Name: 测量CD95死亡诱导信号传导复合物的组成和该复合物中Procaspase-8的处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 了解检测CD95死亡诱导信号传导复合物组成及Procaspase-8处理的方法。该技术通过免疫沉淀和Western blot分析细胞凋亡起始机制，为研究细胞死亡通路提供重要工具。

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我们感谢威廉·桑德基金会（Wilhelm Sander-Foundation，项目编号：2017.008.02）、由欧盟区域发展基金（European Regional Development Fund，ERDF）和德国研究基金会（DFG，项目编号：LA 2386）资助的动态系统中心（Center of Dynamic Systems，CDS）对本研究工作的支持。感谢Karina Guttek在实验方面给予的支持。感谢Dirk Reinhold教授（OvGU，马格德堡）为我们提供原代T细胞。

&#8203;T细胞实验根据伦理协议42502-2-1273 Uni MD进行。
1. 实验前细胞的准备
注意：本免疫沉淀实验的细胞平均数量为 1 × 107。 贴壁细胞需在实验前一天接种，以确保实验当天细胞数量达到 1 × 107 个&#160;。
<ol>
	<li>准备实验用贴壁细胞
	<ol>
		<li>实验开始前一天，将每种条件下 5-8 × 106 个贴壁细胞接种于 20 mL 培养基（培养基成分见材料表）中，置于 14.5 cm 培养皿中。</li>
		<li>实验当天，确保细胞贴壁良好且融合度达到 80-90%。弃去原培养基，为贴壁细胞更换新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备实验用悬浮细胞
	<ol>
		<li>实验开始前立即在每种条件下，将 1 × 107 个悬浮细胞小心加入含 10 mL 培养基（培养基成分见材料表）的 14.5 cm 培养皿中。</li>
		<li>若使用原代细胞，按照先前描述的方法21分离原代 T 细胞。用 1 µg/mL 植物血凝素处理原代 T 细胞 24 小时，随后用 25 U/mL IL2 处理 6 天。</li>
		<li>实验开始前立即在每种条件下，将 1 × 108 个原代 T 细胞小心加入含 10 mL 培养基（培养基成分见材料表）的 14.5 cm 培养皿中。 
		&#8203;注意：建议使用较高数量的原代 T 细胞，因为这些细胞体积较小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CD95L 刺激
<ol>
	<li>用CD95L刺激细胞（CD95L可按先前所述方法制备20，或使用 commercially available 产品（参见材料表））。 
	&#8203;注意：CD95L的浓度和刺激时间取决于细胞类型13,15,22,23,24,25。每种刺激条件需设置两个重复，以平行制备“磁珠对照”样本。
	<ol>
		<li>用选定浓度的CD95L刺激贴壁细胞。将培养板倾斜，用移液器将配体加入培养基中，避免接触贴壁细胞。</li>
		<li>通过将配体溶液加入细胞悬液中，用CD95L刺激悬浮细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞收获与裂解
<ol>
	<li>将细胞培养皿置于冰上。 
	注意：不要丢弃培养基。死亡的细胞会漂浮在培养基中，对后续分析至关重要。</li>
	<li>向细胞悬液中加入 10 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS），刮下贴壁细胞，并将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>用 10 mL 冷的 PBS 洗涤细胞培养皿两次，将洗涤液一并加入同一 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 1 mL 冷的 PBS 重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 冷的 PBS 重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 裂解缓冲液（含 4% 蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以最大转速（约 17,000 × g）离心裂解液 15 分钟。</li>
	<li>将上清液（裂解液）转移至洁净离心管中，弃去沉淀。另取 50 µL 裂解液至新管中，通过 Bradford 法测定蛋白浓度，并取相当于 25 µg 蛋白的裂解液体积置于一离心管中。加入上样缓冲液（组成见材料表），作为裂解液对照，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
4. 免疫沉淀（IP）
<ol>
	<li>向裂解液中加入 2 µL anti-APO-1 抗体和 10 µL protein A sepharose beads（按制造商推荐方法制备）。另取一管含有裂解液的样品（刺激样品），仅加入 10 µL beads，作为“bead control”。 
	注意：在操作 protein A sepharose beads 时，应使用宽口移液枪头，可通过剪切枪头末端或购买专用于免疫沉淀的特殊枪头实现。</li>
	<li>将裂解液与抗体/protein A sepharose beads 混合物在 4 °C 轻柔混匀条件下孵育过夜。在 4 °C、500 × g 条件下离心 4 分钟，分离裂解液中的抗体/protein A sepharose beads 复合物。弃去上清液，向沉淀中的 beads 加入 1 mL 冷 PBS，重复洗涤至少三次。</li>
	<li>弃去上清液。建议使用 50 µL Hamilton 注射器吸取 beads。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>向珠子中加入 20 µL 4x 上样缓冲液（缓冲液成分见材料表），在 95 °C 加热 10 分钟。将裂解液对照样品在 95 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>将裂解液、免疫沉淀样品（IP）以及蛋白标准品上样至 12.5% 十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶（凝胶制备方法见材料表），以 80 V 恒定电压电泳运行。</li>
	<li>将 SDS 凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。 
	注意：此处采用针对目标蛋白优化的半干转印法，转印时间为 12 分钟（25 V；2.5 A，恒流）。在进行 Western 印迹前，将硝酸纤维素膜和两组小型转印夹心结构浸泡于电泳缓冲液中数分钟（缓冲液成分见材料表，按生产商说明书配制）。</li>
	<li>将转印后的膜放入盒中，用封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 PBST 缓冲液（即含 0.1% Tween-20 的 PBS））在室温下封闭 1 小时，并在轻微振荡条件下孵育。</li>
	<li>用 PBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹检测
<ol>
	<li>按照指定稀释比例（参见材料表）将第一种一抗加入膜中，并在 4 °C 条件下轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>用 PBST 洗涤膜三次，每次洗涤 5 分钟。</li>
	<li>将膜与 20 mL 二抗（按 1:10,000 比例稀释于 PBST + 5% 脱脂奶粉中）在室温下轻柔振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBST 洗涤膜三次，每次洗涤 5 分钟。</li>
	<li>弃去 PBST，向膜上加入约 1 mL 辣根过氧化物酶底物。</li>
	<li>检测化学发光信号（参见材料表）。 
	注意：曝光时间和采集图像的数量取决于细胞中蛋白的含量以及所用抗体的特异性。需针对每种用于检测的抗体通过实验经验确定。</li>
</ol>

