Name: 构建含有G蛋白偶联受体（GPCR）的脂质膜模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习利用琼脂糖溶胀技术将G蛋白偶联受体（5-HT1AR）重组至巨型单层脂质囊泡（GUVs）的方法。该技术为膜蛋白功能研究提供了可靠且可推广的实验框架。

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感谢 Matthew Blosser 提供的宝贵讨论和建议。本工作由美国海军研究办公室（N00014-16-1-2382）和美国国家科学基金会（PHY-1915017）资助。

1. 蛋白质标记
<ol>
	<li>将NHS-罗丹明、5-HT1A膜片段和一个7 K MWCO离心脱盐柱置于室温下平衡。</li>
	<li>将1 mg NHS-罗丹明溶解于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中。</li>
	<li>加入5 µL 1 M碳酸氢钠溶液，将5-HT1AR溶液的pH值调节至8。</li>
	<li>将3.66 µL NHS-罗丹明溶液加入50 µL的5-HT1AR溶液中，在微量离心管中轻轻吹打混匀。 
	注意：确保NHS-罗丹明的摩尔量至少过量10倍。</li>
	<li>将混合物避光保存，并在室温下置于旋转仪上孵育1小时。</li>
	<li>用200 µL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）清洗7 k MWCO离心柱，每次1.5 min，共洗三次，每次离心条件为1.5 RCF。</li>
	<li>将标记后的蛋白加入一个离心柱中，并在另一个微量离心管中平衡体积。</li>
	<li>以1.5 RCF离心5 min，收集标记后的蛋白。</li>
	<li>使用NanoDrop分光光度计在280 nm和554 nm处测定紫外-可见吸收光谱，并根据制造商说明书计算标记效率。</li>
	<li>将标记后的蛋白避光保存于5 °C，直至后续使用。标记后溶液在约一周内保持稳定。</li>
</ol>
2. 膜整合5-HT1A的GUVs
<ol>
	<li>材料与试剂的准备
	<ol>
		<li>使蛋白质、脂质和 BSA（牛血清白蛋白）恢复至室温。</li>
		<li>在此期间，将盖玻片浸入甲醇中，并在 40 °C 下超声处理 30 分钟以进行清洁。确保甲醇完全覆盖盖玻片，且水浴中的液面高于容器内甲醇的液面。 
		注意：甲醇具有毒性，应在适当的化学通风橱中操作。</li>
		<li>用温和的气流吹干盖玻片上多余的甲醇。将装有盖玻片的支架放入 40 °C 烤箱中加热 15 分钟，以确保盖玻片完全干燥。</li>
		<li>开始等离子清洗过程。首先，将盖玻片放入等离子清洗仪中，并关闭进气阀，抽空腔室内的所有空气。</li>
		<li>当腔室达到真空状态后，使用高射频（RF）功率设置和接近完全的真空条件（仅允许少量空气进入真空腔室）对盖玻片清洗 5 分钟。为确保适当的等离子体强度，调节真空腔室的开口，使产生的等离子体呈现稳定且明亮的粉红色。 
		注意：使用空气时，整个等离子处理过程中等离子体必须保持明亮的粉红色；若呈现较深的紫色，表明腔室内空气量不适当，将导致等离子处理效果不佳。</li>
		<li>5 分钟结束后，关闭射频电源并释放真空。 
		注意：从等离子腔室取出后，请确保盖玻片保持覆盖状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶的制备
	<ol>
		<li>将 6 mg 超低熔点琼脂糖与 300 µL 超纯水混合（即 2% (w/v) 琼脂糖）。 
		注意：2% 琼脂糖用于制备不含蛋白质的 GUV。琼脂糖溶液可在 45 °C 下保存两天。</li>
		<li>将 9 mg 超低熔点琼脂糖与 300 µL 超纯水混合，制成 3% (w/v) 琼脂糖溶液（按步骤 3.1 方法制备）。3% 琼脂糖用于制备含蛋白质的 GUV。</li>
		<li>在将溶液置于 90 °C 加热块上加热 10 分钟前，短暂涡旋混匀。加热后再次涡旋混匀，然后转移至 45 °C 加热块上，保持熔融状态直至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖与蛋白质的混合
	<ol>
		<li>将 21 µL 3% 琼脂糖与 7 µL 5-HT1AR 膜片段混合。缓慢反复吹打数次以确保充分混匀，随后在 45 °C 下孵育 1 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶与脂质的沉积
	<ol>
		<li>对于不含蛋白质的 GUV：在新近经等离子清洗的盖玻片上，使用 20 µL 2% 琼脂糖形成一层薄膜。迅速将另一片盖玻片覆盖在琼脂糖液滴上，并轻轻滑动使两片盖玻片分开，从而在两者表面均形成一层薄层。 
