Name: 用户友好型、高通量和全自动数据采集软件，用于单颗粒冷冻电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解Latitude-S自动化数据采集软件在单颗粒冷冻电镜中的应用，实现生物大分子的高通量结构表征。该方法显著提升病原体相关蛋白质研究的效率与准确性。

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我们感谢印度生物技术部、科学技术部（DST）以及人力资源发展部（MHRD）的资助，以及印度科学理工学院（IISc）班加罗尔校区的冷冻电镜设施。我们感谢DBT-BUILDER项目（BT/INF/22/SP22844/2017）和DST-FIST（SR/FST/LSII-039/2015）对IISc班加罗尔国家冷冻电镜设施的支持。我们感谢科学与工程研究委员会（SERB）提供的经费支持（项目编号：SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608 和 SERB-IPA/2020/000094）以及DBT（项目编号：BT/PR25580/BRB/10/1619/2017）。我们感谢Ishika Pramanick女士在制备冷冻电镜载网、冷冻电镜数据采集以及准备材料表方面所做的工作。我们还感谢Suman Mishra先生在冷冻电镜图像处理以及协助我们制备图示方面提供的帮助。我们感谢Raghavan Varadarajan教授协助我们获得本研究所用的纯化刺突蛋白样品。

注意：冷冻电镜数据采集需要三个重要步骤：1. 冷冻电镜载网制备，2. 显微镜的校准与对中，3. 自动化数据采集（图1）。此外，自动化数据采集又可分为以下子步骤：a. 选择合适区域，b. 优化Latitude-S参数，c. 启动自动孔区选择，d. 启动自动数据采集（图1）。
1. 自动数据采集的冷冻电镜载网制备与样品加载
<ol>
	<li>使用电晕放电器清洁载网，并根据实验需求调整电晕放电参数（此处为 20 mA 下放电 60 秒）。</li>
	<li>将新鲜制备的蛋白质样品（3 µL）加入经电晕放电处理的载网上，孵育 10 秒。</li>
	<li>在 100% 湿度条件下 blot 3–5 秒，然后使用冷冻载网投入装置迅速将载网浸入液态乙烷中。</li>
	<li>通过弹性 C 型夹环手动将载网夹紧到夹环上，形成弹匣结构。</li>
	<li>将冷冻固定的载网装入自动进样器样品盒中，并通过纳米帽将样品盒转移至预冷的显微镜自动进样器中，以进行数据采集。</li>
</ol>
2. 自动数据采集前的显微镜调谐与基本校准
<ol>
	<li>电子束偏移
	<ol>
		<li>在直接校准选项卡中点击电子束偏移。</li>
		<li>降低放大倍数，并使用多功能 X 和 Y旋钮将电子束中心对准光轴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>枢轴点校准
	<ol>
		<li>在直接校准选项卡中的直接校准 pp X处点击电子束倾斜选项。</li>
		<li>将电子束聚焦成一个点，并使用多功能 X 和 Y旋钮最小化其移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C2 聚光镜光阑居中
	<ol>
		<li>从校准选项卡中选择聚光镜光阑。</li>
		<li>将电子束聚焦成一个点，使其对准光轴，然后扩展电子束以均匀覆盖整个圆圈。</li>
		<li>重复上述步骤，直至完成对 Condenser 2 光阑的调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无彗差校准
	<ol>
		<li>在直接校准选项卡中点击无彗差校准 X，以将电子束对准光轴。</li>
		<li>使用多功能旋钮最小化 FFT 图案的形状和移动（确保其稳定）。</li>
		<li>对无彗差校准 Y重复相同操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于 C 双合透镜的存在，在冷冻电镜数据采集前需设置平行照明。
	<ol>
		<li>在衍射模式下插入物镜光阑（70 µm）。</li>
		<li>通过调节散焦-强度旋钮（物镜和 C2 透镜电流），将物镜光阑聚焦到衍射透镜的前焦平面上。</li>
		<li>适当散焦后，应能观察到物镜光阑清晰的边缘。</li>
		<li>插入束流挡板并扩展强度，直到金粉衍射环最小化。 
		注：若电子束扩展适当，屏幕上将可见清晰的金粉衍射环，表明电子束已达到平行。</li>
		<li>设置完平行照明后撤回束流挡板，并将显微镜模式切换至纳米探针。 
		&#8203;注：开始数据采集前应检查显微镜调校状态，以确保显微镜处于最佳性能。所有这些设置均在显微镜的直接校准 GUI 选项卡中完成。所有显微镜调校均在数据采集前使用测试网格进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 Latitude-S 进行数据采集
