用于结核病宿主导向疗法临床前测试的自动化培养系统

本方案的主要优势在于，与传统的通过计数菌落形成单位来评估结核分枝杆菌胞内生长的方法相比，该方法更省时省力。该技术使研究人员能够更便捷地快速筛选经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，旨在将其重新定位为用于治疗结核病的宿主导向疗法。该方法非常简单直接。

掌握分枝杆菌和EO载体T细胞培养技术的基础知识，即可逐步遵循本方案。首先，将六到八毫升来自T25培养瓶的减毒分枝杆菌H37Ra培养物转移至一个15毫升聚丙烯管中。随后将该管在台式离心机中离心。

小心取出离心管后，将其转移至生物安全柜中，静置一分钟，使细菌沉降。将上清液倒入含消毒液的废液容器中。然后盖上管盖，轻轻敲击管壁使细菌在残留的培养基中重新悬浮，再静置一分钟使细菌沉降。

加入2毫升预热的完全RPMI培养基并混匀，转移至50毫升锥形管中。用带有25号针头的5毫升注射器吸取分枝杆菌悬液，以重悬菌体。然后沿管壁极轻柔地推出悬液，以尽量减少气溶胶产生，重复此操作6到8次。

将针头和注射器丢弃至生物安全柜中的锐器容器内。将悬液转移至一个 2 毫升微量离心管中，离心以沉淀残留的团块。将离心管放回安全柜中，静置一分钟使细菌沉淀。

将上清液的上层1至1.5毫升转移至新管中。将含有消毒剂的废液桶中的原管丢弃。充分混匀后，向两个凹玻片的孔中加入不同量的分枝杆菌悬液，并在37摄氏度下孵育3小时。

用移液器轻轻吹打三次以去除未被吞噬的细菌后，移除玻璃培养皿中的培养基。用两毫升 PBS 清洗一次。将保存在负20摄氏度的 PBS 中含4% PFA 的分装样品解冻。

将等分试样稀释至2%PFA，并向每孔加入两毫升。室温孵育10分钟后，将玻片从安全柜中取出进行染色。将PFA弃入PFA化学废液容器中，并用轻柔的自来水流冲洗玻片。

使用塑料移液管，加入足量的金胺染料以覆盖载玻片上的细胞，并在室温避光条件下孵育1分钟。用自来水洗去多余的染料，然后在避光条件下加入淬灭剂作用1分钟。洗去多余淬灭剂后，在室温避光条件下用Hoechst染色液孵育15分钟。

然后洗去 Hoechst 染料。除去多余水分后，加入一滴抗荧光淬灭剂和盖玻片。使用 100x 油镜在荧光显微镜下观察风干的载玻片。

在Fitz滤光镜下，分枝杆菌会发出绿色荧光，细胞核在DAPI滤光镜下会发出蓝色荧光。计数每个细胞吞噬的分枝杆菌数量以及感染细胞的百分比，以确定感染复数（MOI）。根据培养板中孔的表面积，计算为达到所需MOI所需的分枝杆菌悬液体积。

混匀分枝杆菌悬液后，将计算好的体积加入12孔板中的细胞，以达到所需的感染复数（MOI）。在37°C下孵育3小时，使分枝杆菌被吞噬。随后用温热的RPMI多次洗涤孔板，以去除细胞外细菌。

向三小时样本的一个孔中加入500微升裂解缓冲液，作用10分钟以裂解巨噬细胞，并收集裂解液以确定基础感染率。然后向其余孔中加入新鲜的完全RPMI培养基以及所需的药物剂量或对照溶剂。根据实验设计，将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育1至8天。

为了确定三小时样本初始接种物的阳性时间百分比（TTP），将Middlebrook肉汤和仪器培养瓶置于室温下回温。将12孔板中的培养基转移至相应标记的锥形管中，并向每孔加入500微升无菌裂解缓冲液。10分钟后，用无菌细胞刮棒轻轻刮下孔中的细胞，并将其与相应锥形管中的培养基混合。

用0.5毫升无菌PBS洗涤孔板，与培养基和裂解液混合后，将每个样品轻轻通过25号针头注射器6至8次，以打散团块。取100微升样品加入900微升MB肉汤中进行稀释，并在孵育期间按所需时间点重复收获过程。用70%酒精对橡胶帽进行消毒，以准备仪器簇瓶。

将所有样品所需的营养补充剂转移至一个锥形管中，使用针头和注射器向仪器培养瓶中注入0.5毫升营养补充剂。然后，用移液器吸取500微升1:10稀释的样品至1毫升V型底试管中。使用针头和注射器将500微升样品注入指定的仪器培养瓶中。

将瓶子从生物安全柜小心转移至仪器装载位置后，按下自动微生物检测系统上的装载按钮。扫描仪器培养瓶上的条形码，并将瓶子放入检测系统的37摄氏度培养箱中，最长培养42天。从仪器屏幕读取并记录达到阳性所需的时间，计算TTP百分比。

阳性TTP表明分枝杆菌生长。自动液体培养仪器每10分钟监测一次二氧化碳水平，并计算TTP，即从接种到培养物被标记为阳性之间的天数。初始接种物中CFU的log(10)值与TTP之间呈现出反比关系。

通过菌落形成单位（CFU）计数法测定的结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长情况与所述的自动化培养方法进行比较时，两者结果之间表现出显著相关性。结核分枝杆菌的生长通过图形化方式呈现，即比较巨噬细胞感染后最多八天内的TTB值与初始TTP值。CFU与液体培养均显示出相似趋势：在溶液中的全反式维甲酸（AtRA）或等剂量封装于PLGA微粒中的AtRA存在条件下，结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长受到显著抑制。

在感染的 THP-1 细胞中进行了剂量-反应实验，以评估抗生素利奈唑胺单独使用或与干扰素γ联合使用的疗效。未观察到药物之间存在显著的相互作用。AFP染色使我们能够使用较低的感染复数（MOI）来最小化巨噬细胞感染时的细胞死亡，并确保无论采用何种处理条件均使用相同的MOI。

通过本方案，可鉴定出主要的抗结核药物，并进一步研究其在体内的有效性。