		注意：此步骤的关键在于滑动操作必须在琼脂糖仍处于熔融状态时完成。</li>
		<li>对于含蛋白质的 GUV：将蛋白质/琼脂糖混合物再次缓慢吹打一次，然后在经等离子清洗的盖玻片上沉积 20 µL 2% 琼脂糖。按照上述方法进行滑动涂布。</li>
		<li>在避光条件下于室温静置 30 分钟，使琼脂糖充分凝胶化。</li>
		<li>将脂质逐滴加至琼脂糖层表面。总共使用 10 µL 氯仿溶液，其中含有 2 mg/mL 的 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）和 0.4 mol% 荧光标记的 ATTO 488-DPPE（即 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺标记 ATTO 488）（或感兴趣的其他脂质混合物）。使用气相色谱针滴加脂质，并通过温和的气流逐滴均匀分散。 
		注意：此步骤需谨慎操作，以在水凝胶表面形成相对均匀的脂质层。此外，氯仿具有毒性，应在适当的化学通风橱中操作。</li>
		<li>通过将 O 型圈置于盖玻片上，再将腔室上部组件置于 O 型圈上，组装 Sykes-Moore（S-M）腔室。使用制造商提供的钥匙将腔室组件旋紧，确保密封，防止泄漏。 
		注意：腔室上部应紧压在 O 型圈上，但需小心操作，避免因 O 型圈未正确就位而导致盖玻片破裂。同时，应确保腔室密封足够紧密，以防止加入溶胀溶液时发生泄漏。若未充分拧紧，将导致泄漏和样品损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡的溶胀与收集
	<ol>
		<li>通过缓慢吹加 450 µL 含 200 mM 蔗糖的 1x PBS 缓冲液，使整个系统水化，并轻轻敲击腔室以确保水凝胶-脂质层被充分覆盖。 
		注意：蔗糖溶液可替换为含有感兴趣生物探针的再水合缓冲液。</li>
		<li>将腔室置于 45 °C 环境中，并用盖玻片覆盖腔室顶部以防止蒸发。在避光和防尘条件下使样品溶胀 1 小时。</li>
		<li>向预定使用的 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的 BSA 超纯水溶液，在室温下孵育 1 小时。</li>
		<li>用超纯水洗涤三次，再用含 200 mM 蔗糖的 1x PBS 洗涤一次。</li>
		<li>最后，加入含 200 mM 葡萄糖的 1x PBS，直至准备加入 GUV 样品溶液。 
		注意：使用 BSA 以阻断 GUV 的吸附。</li>
		<li>待水凝胶充分溶胀后，轻轻摇动并敲击腔室，使可能附着在水凝胶表面的 GUV 脱落。然后，小心吸取 GUV-蔗糖溶液。 
		注意：为确保所有囊泡均从表面脱离，可选择性地将部分蔗糖悬浮液重新吹加至水凝胶表面。</li>
		<li>将悬浮液转移至预先准备好的微量离心管中，管内已加入 700 µL 含 200 mM 葡萄糖的 1x PBS。 
		注意：密度梯度将促使囊泡沉降至离心管底部。</li>
		<li>让囊泡再静置 1 小时，以确保其完全沉降至微量离心管底部，便于最佳收集。</li>
		<li>在 GUV 沉降至葡萄糖溶液底部后，从离心管底部吸取 300 µL（即已沉降的囊泡），转移至预先准备并经 BSA 处理的 96 孔板中，用于共聚焦显微镜观察。 
		注意：操作时应避免触及微量离心管最底部，以尽量减少最终样品中杂质的混入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下检查样品
	<ol>
		<li>用 488 nm 激光照射样品（可观察膜结构，因为双分子层已用 ATTO-488-DPPE 标记）。</li>
		<li>用 561 nm 激光照射样品（可观察蛋白质，因其已用 NHS-Rhodamine 标记）。 
		注意：成像时需谨慎，光氧化可能破坏囊泡稳定性。囊泡应在同一天内完成观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="蛋白质-脂质膜溶胀过程；示意图显示了在491 nm/561 nm激发下的GUVs结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62830/62830fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：详细实验步骤示意图。使用BioRender.com制作 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62830/62830fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