<ol>
	<li>启动 Latitude-S 自动化数据采集软件。 
	注意：安装 Latitude-S 还需要进行显微镜校准，该步骤将在数据采集前完成，且设置将被永久保存。数据采集使用五种不同的状态，并配备四种不同的放大倍数（图1 和 图2）。图谱状态（Atlas state）和网格状态（Grid state）处于光学显微镜模式（LM 模式）下的两种不同放大倍数（低倍范围）。孔洞状态（Hole state）处于选区放大模式（SA 模式，高倍范围），但使用中等放大倍数。聚焦状态（Focus）和数据状态（Data state）则使用高倍 SA 模式。
	<ol>
		<li>从 开始 菜单中点击 DigitalMicrograph ，或双击桌面上的 DigitalMicrograph 图标。</li>
		<li>在 DigitalMicrograph 中选择 技术管理器 图标。 
		注意：该系统将显示 TEM 和 Latitude-S 图标（图2 和 补充图 S1）。</li>
		<li>选择 Latitude-S 图标以进行单颗粒自动化数据采集。 
		注意：K2 相机具有三种工作模式：线性/积分模式、计数模式和超分辨率模式。用户可在 DigitalMicrograph 界面中选择任意一种模式。数据图像可保存为剂量分帧的图像堆栈，或以不同位深度的 MRC、TIF 或 .dm4 文件格式保存为累加图像。此外，K3 相机的数据可保存为运动校正后的图像。对于 K2 相机，未处理的图像堆栈可保存为 4 位 MRC、8 位 TIF 或 8 位 .dm4 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于先前会话的设置创建新会话。
	<ol>
		<li>在面板中勾选 基于先前会话 复选框。</li>
		<li>点击 新建 按钮。</li>
		<li>选择包含作为新会话设置基础的会话文件夹。进入先前会话的目录以创建新会话。选择用于保存新会话及其相关数据的文件夹。</li>
		<li>选择并指定新会话及相关数据的保存文件夹。 
		注意：每个状态及其底层设置（放大倍数、照明条件、图像或投影仪）、束流偏移和相机参数（总曝光时间、单帧曝光时间及 binning）将从现有会话导出至新会话。文件夹路径以文本字符串形式显示在面板底部。每个状态和配置面板的标题后均附加一个星号 (*)，表示其已配置完毕并可直接使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续一个已有会话。
	<ol>
		<li>在面板中点击 继续 按钮以继续已有会话。 
		注意：图谱拼接图（atlas montage）不可修改。</li>
		<li>选择并导航至包含需继续会话的文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动一个全新的会话。
	<ol>
		<li>在面板中点击 新建标签页。选择包含要继续会话的文件夹。选择用于保存数据的文件夹。 
		注意：默认文件夹名称由日期和时间自动生成。</li>
		<li>点击 设置 图标。在弹出的 管理状态探索 框中，添加状态，设置透射电子显微镜（TEM）条件、相机条件以及图像/堆栈参数，并为该状态命名。 
		注意：自动化数据采集工作流程使用五种不同的状态进行自动化数据采集。这些状态分别配置并存储在各自的状态面板中。状态汇总见 表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置图谱状态（Atlas state）。
	<ol>
		<li>点击 图谱状态面板。</li>
		<li>使用以下参数配置图谱状态：放大倍数为纳米探针模式下的 115x LM 模式，照明条件为光斑尺寸 8、亮度 934400，binning：1，相机曝光时间：1.0 s，用于低倍成像。参见 表1 中提供的状态汇总。</li>
		<li>点击 下一步 进入下一个状态。 
		注意：图谱状态是最低放大倍数的状态，用于对整个载网进行概览（补充图 S2）。通常，该状态有助于在低倍下观察整个载网，判断冰层厚度、平整度以及载网方格是否破损。建议在载网的不同区域生成图谱，以观察载网上冰层厚度最优与次优的区域（补充图 S3）。上述参数可根据用户需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置网格状态（Grid state）。
	<ol>
		<li>点击 网格状态面板。</li>
		<li>使用以下显微镜成像光学参数配置网格状态：放大倍数为纳米探针模式下的 380x LM 模式，照明条件为光斑尺寸 8、亮度 626,200，binning：1，相机曝光时间：1.0 s。</li>
		<li>参见 表1 中提供的 Latitude-S 状态汇总。</li>
		<li>点击 下一步 进入下一个状态。 