<ol><li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD95%2FFas+signaling+at+the+DISC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li>
<li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+and+death+in+peripheral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li>
<li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li>
<li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms%2C+caspase-8%2Fa+and+caspase-8%2Fb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li>
<li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD%3ACaspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex%3A+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li>
<li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+%5B2%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li>
<li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8%2C+p30%2C+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li>
<li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling%3A+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li>
<li>Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+%28c-FLIPs%29%3A+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li>
<li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-FLIPR%2C+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8%3A+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li>
<li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li>
<li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li>
<li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8%2Fc-FLIPL+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li>
<li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li>
<li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li>
<li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC%3A+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li>
<li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+threshold+signaling%3A+Triggering+of+CD95+%28FAS%2FAPO-1%29+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li>
<li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li>
<li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis%3A+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li>
<li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23(2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方法最初由 Kischkel 等人描述27，此后已由多个研究团队成功完善。为高效进行 DISC 免疫沉淀并监测该复合物中 caspase-8 的加工过程，需考虑若干关键问题。
首先，在免疫共沉淀过程中必须严格遵循所有洗涤步骤。其中，Sepharose珠的最后洗涤步骤以及珠子的干燥尤为关键。正确执行这些步骤可提高免疫共沉淀的信噪比，从而能够检测到caspase-8在DISC上的募集和加工过程。值得注意的是，对于质谱等高度敏感的分析技术，加入一个&#34;预清除步骤&#34;（即在仅含Sepharose珠或同型对照抗体的条件下孵育裂解液）也可能有助于降低背景噪声。然而，已有多个研究表明，该预清除步骤对于通过Western blot检测caspase-8向DISC的募集并非必需7,23。但如前所述，免疫共沉淀结束时对珠子的充分洗涤对于获得可靠结果至关重要。细胞中高丰度蛋白与Sepharose珠的非特异性结合会显著削弱核心D...

