双层膜三明治法用于Laodelphax striatellus唾液采集

人工饲喂和唾液采集为检测昆虫唾液中的效应子提供了一种直接方法。然而，此前尚未有详细描述。本方案适用于腐食性昆虫的唾液采集。

此外，该技术操作简便，因为我们使用仅含蔗糖的培养基作为人工饲料。腐生性昆虫的唾液可能会影响寄主的免疫系统，从而有利于其取食行为并促进病原体的传播。这种药物可用于昆虫行为及昆虫骨骼病理学研究。

这是一种简单的操作方法。然而，由于需要收集唾液用于进一步研究，因此建议建立一个洁净的实验环境。首先配制5%的蔗糖溶液作为人工饲料，并通过0.22微米滤膜过滤该溶液，以去除细菌污染和杂质。

在将约200只小型褐飞虱若虫引入饲喂室前，使其饥饿处理3至5小时。接下来，将玻璃圆筒准备为饲喂室：在引入实验昆虫之前，用一层石蜡膜封住圆筒的一端开口，然后将昆虫转移至玻璃圆筒内，并用另一层拉伸的石蜡膜封住圆筒的另一端。在膜上加入200 µL人工饲料，再用另一层拉伸的石蜡膜覆盖液体表面。

最后，用铝箔包裹小室，仅使含人工饲料装置的一端暴露于光照下。24小时后，将圆筒置于4摄氏度冷却，以固定昆虫，随后揭开外层薄膜，用无菌移液器将人工饲料收集至1.5毫升无菌离心管中。收集的唾液应保存于-80摄氏度，直至进行分析。

接着，用 50 微升新鲜人工饲料轻柔吹打，冲洗内层膜三次，并将冲洗后的废液收集至 1.5 毫升无菌离心管中。完成三次冲洗后，在内层膜上加入新鲜人工饲料，并在其上方覆盖一张新拉伸的石蜡膜。最后，将收集的样品通过 0.22 微米滤器过滤，以去除微生物及其他污染物。

将收集的唾液样本转移至500微升、10千道尔顿的离心过滤管中。离心样本，收集上清液，并将最终体积定容至100微升。

为测定所收集唾液的浓度，打开紫外-可见分光光度计，并用双蒸水清洗比色皿三次。在屏幕上按以下顺序选择选项：蛋白质、蛋白A280。选择类型，设定一个吸光度单位等于1毫克/毫升。

然后选中基线校正复选框，340 纳米。接着，加载 2 µL 的 5% 蔗糖水溶液作为空白样，然后点击屏幕底部的“空白”按钮。最后，在设定标准后，加载 2 µL 收集的唾液样本，并记录蛋白质浓度。

在饲喂5%蔗糖时，超过80%的褐飞虱（SBPH）在前四天内存活。然而，从第五天开始，死亡率迅速上升至40%，到第七天时，存活的褐飞虱不足一半。SDS-PAGE分析显示，来自感染水稻条纹病毒（RSV）的褐飞虱的浓缩唾液样本所含蛋白质明显多于5%蔗糖阴性对照组。

在检测水稻条纹病毒（RSV）衣壳蛋白的蛋白质印迹分析中，分别使用了非感染昆虫和带毒昆虫样本。结果在带毒昆虫样本中成功检测到RSV衣壳蛋白；而针对LssgMP基因产物设计的抗体在非感染和带毒昆虫样本中均检测到一个分子量为78千道尔顿的蛋白，表明LssgMP是一种唾液蛋白。对LssgMP转录水平在不同组织中的qRT-PCR分析显示，唾液腺中的Lssg转录水平比全虫体和肠道高出20倍，进一步证实LssgMP在唾液腺中特异性表达。

在将实验昆虫引入小室之前进行饥饿处理，是确保唾液采集效率的必要步骤。此外，应每隔24小时收集并更换一次人工培养基，以减少样本中的微生物污染。该技术为研究唾液在病原体传播中的功能提供了直接方法。

此外，它还可用于研究昆虫病原体与宿主之间的相互作用。