		注意：网格状态的放大倍数高于图谱状态，其视场为一个载网方格（图2）。在此特定放大倍数下，可观察单个载网方格。因此，孔洞在此放大倍数下可被正确观察，有助于检查孔洞的冰层厚度（补充图 S4）。在网格状态中使用简单的带通滤波器来定位专利载网中的孔洞。上述参数可根据用户需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置孔洞状态（Hole state）。
	<ol>
		<li>点击 孔洞面板。</li>
		<li>使用以下显微镜设置配置孔洞状态：成像光学（放大倍数为纳米探针模式下的 4500x SM 模式），照明条件（光斑尺寸：7，束斑直径 8.81 µm），binning：1，相机曝光时间：1.0 s。</li>
		<li>根据载网类型按需调整参数。参见 表1 中提供的状态汇总。</li>
		<li>点击 下一步 进入下一个状态。 
		注意：SA 模式表示电子显微镜中的高倍范围。孔洞状态处于 SA 放大倍数范围内，其视场为几微米（10–20 µm）（图2 和 补充图 S4）。此放大倍数高于图谱或网格状态，但远低于聚焦/数据状态。在此放大倍数下，单个孔洞将清晰可见。该倍数适合观察孔洞中是否存在高度污染、空孔以及冰层厚度是否合适。成像用孔洞的选择基于上述判断。在孔洞状态中使用两种滤波器：一种用于将孔洞参考图像与新获取的孔洞图像进行互相关匹配，另一种用于调节样品台高度至同心高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置聚焦状态（Focus state）。
	<ol>
		<li>点击 聚焦面板。</li>
		<li>使用以下显微镜设置配置聚焦状态：成像光学（放大倍数为纳米探针模式下的 45,000x SA 模式），照明条件（光斑尺寸：8，亮度 934400），binning：1，相机曝光时间：1.0 s。</li>
		<li>对准孔洞附近非晶碳区域进行聚焦。参见 表1 中提供的 Latitude-S 状态汇总。</li>
		<li>点击 下一步 进入下一个状态。 
		注意：SA 模式表示电子显微镜中的高倍范围。聚焦状态属于更高倍数的 SA 范围。在聚焦模式下，电子束将偏移至目标孔洞附近的碳区域，并自动执行聚焦，以便在数据状态中采集数据。聚焦状态中使用带通滤波器结合汉宁滤波器或软矩形滤波器，以测量同一区域两次聚焦图像之间的偏移量（图2）。上述参数可根据用户需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置数据状态（Data state）。
	<ol>
		<li>点击 数据面板。</li>
		<li>使用以下显微镜设置配置数据状态：成像光学（例如，纳米探针模式下 SA 模式的放大倍数为 28,000x、45,000x 或 54,000x），照明条件（光斑尺寸：8，亮度 934400），binning：1，相机曝光时间：1.0 s。</li>
		<li>参见 表1 中提供的 Latitude-S 状态汇总。</li>
		<li>点击 下一步 进入下一个状态。 
		&#8203;注意：数据状态是根据像素尺寸要求和目标分辨率选定的最高放大倍数（图2）。通常，在完成聚焦后，电子束将自动偏移至目标区域以采集数据。上述参数可根据用户需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 聚焦配置
<ol>
	<li>单击 聚焦配置面板。在指定的选项卡中设置离焦值的范围及步长。</li>
	<li>按下 下一步 按钮进入下一步。 
	&#8203;注意：较低的离焦值可用于高分辨率数据采集。通常采用 -0.5 至 -3.0 µm 的离焦值，离焦步长为 0.25 或 0.5。如果用户仅需筛选样品，可跳过聚焦设置步骤。只需在面板上点击 下一步 按钮即可跳过聚焦配置步骤。</li>
</ol>
5. 精细校准
<ol>
	<li>关注网格上的一些特征（例如，冰污染中的六方冰）；参见图3。 
	注意：特征不宜过大或过小。在图谱状态放大倍数115x（LA模式）和数据放大倍数下均应可见。</li>
	<li>点击采集按钮。将红色十字标记放置在不同状态图像的同一特征上。</li>
	<li>首先从聚焦、数据和孔洞状态开始，因为它们的视场远大于图谱和网格状态。对图谱和网格状态进行放大，以将红色十字标记定位在图谱和网格状态中的相同特征上。</li>
	<li>点击计算按钮，以计算五种不同状态的位置，系统将计算各状态之间的偏移量，并将结果显示在输出窗口中。 
	&#8203;注意：偏移值已整合到各状态中以供后续使用（图3）。通过精细校准可实现各状态位置的高精度对准（图3）。该精细校准有助于在全部五种状态中精确定位。精细校准对于单颗粒数据采集至关重要，因此强烈建议在成像前执行精细校准。</li>
</ol>
6. 使用 Latitude-S 进行数据采集的流程
<ol>
	<li>点击 捕获调色板. 
