后，细胞密度可增加至每毫升5×10⁶到6×10⁶个细胞。在轨道摇床培养箱中进行AAV生产时，使用移液器或蠕动泵将400毫升、细胞密度为2×10⁶个细胞/毫升的Sf9细胞培养液无菌接种至2升的培养瓶中。将轨道摇床设置为125转/分钟，温度为28°C。

解冻一管杆状病毒-AAV-GFP和一管杆状病毒-AAV-rep-cap TIPS细胞。用20毫升昆虫培养基稀释细胞，并使用台盼蓝进行细胞活力计数。按照与摇瓶或生物反应器中培养的 naive Sf9 细胞1:10,000的比例接种两种TIPS细胞。

在第二天，无菌条件下收获一毫升 Sf9 培养物，用台盼蓝染色液染色，以分析细胞数量、活力和形态。在第三天，重复第二天的操作步骤，并在对 Sf9 细胞染色后检查杆状病毒的感染状态。在第五天，再次重复第二天的操作步骤，然后在 Sf9 细胞活力下降至约 50% 时收获培养基和细胞。离心后收集上清液和细胞沉淀，并于 -80°C 保存。

待AAV生产细胞沉淀解冻后，加入细胞裂解缓冲液并剧烈混匀。将重悬的沉淀在室温下孵育30分钟，以释放AAV颗粒。离心后，将细胞裂解液转移至新的容器中。

解冻后，混合细胞裂解液和细胞培养上清液。向细胞裂解液中加入20单位/毫升的核酸酶和10毫摩尔的氯化镁，以消化DNA和RNA，并在37摄氏度下孵育2至4小时。使用泵将裂解液通过0.8微米和0.2微米聚醚砜双级过滤系统进行过滤。

将澄清的细胞裂解液在4°C下保存过夜，或立即纯化腺相关病毒（AAV）。将10毫升AVB Sepharose柱安装到层析仪上，并将管道插入AAV样品、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中。将收集管插入层析仪的组分收集槽中，用于收集流穿液、洗涤缓冲液以及含有AAV颗粒的洗脱缓冲液组分。

用五个柱体积的磷酸盐缓冲液（PBS），以每分钟5毫升的流速平衡AVB Sepharose柱。使用配备样品泵的层析系统，将含有AAV颗粒的过滤后细胞裂解液上样至AVB Sepharose亲和柱。以每分钟3毫升的流速运行样品。

以每分钟3毫升的流速用PBS冲洗层析柱，直至280纳米处的紫外吸收曲线回到基线并保持稳定。使用pH为3的50毫摩尔柠檬酸钠缓冲液，以每分钟3毫升的流速从AVB Sepharose柱上洗脱AAV颗粒。立即向AAV上清液中加入其体积五分之一的500毫摩尔Tris HCl缓冲液（pH 8.0），以中和含有AAV的酸性洗脱缓冲液。

这可以防止因pH 3.0的酸性洗脱缓冲液可能引起的pH介导的降解。然后用PBS将AAV上清液稀释十倍，使AAV颗粒处于生理缓冲液中。保存每次层析柱穿流样品、洗涤缓冲液各1毫升，以及洗脱后的AAV上清液100微升，用于通过感染靶细胞来评估AAV的存在情况。

设置切向流过滤系统，配备截留分子量为100千道尔顿的聚醚砜膜 cartridge，用于浓缩腺相关病毒（AAV）。用200毫升磷酸盐缓冲液（PBS）运行10分钟，以平衡切向流过滤模块。通过调节泵的流速将AAV样品加载，直至样品浓缩至目标体积。

用100毫升磷酸盐缓冲液（PBS）对截留物进行透析过滤。将AAV样品浓缩至目标体积后，收集AAV样品，经0.2微米聚醚砜滤膜过滤，并分装。随后将AAV样品于-80摄氏度保存。

由于多轮感染，大多数Sf9细胞在三到四天内被杆状病毒感染，表现为杆状病毒糖蛋白gp64的表达。大多数细胞还显示出直径增大。细胞直径增加、出现细胞病变效应，并且约一半细胞在感染后五天内死亡，这些均是AAV生产完成的标志。

在使用酸性缓冲液洗脱时观察到一个蛋白质峰，对应于AAV组分。纯化的AAV样品经SDS-PAGE和银染后显示出三种不同的衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3。最关键的步骤是在冷冻保存前收获TIPS细胞，此时大多数细胞已被杆状病毒感染，且细胞死亡数量最少。

本文以2型血清型AAV载体为例，描述了其制备与纯化过程。然而，该方案也可适用于其他AAV血清型。