细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析
2022年2月14日
细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。
本方案提供了一种在细胞水平上分析细胞外囊泡（EVs）的可靠方法，以及一种高效检测EV摄取和追踪EV的实用技术。该EV标记方法避免了EV与染料的共沉淀，从而增强了EV信号。通过体积分析法测定EV的摄取，以区分细胞内化的EV与表面附着的EV。
细胞外囊泡（EVs）具有生物活性，因此其摄取可实现生物分子的转移。在基于细胞外囊泡的药物递送和癌症治疗研究中，该技术可作为评估工具。EVs的摄取在细胞间通讯中发挥重要作用，目前在癌症生物学、神经科学及药物递送等多个研究领域中被广泛研究。
该方案有望实现高效的细胞外囊泡（EV）摄取检测。为分离细胞外囊泡（EVs），将一毫升预处理的细胞培养基注入基于纳米过滤的微流控装置的样品室中。操作装置时，将装置置于台式离心机中，以3000 RPM转速离心10分钟。
离心后，通过移液或抽吸方式从废液室中移除液体，然后重复此步骤两次，以处理额外的两毫升细胞培养基。接下来，为了洗涤分离得到的EVs，向样品室中加入一毫升PBS，并将装置放入台式离心机中离心。对于EVs的免疫荧光标记，将一微克每毫升的EV特异性抗体加入含有100微升分离EVs的装置洗脱孔中。
然后将样品置于平板摇床上避光孵育一小时，以确保抗体在样品中均匀分布。接着，将粘性胶带贴在洗脱孔上。向样品室注入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）以洗去残留的抗体，随后离心装置直至样品室完全排空。
通过向样品室注入另一毫升 PBS，重复洗涤步骤，并按照之前的方法旋转装置。从样品室中移除残留液体后，用移液器将膜室中荧光标记的 EVs 转移至棕色管或微量离心管中。避光保存，直至使用。
将4 × 10⁴个PC3细胞接种至含1毫升培养基的35毫米培养皿中。在最佳细胞培养条件下孵育过夜，使细胞贴壁。次日，用外泌体耗竭培养基洗涤贴壁细胞两次。
使用无外泌体培养基将荧光标记的EVs稀释至适当浓度后，将稀释后的EVs加入已贴壁的靶细胞中，并在所需的实验时间内进行孵育。通过用无外泌体培养基洗涤细胞三次以去除未被内化的EVs后，使用每毫升1微克的CMTMR对贴壁细胞的细胞质进行标记，并在最佳细胞培养条件下孵育。对于活细胞成像，将制备好的细胞置于载物台孵育器中。
根据对照样本设定成像参数后，确定目标细胞的深度以及Z方向上的堆叠范围，以获取三维共聚焦图像，然后同时对细胞特异性染料和EV特异性染料设置多Z层堆叠图像的采集。对于图像处理，使用自动图像处理软件。为构建细胞的虚拟表面，点击“添加新表面”（Add new Surfaces）。
为配置虚拟细胞表面，点击“添加”按钮，并选择“质量”作为过滤类型。通过目视检查设定低限的适当阈值，将上限设为最大值，然后点击“完成”按钮。接下来，为构建细胞外囊泡（EVs）的虚拟点，点击“添加新点”按钮。在算法设置下，选择“不同点大小”和“最短距离计算”，然后点击“下一步”，并选择通道1 Alexa Fluor 488 作为源通道。
在“斑点检测”下输入估计的 XY 直径的适当值，然后单击“下一步”。要配置虚拟 EV 斑点，请单击“添加”按钮并选择“质量”作为过滤器类型。通过目视检查设置下限阈值，然后单击“下一步”。对于“斑点区域类型”，选择“绝对强度”，然后单击“下一步”。
为了对细胞外囊泡（EV）点状区域进行阈值分割，需通过目视检查输入合适的“区域阈值”值。在“区域体积”下选择“直径”，然后点击“完成”。若要分割已构建表面内聚集的斑点，请点击“构建斑点”并进入“滤镜”选项。
接下来，点击“添加”按钮，选择“到表面的最短距离”作为滤器类型，并设置下限的最低阈值和上限的适当值，然后点击“将选定部分复制到新斑点”按钮。为自动计数细胞内的EVs，请点击“构建斑点1”选择项，进入“统计”模块，导出“斑点总数”中的数值。
为获得细胞数量，单击“构建表面 1”，然后进入“统计”部分，导出“总体”中的“表面总数”数值。最后，转到“统计”下的“详细”选项卡以导出体积。使用基于纳米过滤的微流控装置从PC3细胞培养基中分离的细胞外囊泡（EVs），用荧光素-4标记的EV特异性抗体进行标记，并通过三维共聚焦显微镜进行观察。
内化的细胞外囊泡（EV）呈现为点状结构，单个EV可通过图像的后期处理实现可视化，并对细胞内化EV的数量进行定量分析。EV摄取实验结果表明，EV的摄取水平依赖于孵育时间的长短。可通过将内化EV的数量标准化至受体细胞体积，以确定特定细胞对EV的实际摄取速率。
该实验步骤可系统性地排除未被内化的细胞外囊泡（EVs），从而精确定量被内化的EVs数量。此处展示了被内化EV颗粒的尺寸分布。因此，关键步骤包括利用微流控装置对EVs进行标记、在观察荧光标记EVs时最大限度降低背景荧光，以及成像后的分析以区分内化与表面附着的EVs。