	注意：通常在低倍率（115倍）下采集图谱数据，以观察大部分网格方格。</li>
	<li>根据需求选择图谱的尺寸，以覆盖整个网格或部分网格（例如 6 x 6、8 x 8、12 x 12、6 x 8、8 x 6、12 x 8 或 8 x 12）。 
	注意：16×16 的图谱尺寸覆盖整个网格。</li>
	<li>点击 捕获 单击按钮以获取图谱。 
	注意：Latitude-S 导航主窗口打开，并填充 DigitalMicrograph 中的可用空间补充图 S5主导航窗口中的三个图像窗格显示了系统在三种不同放大倍数下的状态图像。最左侧窗格中显示的是目前正在进行采集的全图谱当前状态。随着每次图像采集完成，图谱中的瓦片将逐步填充。</li>
	<li>根据冰层厚度，通过在图谱上导航来选择网格方格补充图 S5）。选定所需网格区域后，点击 时间安排 按钮，并观察每个网格方块被捕捉时，其中的图块逐渐填满。</li>
	<li>点击 安排 选中网格方格后，单击按钮。</li>
	<li>通过添加其位置来选择网格方格中的一个代表性孔位。获取一个孔的图像后，定义数据采集位置和聚焦位置，并将布局保存为模板（补充图 S6).</li>
	<li>点击 自动查找，给出孔的尺寸（例如，R1.2/1.3），然后点击 查找 程序中的按钮，将导致 查找 根据孔径自动查找孔洞的程序。接下来，单击 马克 按钮以添加模板（图4）并在一个网格或部分网格方格的所有孔中添加红色圆圈标记。</li>
	<li>将强度设置为去除网格方格中的孔洞及冰污染图4). 
	注意：最后，选定的孔位将用黄色标记，以安排数据采集。</li>
	<li>点击 时间安排 按钮在 纬度任务 在打孔后 自动查找. 
	&#8203;注意：在安排自动数据采集之前，确保液氮罐液位充足，自动进样器涡轮泵已关闭，且RAID驱动器空间可用。Latitude-S任务管理器显示了计划进行数据采集的图谱、网格方格、孔洞及数据状态的数量图5）。在 Latitude-S 图形用户界面中，将显示多种颜色方案，其含义如下：1. 黄色表示未安排；2. 绿色表示已安排；3. 蓝色表示已获取；4. 红色表示失败。</li>
</ol>
7. 冷冻电镜数据处理
注意：刺突蛋白的冷冻电镜图像处理在近期文献中有详细描述25。
<ol>
	<li>使用 RELION 3.0 对 SARS-CoV2 的刺突蛋白进行图像处理11。</li>
	<li>手动筛选 Latitude-S 采集的电影图像，并使用 MotionCor2 软件对单个电影进行电子束诱导运动校正9。借助 cisTEM 软件包14 手动对运动校正后的显微照片进行初步筛选。 
	注意：自动采集的显微照片中约有 85% 质量良好，数据信号达到 3.7–5.2 Å 分辨率，该分辨率由 cisTEM 软件14 计算得出（补充图 S7A,B）。</li>
	<li>使用 RELION 3.0 软件包11 处理数据。
	<ol>
		<li>手动挑选刺突蛋白颗粒，并进行二维分类（补充图 S7C）。选取最佳的二维分类结果作为模板，利用 RELION 自动挑选工具从显微照片中自动挑选出 399,842 个单刺突蛋白颗粒11。 
		注意：在进行三维分类前，共进行了三轮二维分类（补充图 S8）。最终筛选出约 255,982 个单颗粒用于三维分类，数据集被分为六类。使用最佳类别进行最终的三维自动精修；通过三维分类共获得 85,227 个刺突蛋白颗粒。</li>
		<li>自动精修后，针对每个颗粒使用合适的电子束倾斜参数进行离焦精修，以提高分辨率。接着，使用 RELION 3.0 软件包11 对颗粒进行贝叶斯抛光。最后，使用经抛光后的颗粒集合，利用 RELION 3.011 再次进行一轮三维自动精修。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li>
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<li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li>
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<li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JADAS%3A+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li>
<li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li>
<li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li>
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<li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li>
</ol>