作者声明无利益冲突。

我们已确定两个对整个实验方案成功至关重要的步骤：&#8239; 等离子体处理与脂质沉积&#8239;盖玻片的等离子清洗至关重要&#8239;确保琼脂糖水凝胶对玻璃盖玻片具有充分的覆盖和良好的黏附性。等离子清洗可实现两个目的：&#8239;首先，去除玻璃表面的有机物残留；其次，活化盖玻片表面，随着玻璃表面亲水性增强，其润湿性得以提高62,63.&#8239;等离子清洗后触碰盖玻片表面会使超洁净表面失活并受到污染，应严格避免。我们建议仅触碰其最边缘和底面&#8239;在进行琼脂糖封片步骤时，操作盖玻片应避免触碰盖玻片的表面。&#8239;第二个关键步骤是将脂质沉积到干燥的水凝胶表面。该方法采用逐滴添加的方式进行脂质沉积，&#8239;需要使用气相色谱（GC）针头和气流，每次沉积数微升脂质溶液，从而精确控制所添加脂质的量及其在水凝胶表面的成膜位置。&#8239;该方法的缺点&#8239;是&#8239;若操作不慎，&#8239;它&#8239;可能导致少数情况&#8239;选择&#8239;脂质较厚的区域&#8239;薄膜，导...