研究最为深入的死亡受体（DRs）之一是CD95（Fas，APO-1）。外源性凋亡通路始于死亡受体与其同源配体的相互作用， 即， CD95L 与 CD95 相互作用，或 TRAIL 与 TRAIL-Rs 结合，导致在相应死亡受体（DR）处形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC 由 CD95、FADD、前体半胱天冬酶-8/-10（procaspase-8/-10）和 c-FLIP 蛋白组成。1,2此外，死亡诱导信号复合物（DISC）由含有死亡结构域（DD）的蛋白质（如CD95和FADD）与含有死亡效应结构域（DED）的蛋白质（如FADD、前体caspase-8/-10和c-FLIP）之间的相互作用组装而成。图1。前体caspase-8发生寡聚化 通过 其DED结构域的结合，导致DED纤维的形成，随后激活并剪切前体caspase-8。这会触发caspase级联反应，最终导致细胞死亡（图1)3,4因此，前体caspase-8是CD95或TRAIL-R介导的外源性凋亡通路中的关键起始caspase，可在相应的大型分子复合平台DISC上被激活。
已知有两种procaspase-8的同工型，即procaspase-8a（p55）和procaspase-8b（p53），可被招募至DISC5。这两种同工型均包含两个DED结构域。DED1和DED2位于procaspase-8a/b的N端区域，其后依次为催化亚基p18和p10结构域。对procaspase-8的DED结构域进行的高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析揭示，procaspase-8蛋白可组装成称为DED纤维的丝状结构4,6。最初研究认为，线性排列的procaspase-8链通过二聚化参与并在DISC处激活procaspase-8。然而目前研究表明，这些线性链仅是procaspase-8 DED纤维的亚结构，完整的DED纤维由三条链组装成三螺旋结构3,4,6,7。
在DED纤维上发生二聚化后，前体半胱天冬酶-8a/b发生构象变化，导致前体半胱天冬酶-8活性中心的形成及其激活3,8随后是由介导的procaspase-8加工处理 通过 两条通路：第一条通路走向 通过 p43/p41切割产物的生成以及第二个产物 通过 p30切割产物的初始生成。p43/p41通路由procaspase-8a/b在Asp374位点的切割启动，产生p43/p41和p12切割产物（图2。此外，这些片段在 Asp384 以及 Asp210/216 位点发生自催化裂解，从而形成具有活性的半胱天冬酶-8 异源四聚体 p102/p1829,10,11此外，研究显示，在p43/p41加工途径的同时，procaspase-8a/b也在Asp216位点被切割，产生C末端切割产物p30，随后该产物进一步发生蛋白水解，生成p10和p1810 (图2).
DED 丝状结构中 procaspase-8a/b 的激活受到一类名为 c-FLIPs 的蛋白质的严格调控12。c-FLIP 蛋白存在三种异构体：c-FLIPLong（c-FLIPL）、c-FLIPShort（c-FLIPS）和 c-FLIPRaji（c-FLIPR）。这三种异构体的 N 末端区域均含有两个 DED 结构域。c-FLIPL 还具有一个 C 末端的催化失活的类半胱天冬酶结构域12,13。两种短型异构体 c-FLIPS 和 c-FLIPR 通过破坏 DISC 处的 DED 丝状结构形成，发挥抗凋亡作用6,14,15。此外，c-FLIPL 能够以浓度依赖的方式调控 caspase-8 的激活，从而产生促凋亡或抗凋亡效应16,17,18。通过形成具有催化活性的 procaspase-8/c-FLIPL 异源二聚体，c-FLIPL 可促进 procaspase-8 活性中心的稳定及其激活。c-FLIPL 的促凋亡或抗凋亡功能直接取决于其在 DED 丝状结构中的含量以及所形成的 procaspase-8/c-FLIPL 异源二聚体的数量19。在 DISC 中，低或中等浓度的 c-FLIPL 可在 DED 丝状结构上形成足够数量的 procaspase-8/c-FLIPL 异源二聚体，从而促进 caspase-8 的激活；相反，c-FLIPL 含量升高则直接导致其在 DISC 处发挥抗凋亡作用20。
综上所述，前体caspase-8a/b在DISC上的活化和加工是一个涉及多个步骤的高度调控过程。本文讨论了直接在DISC上检测前体caspase-8加工的方法，以及对该复合物组成成分的分析。本文将以CD95 DISC作为死亡受体复合物的典型示例进行阐述。