作者声明无任何竞争性或经济利益冲突。

Latitude-S 是一种直观的用户界面，可在两天内自动设置并采集数千张高分辨率显微图像或视频文件。它提供在载网上的便捷导航功能，并在从低倍率切换到高倍率时保持显微镜载物台的位置不变。使用 Latitude-S 进行数据采集的每一步都具有高时间效率，具备诸如简洁的用户界面、高达 4.5 GB/s 的快速数据流传输，以及在采集过程中同步显示数据等功能。此外，预先校准的剂量分率、剂量率、聚焦和放大倍率参数可轻松重新加载，从而快速启动新一轮的自动数据采集，节省时间。
在缺乏持续监控且不降低数据集质量的情况下自动获取数据，是一项具有挑战性且耗时的任务。当时间和资源受到重大限制时，尤其是疫情期间，使用 Latitude-S 软件进行自动化数据采集非常便捷。然而，在过去几个月中，已有多种 SARS-CoV-2 蛋白的冷冻电镜结构被解析，这将有助于制药公司开发疫苗。不同的实验室使用不同类型的自动数据采集软件包来收集数据。我们在有孔碳膜载网或自制的氧化石墨烯（GO）包被载网上，采用 K2 Summit DED 搭配 Latitude-S 进行冷冻电镜的自动数据采集<sup class="xref...

