转座子插入测序作为解析Burkholderia gladioli在绒毛丽金龟（Lagria villosa）体内共生定植因子的工具

本方案适用于对共生细菌（此处特指伯克霍尔德菌属 *Burkholderia*）进行遗传操作，并鉴定其在昆虫宿主中定植所必需的基因。转座子插入测序是一种强大的工具，可在单次实验中同时鉴定大量条件性必需基因。首先，在无菌操作台中，将大肠杆菌（*E. coli*）供体的新鲜培养物接种于 10 毫升 LB 培养基中，培养基中需添加卡那霉素和二氨基庚二酸（DAP）。

将伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）菌株A的受体细胞接种于5 mL KB培养基中。在30°C、250 RPM条件下振荡培养过夜。过夜培养后，取各培养物4 mL，于9,600 ×g离心6分钟，收集菌体，弃去上清液。

在无菌操作台中，用含有DAP的KB培养基洗涤菌体沉淀。最后，将菌体分别重悬于4毫升含DAP的KB培养基中。在新的15毫升离心管中，将250微升洗涤后的E.coli供体菌液与1毫升洗涤后的Burkholderia gladioli菌株A受体菌液混合。

取10微升该接合细胞混合物，点样于含有DAP的KB琼脂平板上。将平板置于室温下的无菌操作台中静置一小时，期间勿扰动。随后将平板置于30摄氏度培养箱中，对接合点进行12至18小时的培养。

孵育后，在无菌操作台中向平板中加入 2 至 4 毫升 1× PBS，使用细胞刮刀将生长的细菌接合斑块从琼脂上刮下。然后用移液器将接合后的细胞混合液转移至 2 毫升微量离心管中。在 9,600 ×g 条件下离心 2 分钟，沉淀细胞。

弃去上清液，用1毫升1×PBS通过反复吹打洗涤沉淀物两次。将最终沉淀物重悬于1,200微升1×PBS中。充分混匀后，取100微升细胞混合液涂布于添加卡那霉素的大型KB琼脂平板上，30摄氏度过夜培养。

计数三块平板上接合子菌落的总数，并据此推算所有平板中获得的突变体总数。为提高获得代表性文库的可能性，应确保菌落总数远高于基因组中基因总数的数倍。为验证接合实验是否成功，可按照文中所述方法，选取10至20个菌落样本，针对插入盒进行PCR检测。

在无菌操作台中，向琼脂平板上加入一到两毫升的1× PBS，刮取菌落。将从平板上刮下的细胞混合物收集至50毫升离心管中。涡旋振荡文库以充分混匀，然后将混合后的突变文库每1毫升分装至多个冻存管中。

向试管中加入1毫升70%甘油，并在-80摄氏度下保存。选取一个L.villosa卵块并统计卵的数量，若卵块包含超过100个卵，则继续操作。为对整个卵块进行消毒，加入200微升70%乙醇，轻轻洗涤卵5分钟，然后移除乙醇，并用高压灭菌水将卵洗涤两次。

加入 200 微升 12% 的次氯酸钠溶液，轻轻清洗卵 30 秒。立即去除次氯酸钠溶液，并用 200 微升高压灭菌水将卵再清洗三次。使用 PBS 中浓度为每微升 2 × 10⁶ 个细胞的洗涤后突变文库，对灭菌后的卵块进行感染。

感染的甲虫幼虫孵化两天后，每管收集100只二龄幼虫至1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。为构建体外对照文库，将250微升浓度为每微升2×10⁶个细胞的突变文库接种至10毫升含卡那霉素的KB培养基中。从体内和体外培养的突变文库中提取DNA后，使用超声波破碎仪对DNA进行片段化处理。

为检查 DNA 是否剪切至目标片段大小范围，取五微升未剪切和已剪切的 DNA，与上样缓冲液按 1:1 比例混合后，加载到 1.6% 琼脂糖凝胶上，在 250 伏电压下电泳 40 分钟。为制备适用于接头连接的片段末端，首先向 50 微升剪切后的 DNA 中加入三微升酶混合液和七微升反应缓冲液，通过移液充分混匀。设置带有加热盖的热循环仪，温度设为 ≥75 摄氏度，将样品在 20 摄氏度孵育 30 分钟，随后在 65 摄氏度孵育 30 分钟，最后在 4 摄氏度保存。

进行接头连接时，向末端修复步骤的产物中加入30微升连接反应主混合液、1微升连接增强剂和2.5微升稀释后的接头。用移液器充分混匀，并在热循环仪中于20摄氏度孵育15分钟，加热盖保持关闭状态。15分钟后，加入3微升酶。

用移液器充分混匀，然后在热循环仪中于37摄氏度孵育样品15分钟，热盖温度需加热至大于或等于47摄氏度。为选择连接接头后目标片段长度为250个碱基对的DNA，首先将磁珠溶液涡旋振荡，室温放置30分钟后再使用。向96.5微升连接好的DNA混合物中加入0.3倍体积的磁珠，通过移液充分混匀。

将珠子混合物孵育五分钟。将离心管置于磁力架上，使珠子沉降，去除不需要大小的DNA片段。静置五分钟，待珠子完全沉降后，将澄清的上清液转移至新的微量离心管中。

向上清液中加入0.15倍体积的新鲜磁珠，充分吹打混匀。将磁珠混合物孵育5分钟，然后将离心管置于磁力架上，使与目标DNA结合的磁珠沉降。静置5分钟后，弃去上清液，保留磁珠。

将磁珠置于磁力架上后，加入200微升新配制的80%乙醇，静置30秒，然后在不扰动磁珠的情况下弃去乙醇。从磁力架上取下离心管，加入17微升0.1X TE或低TE缓冲液，用移液器吹打混匀10次，室温孵育2分钟。将离心管放回磁力架，取15微升经片段大小筛选的DNA用于PCR-1。

涡旋混匀链霉亲和素磁珠，并在室温下放置至少30分钟。取32微升磁珠，用500微升1×结合与洗涤缓冲液洗涤。加入32微升2×结合与洗涤缓冲液，重悬磁珠。

向其中加入 32 µL 经纯化的 PCR-1 产物，充分混匀后室温孵育 30 分钟。将磁珠-DNA 混合物置于磁力架上静置 2 分钟。

用移液器吸出上清液，因为含有插入末端的生物素标记DNA会结合到磁珠上的链霉亲和素。用500微升1X结合与洗涤缓冲液洗涤磁珠，然后用200微升低TE缓冲液洗涤磁珠。将结合DNA的磁珠重悬于17微升低TE缓冲液中。体内和体外培养的突变文库DNA经超声波破碎仪提取并片段化后，大多数片段长度在100至400个碱基对之间。伯克霍尔德菌光滑致病变种A株基因组中四个复制子上的转座子介导插入位置可在图示中观察到。

可在表格中查看三个体内和体外重复文库的测序输出汇总，以及唯一插入序列和被插入基因的数量。需要牢记的关键点是，在宿主定植过程中应计算群体瓶颈大小，以在感染期间获得文库的适当代表性。同时，需调整体外和宿主体内细菌世代数，使其具有可比性。

构建转座子突变文库后，可在选择性培养基上进行筛选，根据表型差异回收突变株，从而鉴定出在特定条件下发挥重要作用的基因。