合成模型膜是研究生物膜基本性质和功能的有力工具。巨大单层囊泡（GUVs）是研究多种质膜性质的最重要平台之一，可被设计用于模拟不同的生理条件1,2,3,4,5,6,7,8。已有充分证据表明，质膜及其组织结构在多种细胞过程中发挥关键作用，例如信号转导、黏附、内吞作用和物质运输9,10,11,12,13,14,15。
GUVs 已通过多种方法制备，包括温和水化法16，水凝胶溶胀17，电泳形成18，微流控技术19,20,21,22喷射23，以及溶剂置换24,25,26由于在处理整合膜蛋白（IMPs）方面存在挑战， 体外 研究它们的平台一直有限。GUVs 为在模拟其天然环境的条件下研究 IMPs 提供了一个简化的平台。尽管已有多种将蛋白质重构到 GUVs 中的方法，但在蛋白质正确取向的整合以及维持蛋白质功能方面仍存在挑战27.
在GUVs中实现最成功的蛋白质重建通常需要采用去垢剂置换法，该方法包括利用去垢剂将蛋白质从其天然环境中溶解出来，随后进行蛋白质纯化，再通过多种方法用脂质替代去垢剂分子28。尽管去垢剂可在纯化过程中稳定膜内在蛋白（IMPs）的三级结构，但去垢剂胶束对这些蛋白质而言仍是一种相对非自然的环境；相比之下，脂质双分子层更有利于其稳定，尤其是在进行功能研究时28,29,30。此外，由于跨膜蛋白体积较大、结构脆弱，且需额外进行去垢剂置换步骤，因此使用传统GUV制备技术将功能性跨膜蛋白整合到脂质双层中一直存在困难27,31,32,33。使用有机溶剂去除去垢剂会导致蛋白质聚集和变性34。虽然已有改进的去垢剂介导方法展现出一定前景，但在去除去垢剂步骤中仍需谨慎操作，并可能需要针对特定蛋白质进行条件优化31,35。此外，利用电形成法的方法可能会限制蛋白质的选择，且并不适用于所有类型的脂质组成，特别是带电脂质31,36,37。另一种已被使用的技术是通过融合肽介导含有目标蛋白的大型单层囊泡（LUVs）与GUVs发生融合，但该方法操作繁琐，且可能导致外源分子——即促融合肽——插入膜中33,38,39。源自活细胞的巨型质膜囊泡（GPMVs）可用于克服其中部分问题，但其对最终脂质和蛋白质组成的调控能力极为有限14,40,41。因此，采用我们改进的琼脂糖溶胀法将IMPs整合至GUVs的双层脂质膜中，为在膜环境中进一步研究这些蛋白质提供了一种可靠的方法42,43,44,45。
细胞信号传导与通讯涉及一类称为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）的蛋白质；GPCRs是最大的蛋白质家族之一，参与调控情绪、食欲、血压、心血管功能、呼吸和睡眠等多种生理功能46。在本研究中，我们使用了人源5-羟色胺1A受体（5-HT1AR），它是GPCR家族的典型代表。5-HT1AR存在于中枢神经系统（CNS）和血管中，影响心血管、胃肠道、内分泌等多种功能，并参与情绪调节47。GPCR研究面临的主要障碍之一是其复杂的两亲性结构，而大单层脂质体（GUVs）为研究多种关键特性提供了有前景的平台，包括蛋白质功能、脂质-蛋白质相互作用以及蛋白质-蛋白质相互作用。已有多种方法被用于研究脂质-蛋白质相互作用，例如表面等离子共振（SPR）48,49、核磁共振波谱法（NMR）50,51、蛋白质脂质覆膜（PLO）实验51,52,53,54、天然质谱法55、等温滴定 calorimetry（ITC）56,57以及脂质体沉降实验58,59。本实验室采用简化的GUV方法，通过包封BODIPY-GTPγS来研究脂质-蛋白质相互作用对蛋白质功能的影响，该分子可与受体激活状态下Giα亚基结合。它们的结合会解除荧光基团的淬灭，从而随时间产生可检测的荧光信号45。此外，已有多种研究探讨了脂质-蛋白质相互作用以及蛋白质在感知或稳定膜曲率中的作用60,61，而采用可行的GUV方法可能具有关键优势。
本方案展示了一种利用改良的琼脂糖水凝胶系统将G蛋白偶联受体（GPCR）整合到大单层囊泡（GUV）膜中的简便方法17,42。此外，基于我们先前的研究，该方法可能适用于能够耐受短时间暴露于30–40 °C条件下的内在膜蛋白（IMPs）。简而言之，我们将含有目标GPCR的膜片段与琼脂糖混合，铺成一层薄膜。待该层凝胶化后，在琼脂糖表面滴加脂质溶液，并使其溶剂自然挥发。随后用缓冲水溶液对体系进行再水化，从而形成脂质双分子层中嵌入蛋白质的GUVs。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850375C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;TI-Eclipse 倒置显微镜</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850355C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>13/16&amp;Prime; 内径，1&amp;Prime; 外径硅胶O型圈</td><td>Sterling Seal &amp;amp; Supply, Neptune, IN</td><td>5-003-8770</td><td></td></tr><tr><td>16位级联II 512电子倍增电荷耦合器件相机</td><td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td><td>&amp;nbsp;Cascade II 512</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>488 nm波长50 mW固态激光器，发射滤光片中心波长525 nm；561 nm波长激光器，发射滤光片中心波长595 nm</td><td>Coherent, Santa Clara, CA</td><td>488/561-50-LS</td><td></td></tr><tr><td>5-HT1AR膜片段</td><td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td><td>RBHS1AM400UA</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-488标记的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）</td><td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td><td>AD 488-155</td><td></td></tr><tr><td>台式等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>CX1055</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇（Chol）</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96孔平底透明板</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Elmasonic E系列E15H超声波清洗仪</td><td>Elma, Singen, Germany</td><td>[主网站已不再销售]</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（MeOH）</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>MX0485</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NHS-罗丹明</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）（10倍浓缩PBS）</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>旋转盘CSUX共聚焦显微镜头</td><td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>标准25 mm 1号玻璃盖玻片</td><td>ChemGlass, Vineland, NJ</td><td>CLS-1760</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sykes-Moore反应室</td><td>Bellco, Vineland, NJ</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>超低熔点琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5030</td><td></td></tr><tr><td>VWR模拟加热块</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>[主网站已不再销售]</td><td></td></tr><tr><td>VWR试管旋转仪</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin脱盐柱，7K分子量截留，0.5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