单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）已成为解析生物大分子高分辨率结构的主流结构生物学技术1。单颗粒重构依赖于获取大量玻璃态样品的显微图像，从中提取二维（2D）颗粒图像，并进一步用于重构生物大分子的三维（3D）结构2,3。在直接电子探测器（DED）出现之前，单颗粒重构所达到的分辨率通常在4至30 Å之间4,5。近年来，单颗粒冷冻电镜的分辨率已突破1.8 Å6。直接电子探测器（DED）和自动化数据采集软件是推动这一分辨率革命的主要因素7，使得数据采集过程中的人工干预降至最低。通常，冷冻电镜成像采用较低的电子剂量率（20–100 e/Å2），以尽量减少电子束对生物样品的辐射损伤，但这也会导致图像信噪比（SNR）较低。这种低信噪比限制了利用单颗粒分析方法解析生物大分子高分辨率结构的能力。
新一代电子探测器是基于CMOS（互补金属氧化物半导体）的探测器，能够克服这些与低信噪比相关的障碍。这类直接探测CMOS相机由于具备快速信号读出能力，因而具有更优的点扩散函数、适宜的信噪比以及优异的探测量子效率（DQE），适用于生物大分子的成像。直接探测相机在记录的图像中提供高信噪比8和低噪声，从而定量提升了探测量子效率（DQE）——即衡量探测器向图像中引入多少噪声的指标。这些相机还能以每秒数百帧的速度记录电影级图像，实现快速数据采集9,10。所有这些特性使快速直接探测相机非常适合低剂量应用。
采用运动校正后的堆叠图像进行数据处理，利用多种软件包（如 RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14 和 EMAN215）进行二维分类并重构大分子的三维密度图。然而，对于单颗粒分析，需要庞大的数据集才能获得高分辨率结构。因此，自动化的数据采集工具在数据收集过程中至关重要。为了记录大规模的冷冻电镜数据集，过去十年中已使用了多种软件包。目前已开发出多种专用软件用于自动化数据采集，包括 AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS 和 EPU。
这些软件包通过将低倍率图像与高倍率图像进行关联，利用常规任务自动寻找孔位，从而有助于在低剂量条件下识别具有适当冰层厚度的玻璃态冰孔位，以进行图像采集。这些软件包减少了重复性操作的数量，并通过连续数天不间断地采集大量高质量数据，显著提高了冷冻电镜数据采集的通量，且无需操作人员亲自在场。Latitude-S 是一种类似的软件包，用于单颗粒分析的自动化数据采集。然而，该软件包仅适用于 K2/K3 DED 探测器，并随这些探测器一并提供。
本方案展示了Latitude-S在配备200 keV冷冻电镜（参见材料表）的直接电子探测器上，对SARS-CoV-2刺突蛋白进行自动化图像采集的潜力。利用该数据采集工具，自动获取了3,000个SARS-CoV-2刺突蛋白的电影文件，并进一步进行数据处理，获得了分辨率为3.9–4.4 Å的刺突蛋白结构。

<table><tbody><tr><td>吸水纸</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>47000-100</td><td>电镜样品制备用品</td></tr><tr><td>样品胶囊</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9432 909 97591</td><td>电镜样品制备单元</td></tr><tr><td>样品盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1020863</td><td>电镜样品制备单元</td></tr><tr><td>C型夹</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td>电镜样品制备用品</td></tr><tr><td>C型夹插入工具</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9432 909 97571</td><td>电镜样品制备工具</td></tr><tr><td>C型夹环</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036173</td><td>电镜样品制备用品</td></tr><tr><td>电镜载网（Quantifoil）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q3100AR1.3</td><td>R 1.2/1.3 300目，金</td></tr><tr><td>辉光放电仪</td><td>Quorum</td><td>N/A</td><td>Quorum GlowQube 辉光放电仪</td></tr><tr><td>K2 DED</td><td>Gatan Inc.</td><td>N/A</td><td>冷冻电镜数据采集设备（相机）</td></tr><tr><td>Latitude S 软件</td><td>Gatan Inc.</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>上样站</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1130698</td><td>电镜样品制备单元</td></tr><tr><td>Talos 200 kV Arctica</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>N/A</td><td>冷冻电子显微镜</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>电镜样品制备单元</td></tr></tbody></table>

适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

近年来，单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）在技术和方法学上的进步为生物大分子的高分辨率结构解析开辟了新的途径。尽管冷冻电镜技术取得了显著进展，单颗粒分析流程的各个方面仍有改进空间。单颗粒分析需要一个合适的软件包来实现高通量的自动数据采集。在过去八年中，已开发出多种用于单颗粒冷冻电镜自动成像的自动数据采集软件。本文介绍了一种在低剂量条件下对玻璃态生物分子进行全自动图像采集流程的应用。
该软件包能够全自动且精确地采集冷冻电镜数据。此外，该软件包可轻松控制多种显微镜参数。本实验方案展示了该软件包在配备直接电子探测器（DED）的200 keV冷冻透射电子显微镜上，对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白进行自动化成像的应用潜力。在一次连续48小时的数据采集过程中，共获得了约3,000张冷冻电镜电影图像，最终解析出SARS-CoV-2刺突蛋白的原子分辨率结构。进一步的结构分析表明，该刺突蛋白主要存在两种构象：一种是单个受体结合域（1-RBD）朝上的开放构象，另一种是所有受体结合域（RBD）朝下的闭合构象。