<table><tbody><tr><td>12.5% SDS 凝胶</td><td>自制</td><td></td><td>用于两块分离胶：&lt;br/&gt; 3.28 mL 蒸馏水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2.5 mL Tris；pH 8.8；1.5 M&lt;br/&gt; 4.06 mL 丙烯酰胺&lt;br/&gt; 100 &amp;micro;L 10% SDS&lt;br/&gt; 100 &amp;micro;L 10% APS&lt;br/&gt; 7.5 &amp;micro;L TEMED&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 用于两块收集胶：&lt;br/&gt; 3.1 mL 蒸馏水 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 1.25 mL Tris；pH 6.8；1.5 M&lt;br/&gt; 0.5 mL 丙烯酰胺&lt;br/&gt; 50 &amp;micro;L 10% SDS&lt;br/&gt; 25 &amp;micro;L 10% APS&lt;br/&gt; 7.5 &amp;micro;L TEMED</td></tr><tr><td>14.5 cm 细胞培养皿</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Carl Roth</td><td>A124.1</td><td></td></tr><tr><td>带高回收率滤芯和宽孔径的气溶胶滤芯吸头</td><td>VWR</td><td>46620-664（北美）或 732-0559（欧洲）</td><td>用于将珠子移液至裂解液</td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2103</td><td>稀释比例：PBST 中 1:4000，加 NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗APO-1抗体</td><td>由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 Enzo 购买</td><td>ALX-805-038-C100</td><td>仅用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>抗-caspase-10 抗体</td><td>Biozol</td><td>MBL-M059-3</td><td>稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗-caspase-3 抗体</td><td>细胞信号转导</td><td>9662 S</td><td>稀释比例：PBST 中 1:2000，NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗-caspase-8 抗体 C15</td><td>由 Prof. P. Krammer 提供，或可从 ENZO 购买</td><td>ALX-804-242-C100</td><td>稀释比例：PBST 中 1:20，加 NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗CD95抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-715</td><td>稀释比例：PBST 中 1:2000，加 NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗-c-FLIP NF6 抗体</td><td>由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购买</td><td>ALX-804-961-0100</td><td>稀释：PBST 中 1:10 稀释 + NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗FADD 1C4抗体</td><td>由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购得</td><td>ADI-AAM-212-E</td><td>稀释：PBST 中 1:10 稀释 + NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗PARP抗体</td><td>细胞信号转导</td><td>9542</td><td>稀释比例：PBST 中 1:1000 + NaN 1:100&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>APS</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Carl Roth</td><td>4227.2</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 溶液&lt;br/&gt; 蛋白测定染料试剂浓缩液 450ml</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>500-0006</td><td>按照制造商说明书使用</td></tr><tr><td>CD95L</td><td>由 Prof. P. Krammer 在本实验中提供，或可由 ENZO 购得</td><td>ALX-522-020-C005</td><td></td></tr><tr><td>化学发光检测器&lt;br/&gt; Chem Doc XRS+</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11 836 145 001</td><td>按照制造商说明进行制备</td></tr><tr><td>不含 Ca、Mg 的 DPBS (10x)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>稀释比例 1:10，使用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，置于冰箱中保存</td></tr><tr><td>电泳缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>10×电泳缓冲液：&lt;br/&gt; 60.6 g Tris&lt;br/&gt; 288 g 甘氨酸&lt;br/&gt; 20 g SDS&lt;br/&gt; 加至 2 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 使用前按1:10稀释</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-05</td><td>PBST + 5% 脱脂牛奶中1:10,000稀释</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-05</td><td>PBST + 5% 脱脂奶粉中1:10,000稀释</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>4030-05</td><td>PBST + 5% 脱脂奶粉中1:10,000稀释</td></tr><tr><td>人白细胞介素-2（hIL-2）</td><td>默克集团 / 罗氏</td><td>11011456001</td><td>用于T细胞的活化</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液&lt;br/&gt; 4x Laemmli 样品缓冲液，10 mL</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>161-0747</td><td>按照制造商说明进行制备</td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBLUFO500</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>13.3 mL Tris-HCl；pH 7.4；1.5 M&lt;br/&gt; 27.5 mL NaCl；5 M&lt;br/&gt; 10 mL EDTA；2 mM&lt;br/&gt; 100 mL Triton X-100&lt;br/&gt; 加入 960 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>用于贴壁细胞的培养基 DMEM F12 (1:1) 含稳定型谷氨酰胺，&amp;nbsp; 2,438 g/L</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41154</td><td>向培养基中添加10% FCS、1%青霉素-链霉素和0.0001%嘌呤霉素</td></tr><tr><td>原代T细胞培养基</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>21875034</td><td>在培养基中加入10% FCS和1%青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Carl Roth</td><td>T145.4</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>P030.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td>自制</td><td></td><td>20x PBST：&lt;br/&gt; 230 g NaCl&lt;br/&gt; 8 g KCl&lt;br/&gt; 56.8 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 8 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 20 mL Tween-20&lt;br/&gt; 加至 2 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 使用前按1:20稀释</td></tr><tr><td>PBST + 5% 脱脂牛奶</td><td>自制</td><td></td><td>50 g 脱脂奶粉 + 1 L PBST</td></tr><tr><td>PHA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td>用于T细胞的活化</td></tr><tr><td>Power Pac HC</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 标准 全蓝</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>161-0373</td><td>使用3-5之间 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td><td>Novodirect/ Th.Geyer</td><td>GE 17-0780-01</td><td>根据制造商说明制备的亲和树脂珠</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>VWR</td><td>734-2602</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>4360.2</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>Trans Blot Turbo 小型转印叠层</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>170-4270</td><td>按照制造商说明书使用</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo 5x 转膜缓冲液</td><td>Bio Rad</td><td>10026938</td><td>按照制造商说明进行制备</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo Mini型硝酸纤维素膜</td><td>Bio Rad</td><td>170-4270</td><td>按照制造商说明书使用</td></tr><tr><td>Trans-Blot-Turbo</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>化学溶质</td><td>8,08,51,000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>泛反应应用化学</td><td>A4974,1000</td><td></td></tr></tbody></table>

