测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

细胞凋亡的启动由caspase在标志性的分子平台上被激活所介导。本文介绍了关键的起始性细胞死亡复合物DISC的检测方法，该复合物作为caspase-8激活的平台。该技术的优势在于，能够检测DISC复合物的组装过程及其组成成分，同时提供caspase-8在此复合物中加工活化的相关信息。

实验开始时，选择贴壁且融合度达到80%至90%的细胞。弃去培养基，向贴壁细胞中加入新鲜培养基。然后通过将培养板倾斜，用移液器将选定浓度的CD95L加入培养基中，注意不要接触贴壁细胞，从而刺激细胞。

为收获细胞，将细胞培养皿置于冰上。向细胞悬液中加入 10 毫升预冷的 PBS，刮下贴壁细胞。将细胞悬液收集至 50 毫升离心管中。

用 10 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞培养皿两次，并将洗涤液加入同一个 50 毫升离心管中。然后在 4°C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，用 1 毫升预冷的 PBS 重悬细胞沉淀。

然后将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。离心细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于1毫升预冷的PBS中。再次离心一次，随后将细胞沉淀重悬于1毫升裂解缓冲液中，置于冰上孵育30分钟。

孵育后，在4°C条件下以最大速度离心裂解液15分钟，然后将上清液转移至洁净的离心管中。弃去沉淀，并另取50 µL裂解液样品于其他离心管中，用于测定蛋白浓度。进行免疫沉淀时，向裂解液中加入2 µL抗APO1抗体和10 µL预先制备的Protein A Sepharose微珠。

取10 µL磁珠单独加入另一管含有裂解液的试管中，作为磁珠对照。将含有裂解液、抗体和Protein A Sepharose磁珠的混合物在4°C轻柔混匀条件下孵育过夜。次日，在4°C以500 ×g离心4分钟。

弃去上清液后，加入一毫升冷的 PBS 洗涤磁珠，离心后弃去上清液。此步骤至少重复三次。最后一次 PBS 洗涤弃去后，最好使用 50 微升 Hamilton 注射器吸出磁珠。

进行 Western 印迹实验时，向珠子中加入 20 微升 4X 上样缓冲液，在 95 摄氏度下加热 10 分钟。同时，将裂解液对照样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。将裂解液、免疫沉淀物以及蛋白标准品上样至 12.5% SDS 凝胶中，并以 80 伏恒定电压电泳运行。

凝胶电泳完成后，将SDS凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。转移完成后，将膜放入盒中，加入封闭液，在温和振荡条件下孵育1小时，随后用PBST洗涤膜3次，每次5分钟。为检测蛋白质，按指定稀释比例加入一抗，于4摄氏度在温和振荡条件下孵育过夜。

第二天，用 PBST 缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟，然后在室温下轻轻摇动，将膜与 20 毫升二抗溶液孵育一小时。再次用 PBST 缓冲液洗涤膜三次。弃去最后一次的 PBST 洗涤液后，向膜上加入约一毫升辣根过氧化物酶底物，并检测化学发光信号。

用CD95L刺激宫颈癌HeLa-CD95细胞后，通过CD95免疫共沉淀检测到高水平的CD95死亡诱导信号复合物（DISC）形成。在这些CD95免疫共沉淀物中检测到CD95、FADD、前体caspase-8、前体caspase-10和c-FLIPS，表明DISC有效形成。同时在免疫共沉淀物中检测到p43-FLIP和p22-FLIP的裂解产物，提示caspase-8已被激活。

使用过表达c-FLIP长型的HeLa-CD95细胞分析CD95死亡诱导信号复合物（DISC）的形成。与亲本HeLa-CD95细胞类似，在未经CD95L处理的这些细胞的免疫共沉淀实验中，未检测到FADD、前体caspase-9、前体caspase-10、c-FLIP蛋白以及PARP1的招募。在抗CD95免疫共沉淀实验中，活化的原代T细胞表现出高水平的CD95、FADD、前体caspase-8、前体caspase-10以及c-FLIPS。

该技术可用于分析死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，包括 DISC 上 caspase-8 的活化过程。所有洗涤步骤均至关重要。此外，刺激时间点和孵育时间应严格控制。

这是测量DISC复合物上组装情况的唯一方法。然而，要检测caspase-8的活化，也可以采用caspase-8活性检测实验。该方法使我们对细胞凋亡启动机制获得了新的认识。