在当前的疫情形势下，冷冻电镜（cryo-EM）在解析SARS-CoV-2多种蛋白质结构方面发挥着关键作用26,27,28,29，有助于推动针对该病毒的疫苗和药物研发。面对2019冠状病毒病，亟需在有限的人力资源条件下加快科研进程。单颗粒冷冻电镜中的数据采集是大分子结构解析中耗时但至关重要的步骤。近年来，冷冻电镜自动数据采集技术的发展已显著减少数据收集过程中的人为干预。Latitude-S软件是一种重要的自动数据采集软件包，本研究中用于纯化后的SARS-CoV-2刺突蛋白的自动化数据采集。
使用配备K2 Summit DED的200 keV冷冻电镜对SARS-CoV-2刺突蛋白进行冷冻电镜数据采集。在网格上具有理想冰层厚度和颗粒分布的区域由人工手动标记。这些位置的标记与后台进行的数据采集同步完成。在已标记的位置，Latitude-...

单颗粒冷冻电子显微镜技术需要合适的软件包和用户友好的流程，以实现高通量的自动数据采集。本文介绍了完全自动化的图像采集软件包Latitude-S及其在低剂量条件下收集玻璃态生物大分子数据的实际操作流程。

在过去的几年中，单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）在技术和方法学上的进步为……开辟了新的途径

自动数据采集软件对于收集大量冷冻数据以进行生物大分子结构表征极为必要。本研究使用自动数据采集软件包对多种与病原体生物学直接相关的生物大分子结构进行了表征，例如分枝杆菌、HIV 和 SASCO 2。首先，从开始菜单中点击 DigitalMicrograph，启动 Latitude-S 自动化数据采集软件。接着，选择技术管理器（Technique Manager），然后选择用于单颗粒自动化数据采集的 Latitude-S 图标。若要基于先前会话的设置创建新会话，请在面板中勾选“基于先前会话”复选框，然后点击“新建”按钮；若要继续现有的会话，则点击“继续”按钮。要开始一个全新的会话，请点击调色板中的新建标签。选择包含要继续的会话的文件夹，并指定用于保存数据的文件夹。接下来，点击设置图标，在出现的受管状态浏览框中添加状态，设置透射电子显微镜（TEM）条件、相机条件以及图像或库存选项。然后，命名该状态或打开状态设置摘要以保存设置。接下来，通过单击 Atlas 状态调色板来配置 Atlas 状态，设置放大倍数、照明条件和相机曝光时间等参数，然后单击下一步以进入下一个状态。接着，通过单击网格状态调色板来配置网格状态，设置显微镜成像光学参数、照明条件和相机曝光时间等参数，然后单击下一步。通过点击孔洞调色板配置孔洞状态，并设置成像光学参数、照明条件、像素合并（binning）以及相机曝光时间参数。点击“下一步”后，通过点击聚焦调色板配置下一个聚焦状态，并设置显微镜的成像光学参数、照明条件、像素合并和相机曝光时间。随后聚焦于孔洞附近的无定形碳区域，然后点击“下一步”进入下一状态。通过点击数据调色板配置数据状态，并设置显微镜参数，然后点击下一步。在给定的选项卡中，点击对焦配置调色板，指定离焦值的范围及步长，然后按下下一步按钮进入下一个步骤。对准网格上需要的特征，并点击捕获按钮。然后将红十字标记放置在不同状态图像的同一特征位置上。首先处理聚焦（Focus）、数据（Data）和孔（Hole）状态，因为这些状态下的视野比图谱（Atlas）和网格（Grid）状态更大。接着，放大图谱和网格状态，将红十字标记放置在相同的特征位置上。要计算五个不同状态之间的位置和偏移，并将这些位置和偏移反映到输出窗口，请点击“计算”按钮。点击“捕获调色板”，根据需要选择图集的尺寸，以覆盖整个网格或部分网格。要捕获图集，请在图集上导航，并根据冰层厚度选择相应的网格方格。选择所需的网格方格后，点击“计划”按钮，并观察网格方格中的图块依次填充，表示每个网格方格已被捕获。点击“计划”按钮后，通过添加孔位位置来选择网格方格中的代表性孔。获取孔图像后，定义数据采集位置和对焦位置，并将该布局保存为模板。单击“自动查找”，输入孔径大小，然后在程序中单击“查找”按钮，系统将根据直径自动识别孔。设置强度以去除网格方格和冰污染中的孔。通过自动查找添加选定和黄色标记工具后，单击纬度任务中的“计划”按钮。根据使用 cisTEM 软件对运动校正后的显微照片进行的初步人工筛选，大部分数据均处于理想的信号范围内。此外，使用 cisTEM 对在不同离焦范围内采集的图像也进行了人工检查。 spike 颗粒通过人工挑选用于计算二维分类平均图像以进行结构可视化，结果强烈提示存在目标结构，但高分辨率结构表征仍需依赖相应的数据集来实现。三维分类结果显示，刺突蛋白有一个RBD处于向上开放构象，其余所有RBD均处于向下闭合构象。刺突蛋白的1RBD向上开放构象采用C1对称性进行重构。刺突蛋白图谱以侧面、顶部和底部视图展示。通过将原子结构拟合到电镜图谱中，可更清晰地观察侧链。RBD向下闭合构象采用C3对称性，并结合刺突蛋白三维优化模型及电镜图谱进行精修，原子结构拟合结果如图所示。刺突蛋白的中间构象被鉴定为S2亚结构域，其个体氨基酸残基的侧链得以显现。结果表明，Latitude-S 可以采集生物大分子的高分辨率冷冻电镜数据。该自动化数据采集软件可用于其他任何电子显微镜系统，以实现数据的自动采集。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用户友好型、高通量和全自动数据采集软件，用于单颗粒冷冻电子显微镜