测量cd95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

外源性凋亡由死亡受体（DRs）的激活介导，例如 CD95/Fas/APO-1 或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体1/受体2（TRAIL-R1/R2）。这些受体与其相应配体结合后，可诱导死亡诱导信号复合物（DISC）的组装。DISC 包括死亡受体（DR）、含死亡结构域的 Fas 相关蛋白（FADD）、前体半胱天冬酶-8/-10（procaspases-8/-10）以及细胞内 FADD 样白细胞介素（IL）-1β 转化酶抑制蛋白（c-FLIPs）。DISC 作为前体半胱天冬酶-8 加工和活化的平台。后者的发生过程如下 通过 其在死亡效应结构域（DED）丝状结构中的二聚化/寡聚化，该丝状结构组装于DISC。 
前体caspase-8的活化随后是其加工过程，该过程分为多个步骤。本文描述了一种成熟的实验流程，可用于检测死亡诱导信号复合物（DISC）的形成以及前体caspase-8在该复合物中的加工。该流程基于免疫共沉淀技术，并结合蛋白质印迹分析。此方法可精确监测前体caspase-8招募至DISC的不同阶段及其后续加工过程，对于研究外源性凋亡的分子机制具有重要意义。

为了分析caspase-8在死亡诱导信号复合物（DISC）中的募集及其在CD95 DISC上的加工过程，本文描述了一种经典的工作流程，该流程结合了CD95 DISC的免疫沉淀（IP）与蛋白质印迹（western blot）分析。该方法可用于检测caspase-8在DISC中激活的多个关键特征：caspase-8激活型大分子平台的组装、前体caspase-8向DISC的募集，以及该起始型caspase的剪切加工过程（图1 和 图2）。该工作流程包括：以CD95配体（CD95L）对敏感细胞进行时间依赖性处理，随后裂解细胞，使用抗CD95（抗APO-1）抗体进行免疫沉淀，再进行后续的蛋白质印迹分析（图3）。
以宫颈癌 HeLa-CD95 细胞为例分析 DISC 的形成26. 用CD95L刺激这些细胞导致高水平的CD95 DISC形成，对此进行监测 通过</...

