果蝇成腿的解剖和免疫组织化学，以检测已识别运动神经元的神经肌肉接头处的变化

我们描述了一种解剖技术，该技术保留了神经肌肉接头的结构，并能够对成年 果蝇 腿中的运动神经元进行详细的免疫细胞化学研究。

该手术的总体目标是展示果蝇成年腿的解剖方法。这种技术去除角质层的一部分，以保留神经元和肌肉结构的方式暴露下层组织。该过程使我们能够使用标准的免疫细胞化学技术表征已识别的运动神经元心轴的神经肌肉接头。

解剖对于研究在相对较长的时间内发生的缓慢退行性变化特别有用。时间方面是一个重要的考虑因素，因为果蝇幼虫的神经肌肉接头在开始前稳定了大约五到七天。相反，成年神经元存在于成年苍蝇的整个生命中，对于野生型实验室饲养的果蝇黑色素食尸鬼来说大约需要90天。

该技术非常灵活，可以应用于不同疾病模型的一系列基因型，并利用果蝇可用的一系列抗体作为模型系统。该手术的总体目标是展示果蝇成年腿的解剖方法。这种技术去除角质层的一部分，以保留神经元和肌肉结构的方式暴露下层组织。

使用画笔，将苍蝇转移到玻璃孔或盘子中的冷甲醇中约30秒至一分钟。甲醇使角质层碳氢化合物溶解，苍蝇现在可以被淹没而不是漂浮在水溶液中。使用镊子，小心地将苍蝇转移到PBS。

在冰冷的PBS中冲洗三次以除去多余的甲醇，并将苍蝇保持在PBS冰上，直到解剖和固定。此时，应在尽可能短的时间内解剖和固定苍蝇，最好是在30分钟以内。将苍蝇转移到装有冷PBS的硅弹性体解剖皿中。

使用两对五号杜蒙镊子去除髋关节处的上胸腿，或用Vannas剪刀剪断腿部。将腿转移到充满一密耳PBS的塑料24孔板中的井中，并将板保持在冰上，直到所有腿都被移除并转移到井中。我们通常每口井使用20条腿。

将PBS溶液更换为一毫升FA溶液，并在螺母器上旋转30分钟。螺母器设置应设置为中速。在此期间，确保支腿完全浸没在溶液中。

要去除FA溶液，在一密耳PBS中快速洗涤三次，然后在一密耳PBS中再洗涤三次，每次洗涤五分钟。在解剖步骤之前和期间，将组织保持在冰上一密耳PBS中。为了简要概述果蝇腿部解剖结构，需要指明腿部，包括髋关节、转子、股骨、胫骨和五个睑板段。

在这里，我们看到腿部的前视图，通过存在感觉刷毛而不是后侧存在的裸露角质层来识别。还指明了近端-远端轴和背-腹轴的方向。该解剖手术从股骨近端去除一小块角质层，因此可以研究在背侧突出的轴突乔木，支配胫骨提肌。

我们之前的工作集中在指示的心轴上，它起源于假定的神经母细胞眼谱系。在手术的这一部分中，我们从股骨前侧切除角质层。解剖镊子对于成功至关重要，我们发现，在五号超细镊子的末端引入轻微的弯曲提供了一个斜面，允许角质层被浅表抓住，而不是被戳破，这可能会破坏组织。

将支腿转移到PBS中的硅胶弹性体培养皿中进行解剖。使用一对镊子，将胫骨段固定在硅胶弹性体皿上，如右手边所示。使用其他镊子将斜面朝下，抓住股骨远端的角质层，然后向近端方向拉向大转子。

保持有条不紊地去除角质层，直到裸露的肌肉在整个股骨近端可见。解剖所有腿后，用FA溶液代替PBS，在中速螺母上摇晃30分钟。之后，在一密耳PBS中快速洗涤样品三次，然后在PBT溶液中洗涤三次，每次五分钟。

要阻断组织，用封闭溶液代替1密耳PBT，该溶液由一密耳5%正常山羊血清在PBT中稀释。在室温下孵育解剖的腿四小时，或在四摄氏度下过夜。除去封闭溶液，并用在封闭溶液中稀释的一抗代替。

在这里，我们使用1到200稀释度的抗光盘。将盘子放回摇摇杯上，以四度孵育过夜。一抗孵育后，在一密耳PBT中洗涤一抗三次，然后三次，每次15分钟。

在室温下再次在一个磨5%正常山羊血清中再次阻断组织至少两个小时，或在四摄氏度下过夜。除去封闭溶液并加入300微升适当稀释的荧光偶联二抗。此外，加入一至 2000 稀释的荧光偶联的素以标记肌肉。

要孵化，请用实验室密封胶带和盖子密封孔。此外，用铝箔包裹板以保护荧光团免受光照。在室温下孵育六到八小时，或在四摄氏度下孵育过夜。

要去除未结合的二抗，请以与前面描述的类似方式进行PBT洗涤，以洗涤一抗。完成此步骤后，现在可以对示例进行装载和映像。将支腿前侧朝上，并在需要时用额外的安装介质覆盖。

轻轻刮擦盖板的角落滑过粘土球。由此产生的粘土将用作滑块和盖玻片之间的垫片，因此组织不会被压碎。向下按盖板，直到它接触到腿的顶部。

用指甲油密封边缘，并以四度储存直至成像。使用书面协议第四节中描述的成像参数通过共聚焦显微镜进行图像。为了帮助验证解剖方案，我们首先通过相差显微镜在低放大倍率下成像。

这是面板A上的一个例子，左边是好的解剖，右边是肌肉纤维被破坏的坏解剖。图C显示了肌肉未被破坏的良好解剖的共聚焦图像。相比之下，图D显示了在解剖过程中腿部受损，其中肌肉纤维缺失，如箭头所示。

在这里，我们用抗辣根过氧化物酶染色成像的腿部以检测神经元过程，这里显示为绿色，抗椎间盘大，这有助于突触后谷氨酸受体聚集，以红色显示，素标记肌肉，以蓝色显示。当用透射光通道以20倍放大倍率拍摄时，很容易看到解剖区域。请注意，抗体部分穿透到未分离的区域，并且可以通过角质层看到，如白色箭头所示。

每个腿部运动神经元在支配肌肉时都会做出刻板的投射。我们的工作重点是支配胫骨提肌的运动神经元，这里显示为盒装区域，并由白色箭头指示。在右上角2倍变焦的60倍放大倍率下，我们可以有效地对绿色显示的布顿和以红色显示的周围DLG进行成像。

进一步增加变焦，或步进到100倍物镜，可以量化胸花大小和形态，如右下角所示。使用这种解剖技术结合免疫细胞化学，我们发现与箭头所示的野生型对照相比，在ALS的Sod1突变模型中存在H依赖性胸顿肿胀，如图所示的老年H71Y腿。布顿大小在右侧的蜂群图中量化。

我们进一步发现，在H71Y突变体的弱染色HRP轴突（以绿色显示）中，活性区标记Bruchpilot（以红色显示）减少。为了研究神经变性，泛素化的蛋白质聚集体通常由抗体FK2检测到，并在这里显示为FK2阳性的puncta，在右侧的老年Sod H71苍蝇的轴突和肌肉中，由箭头指示。最后，线粒体可以通过使用抗ATP5a单克隆抗体的免疫细胞化学来可视化，如胫骨提肌内的红色所示。

我们发现线粒体在H71Y突变体中随着年龄的增长而变大。一旦掌握，解剖的腿部准备和相关抗体染色将允许您在不同时间点分析您喜欢的突变体的成人神经肌肉接头处的分子变化。