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。...

使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

冷冻电子显微镜中的单颗粒分析是用于高分辨率解析生物大分子复合物结构的主要技术之一。Scipion...

冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

低温电子断层扫描中对大规模数据采集日益增长的需求，要求具备高通量的成像采集流程。本文所述方案实现了先进的采集策略的最新进展，旨在最大限度地提高断层扫描数据采集的时间效率和通量。...

冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台——cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion...

一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程

使用200 kV透射电子显微镜（TEM）也可获得大分子的高分辨率冷冻电镜图谱。本方案介绍了实现精确光学对中、数据采集策略以及成像区域选择的最佳实践，这些步骤对于利用200 kV...

使用200 kV透射电子显微镜常规采集高分辨率冷冻电镜数据集

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

本方案描述了一种通用且易于实施的冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据采集方法。该方法对于因样品吸附于气液界面而导致优势取向偏差的样本，尤其有助于获得高质量的电镜三维结构图。...

使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

本方案描述了一种利用冷冻电子断层扫描和三维图像处理技术测定膜蛋白结构的高通量方法。内容涵盖了样品制备、数据采集、数据处理与解析的详细步骤，并以HIV-1包膜糖蛋白作为该方法的代表性研究目标进行示例。这些计算处理流程的设计使得研究人员和学生能够远程开展工作，参与数据处理与结构分析。...

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

本文介绍了一种利用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子三维（3D）结构的方法。在本实验方案中，我们以HIV-1衣壳组装体为例，详细说明通过迭代螺旋实空间重构方法获得密度图的三维重建流程。...

利用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重构解析HIV-1衣壳组装体的结构

了解Latitude-S自动化数据采集软件在单颗粒冷冻电镜中的应用，实现生物大分子的高通量结构表征。该方法显著提升病原体相关蛋白质研究的效率与准确性。

适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

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