本文介绍了一种实验流程，可直接在死亡诱导信号复合物（DISC）处检测caspase-8的加工过程，并确定该复合物的组成。该方法具有广泛的应用，从揭示细胞死亡通路的分子机制到凋亡网络的动态建模均可适用。

测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

外源性凋亡由死亡受体（DRs）的激活介导，例如 CD95/Fas/APO-1 或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体……

细胞凋亡的启动由caspase在标志性的分子平台上被激活所介导。本文介绍了关键的起始性细胞死亡复合物DISC的检测方法，该复合物作为caspase-8激活的平台。该技术的优势在于，能够检测DISC复合物的组装过程及其组成成分，同时提供caspase-8在此复合物中加工活化的相关信息。实验开始时，选择贴壁且融合度达到80%至90%的细胞。弃去培养基，向贴壁细胞中加入新鲜培养基。然后通过将培养板倾斜，用移液器将选定浓度的CD95L加入培养基中，注意不要接触贴壁细胞，从而刺激细胞。为收获细胞，将细胞培养皿置于冰上。向细胞悬液中加入 10 毫升预冷的 PBS，刮下贴壁细胞。将细胞悬液收集至 50 毫升离心管中。用 10 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞培养皿两次，并将洗涤液加入同一个 50 毫升离心管中。然后在 4°C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，用 1 毫升预冷的 PBS 重悬细胞沉淀。然后将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。离心细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于1毫升预冷的PBS中。再次离心一次，随后将细胞沉淀重悬于1毫升裂解缓冲液中，置于冰上孵育30分钟。孵育后，在4°C条件下以最大速度离心裂解液15分钟，然后将上清液转移至洁净的离心管中。弃去沉淀，并另取50 µL裂解液样品于其他离心管中，用于测定蛋白浓度。进行免疫沉淀时，向裂解液中加入2 µL抗APO1抗体和10 µL预先制备的Protein A Sepharose微珠。取10 µL磁珠单独加入另一管含有裂解液的试管中，作为磁珠对照。将含有裂解液、抗体和Protein A Sepharose磁珠的混合物在4°C轻柔混匀条件下孵育过夜。次日，在4°C以500 ×g离心4分钟。弃去上清液后，加入一毫升冷的 PBS 洗涤磁珠，离心后弃去上清液。此步骤至少重复三次。最后一次 PBS 洗涤弃去后，最好使用 50 微升 Hamilton 注射器吸出磁珠。进行 Western 印迹实验时，向珠子中加入 20 微升 4X 上样缓冲液，在 95 摄氏度下加热 10 分钟。同时，将裂解液对照样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。将裂解液、免疫沉淀物以及蛋白标准品上样至 12.5% SDS 凝胶中，并以 80 伏恒定电压电泳运行。凝胶电泳完成后，将SDS凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。转移完成后，将膜放入盒中，加入封闭液，在温和振荡条件下孵育1小时，随后用PBST洗涤膜3次，每次5分钟。为检测蛋白质，按指定稀释比例加入一抗，于4摄氏度在温和振荡条件下孵育过夜。第二天，用 PBST 缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟，然后在室温下轻轻摇动，将膜与 20 毫升二抗溶液孵育一小时。再次用 PBST 缓冲液洗涤膜三次。弃去最后一次的 PBST 洗涤液后，向膜上加入约一毫升辣根过氧化物酶底物，并检测化学发光信号。用CD95L刺激宫颈癌HeLa-CD95细胞后，通过CD95免疫共沉淀检测到高水平的CD95死亡诱导信号复合物（DISC）形成。在这些CD95免疫共沉淀物中检测到CD95、FADD、前体caspase-8、前体caspase-10和c-FLIPS，表明DISC有效形成。同时在免疫共沉淀物中检测到p43-FLIP和p22-FLIP的裂解产物，提示caspase-8已被激活。使用过表达c-FLIP长型的HeLa-CD95细胞分析CD95死亡诱导信号复合物（DISC）的形成。与亲本HeLa-CD95细胞类似，在未经CD95L处理的这些细胞的免疫共沉淀实验中，未检测到FADD、前体caspase-9、前体caspase-10、c-FLIP蛋白以及PARP1的招募。在抗CD95免疫共沉淀实验中，活化的原代T细胞表现出高水平的CD95、FADD、前体caspase-8、前体caspase-10以及c-FLIPS。该技术可用于分析死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，包括 DISC 上 caspase-8 的活化过程。所有洗涤步骤均至关重要。此外，刺激时间点和孵育时间应严格控制。这是测量DISC复合物上组装情况的唯一方法。然而，要检测caspase-8的活化，也可以采用caspase-8活性检测实验。该方法使我们对细胞凋亡启动机制获得了新的认识。

measuring-composition-cd95-death-inducing-signaling-complex

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

测量CD95死亡诱导信号传导复合物的组成和该复合物中Procaspase-8的处理

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体内 生物传感器追踪非凋亡性半胱天冬酶活性 果蝇

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