构建含g蛋白偶联受体（gpcrs）的模型脂质膜

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

由于质膜的复杂性以及活细胞中影响蛋白质行为的多种因素，对整合膜蛋白的结构与功能进行稳健的体外研究一直存在挑战。巨大单层囊泡（GUVs）是一种仿生性强且高度可调的体外模型系统，可用于研究蛋白质-膜相互作用，并以精确、刺激依赖的方式探测蛋白质行为。在本实验方案中，我们介绍了一种经济高效的方法，用于制备稳定整合人源5-羟色胺1A受体（5-HT1AR）的GUVs。我们采用改良的水凝胶溶胀法制备GUVs：将脂质膜沉积在琼脂糖与5-HT1AR的混合物表面，随后对整个系统进行水化，从而形成膜中正确取向且具有功能性的5-HT1AR整合的囊泡。这些GUVs随后可通过显微镜技术用于研究蛋白质-膜相互作用及定位行为。最终，该方案有助于加深对整合膜蛋白功能的理解，提供深刻的生理学洞察。

测定蛋白质浓度，并计算染料与蛋白质的摩尔比，结果为1:1。通过共聚焦显微镜观察GUVs，我们确认了囊泡的成功形成及蛋白质的有效整合。脂质以0.4 mol%的ATTO 488-DPPE进行标记，蛋白质则通过罗丹明NHS酯对伯胺的共价修饰进行标记。图2a和图2b分别显示了在同一囊泡中ATTO 488通道和罗丹明通道下的含蛋白质囊泡。所有显微图像均经过暗电流和视场均匀性校正。图2c和图2d显示了未整合蛋白质的阴性对照GUV。图3a和图3b显示了一个整合了蛋白质的GUV，并给出了同一囊泡在两个通道中沿白色虚线的线强度分布图。线强度分布图展示了图像中沿所画白线方向各像素强度的二维图谱，其中x轴表示沿该线的距离，y轴表示像素强度。使用ImageJ软件绘制指定线段的强度分布曲线。
<p c...

本方案利用琼脂糖溶胀技术，作为一种强大且具有广泛适用性的方法，将整合膜蛋白（IMPs）包封入巨型单层脂质囊泡（GUVs）中。文中以人源5-羟色胺1A受体蛋白（5-HT1AR）的重建为例，该蛋白属于药理学上重要的G蛋白偶联受体类别之一。

构建含G蛋白偶联受体（GPCRs）的模型脂质膜

由于质膜的复杂性，对整合膜蛋白的结构和功能进行可靠的体外研究一直具有挑战性。

由于质膜结构的复杂性，在天然环境中研究整合膜蛋白一直是一项挑战。巨型单层脂质囊泡（GUVs）是研究生物膜特性的最重要平台之一，且可被设计用于模拟多种生理条件。本方案描述了一种基于水凝胶溶胀后自发整合的方法，用于制备含有蛋白质的GUVs。传统的GUV制备方法难以普遍适用于整合膜蛋白的包埋，通常产率较低、操作复杂且具有随意性，无法广泛应用于各类蛋白质。相比之下，本方案提供了一种灵活、稳健且简便的方法，可将具有功能活性的整合膜蛋白有效地整合到GUVs中。我们通过制备含有目标蛋白的水凝胶支架，并在其表面沉积一层薄脂质膜来实现这一目标。在本示例中，我们将G蛋白偶联受体（GPCR）整合入GUVs中。当整个系统重新水化时，GUVs会从水凝胶表面出芽形成，其膜结构中含有正确取向的GPCRs。请将所有试剂恢复至室温。在此期间，通过将盖玻片浸入甲醇并以40℃超声处理30分钟来清洗盖玻片。

construction-model-lipid-membranes-incorporating-g-protein-coupled

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

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构建含G蛋白偶联受体（GPCRs）的模型脂质膜

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