因此，可以在三维平面上实时进行细胞内EV的追踪，此外，还可实现对EV在时空分辨率下的运输分析以及EV与亚细胞器的共定位分析。因此，我们认为该技术为细胞通讯领域的EV研究者提供了一种更简便、更高效的方法，用于研究细胞内和细胞外基质中的EV。
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概述
本研究旨在解决有效检测细胞摄取细胞外囊泡（EVs）的可视化与定量分析方法的需求。通过利用基于纳米过滤的微流控装置以及共聚焦显微镜进行三维荧光成像，该实验方案可实现对EV摄取过程的分析，从而为细胞间通讯机制提供深入见解。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡（EVs）
- 细胞间通讯
- 癌症生物学与药物递送
背景
- 细胞外囊泡（EV）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥着关键作用。
- 亟需实用的方法学来检测EV的摄取。
- 理解EV的动态行为有助于推动其在治疗中的应用。
使用的方法
- 通过共聚焦显微镜进行三维荧光成像
- 以PC3细胞作为模型系统
- 基于纳米过滤的微流控装置用于EV分离
主要结果
- 使用体积分析法对内化的细胞外囊泡（EVs）进行定量。
- 证明了摄取水平依赖于孵育时间。
- 系统性排除非内化的EVs可提高定量准确性。
结论
- 该研究提供了一种可靠的分析细胞外囊泡摄取的实验方案。
- 该方法对癌症治疗和药物递送领域的研究具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
细胞外囊泡（EV）摄取的定量分析对于降低细胞通讯假说的风险以及推进基于EV的治疗策略至关重要。该共聚焦成像检测方法能够精确区分内化与表面附着的EV，从而在早期发现和转化研究中提供可靠的预测依据。该方法通过提供稳健且可重复的摄取定量指标，支持候选分子的评估，进而增强研发管线的决策能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够对细胞外囊泡（EV）介导的细胞间信号通路进行严谨探究。
- 通过区分真正的细胞摄取与表面结合，支持生物学风险降低。
- 提供定量的摄取数据，以支持靶点验证和机制研究。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化、可重复的三维共聚焦成像输出，用于检测方法开发。
- 有助于制备经过验证的细胞系统，用于后续化合物筛选。
- 实现高内涵、定量的检测读数，适用于可扩展的筛选工作流程。
转化与临床前研究
- 将细胞外囊泡（EV）摄取量化的研究与肿瘤学及药物递送领域的疾病相关模型相统一。
- 通过实现对EV运输的实时追踪与空间分析，支持转化研究的连续性。
- 为基于EV的治疗候选物的风险评估与推进提供数据支持。
流程与工作流整合
该检测方法融入了从发现到临床前研究的连续过程，架起了早期机制研究与基于细胞外囊泡（EV）的治疗手段转化评估之间的桥梁。
- 发现生物学：定量分析细胞外囊泡（EV）的内化过程，以阐明细胞间通讯机制。
- 筛选：提供可重复、定量的摄取数据，用于评估检测方法的准备状态及化合物效果。
- 分析：生成体积和空间数据，用于比较不同实验条件下的摄取情况。
- 转化研究：实现在与疾病相关的细胞系统中对细胞外囊泡（EV）进行实时三维追踪。
- 企业级复用：建立可跨细胞类型和研究项目灵活适配的标准操作流程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高细胞外囊泡摄取研究的预测可信度，减少不确定性。
- 操作价值：增强研发团队在检测方法上的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为基于细胞外囊泡的研发项目提供决策依据，优化资源配置。
- 组合影响：支持对靶向细胞外囊泡的治疗项目进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜操作经验及高级图像分析软件使用能力。
- 需要配备微流控EV分离装置和荧光标记试剂。
- 需要跨团队对成像和分析参数进行标准化。
- 经适当优化标记和成像条件后，可适用于多种细胞系。
- 准确量化依赖于有效排除未被内化的EV。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:15
Extracellular Vesicle (EV) Isolation and On-Chip Immuno-Fluorescent Labeling
2:54
Incubation of the Cells with Fluorescently Labeled EVs for the EV-Uptake Assay
3:45
Confocal Microscopy and Image Processing
6:28
Results: EV Uptake Assay Using 3D Fluorescence Imaging via Confocal Microscopy
7:31
Conclusion
