Name: 癫痫小鼠模型中热诱发癫痫发作的行为筛查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 了解热诱发癫痫发作的行为筛查方法，用于研究GEFS+突变小鼠在高温环境下的癫痫易感性。该方法通过定制热室精确监测体温变化，帮助神经科学研究人员评估基因型与癫痫发作阈值的关系，为热性惊厥治疗策略提供实验依据。

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我们感谢Connor J. Smith在定制小鼠加热舱构建过程中提供的帮助。感谢O'Dowd实验室成员Lisha Zeng和Andrew Salgado在实验方法开发早期阶段对加热程序的标准化所提供的协助。我们还感谢Danny Benavides和Kumar Perinbam为本论文录制了部分实验操作视频。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（NS083009）对D.O.D.的资助支持。

所有动物实验均按照加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 热诱导惊厥实验的准备工作
<ol>
	<li>打开热室上的电源开启按钮，然后按下加热开启按钮。</li>
	<li>使用数字温度控制器上的键盘，将热室的温度设置为 50 °C。</li>
	<li>在将第一只小鼠放入热室前，至少等待 1 小时，使热室在 50 °C 下充分预热。预热可确保热室内温度均匀。</li>
	<li>用玉米芯垫料铺满小鼠热室的底部。</li>
	<li>在热室前方安装一台视频记录相机，用于记录每次热诱导癫痫发作实验的过程。</li>
	<li>用多层厚纸巾铺满直径为 140 mm 的培养皿，并将其置于冰上，作为冷却垫。 
	​注意：实验结束后，将单只小鼠转移至预先冷却的冷却垫上，以帮助降低其升高的体温。</li>
</ol>
2. 准备用于热诱导惊厥实验的小鼠
<ol>
	<li>选取10只成年小鼠（P30-P40），其中5只携带致癫痫突变，另5只为同窝的野生型小鼠，用于热诱导癫痫发作筛查实验。 
	注意：不携带任何致癫痫突变的野生型小鼠在低于44 °C的温度下不会出现热诱导癫痫发作，可作为对照组。</li>
	<li>称量每只用于筛查实验的小鼠，并记录其体重。仅使用体重为15 g或以上的动物进行实验。</li>
	<li>每次仅将一只小鼠放入小鼠加热舱中进行筛查。</li>
	<li>使用钟形罩底部滴加的少量异氟烷对小鼠进行短暂麻醉，持续10–15秒。</li>
	<li>将动物从钟形罩中取出，并放置在一张纸巾上。</li>
	<li>通过轻捏脚趾检查小鼠是否对有害刺激无反应，以确认其已完全麻醉。</li>
	<li>在直肠温度探针的金属尖端涂抹润滑剂（如凡士林），并将其轻轻插入小鼠体内，深度不超过2 cm。</li>
	<li>用胶带将直肠探针固定在小鼠尾巴上，防止其在实验过程中脱落。 
	注意：也可将动物放入小鼠固定锥形管中，插入直肠温度探针，并用胶带固定于尾巴上。</li>
	<li>确保直肠探针已连接至可显示小鼠体内温度的多用表。</li>
	<li>将动物放入铺有玉米芯垫料的新笼子中，即恢复笼。</li>
	<li>启动计时器，等待5分钟。在此期间观察小鼠，直至其完全从麻醉中恢复，表现为活动正常并开始理毛行为。
	<ol>
		<li>同时监测小鼠的核心体温，直至其稳定在35–36 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5分钟后，记录小鼠的体温。此温度即为实验开始时（“0”分钟）的初始体温。 
	注意：若小鼠核心体温低于35 °C，需额外等待一段时间，使其从麻醉引起的低体温状态中恢复。</li>
	<li>迅速将单个小鼠转移至预热的小鼠加热舱中。此操作标志实验试验的开始。每次仅对一只小鼠进行筛查。</li>
</ol>
3. 热诱导癫痫发作检测
<ol>
	<li>将小鼠轻轻放置于预热的小鼠加热舱地板上后，关闭有机玻璃门，并启动摄像机以录制实验视频。</li>
	<li>启动秒表。在整个实验过程中，每隔1分钟记录一次直肠温度计测得的小鼠体温。</li>
	<li>按照固定时间间隔，逐步升高小鼠加热舱的温度，使小鼠体温以0.25–0.5 °C/min的速率上升。 
	注意：体温快速升高可能导致热射病或死亡，应予以避免。</li>
	<li>按照本方案，每10分钟将小鼠加热舱的温度升高5 °C，如图2A所示。</li>
	<li>在第9.5分钟时，将加热舱温度设定为55 °C，以便在第10分钟时使加热舱温度稳定在55 °C，如数字温度显示屏所示。</li>
	<li>同样，在第19.5分钟时将温度升至60 °C，以便在第20分钟时使加热舱温度稳定在60 °C。每次惊厥筛查试验持续30分钟。</li>
	<li>如果小鼠出现惊厥（发声、点头、前肢阵挛、后肢强直伸展、侧倒或全身性强直-阵挛性惊厥），请记录以下信息：
	<ol>
		<li>使用直肠温度计记录小鼠惊厥期间的体温（惊厥阈值温度）。</li>
		<li>记录小鼠表现出的惊厥行为特征，如点头、前肢阵挛、后肢伸展、侧倒和/或全身性强直-阵挛性惊厥（GTCS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迅速但轻柔地将小鼠从加热舱中取出，并放置于步骤1.6中准备好的冷却垫上。 
	注意：若小鼠出现Racine 5级惊厥并伴有不受控制的跳跃行为，可能难以将其从加热舱中取出并转移至外部冷却垫。然而，典型的热诱导惊厥持续时间为30至60秒。因此，应在热诱导惊厥发作开始后的60秒内将小鼠移出加热舱并置于冷却垫上。</li>
	<li>等待小鼠体温降至36–37 °C后，再将其转移至恢复笼中。每次仅将一只小鼠放入一个恢复笼中。 
	注意：切勿将尚未接受热诱导筛查的小鼠与已完成热诱导惊厥实验试验的小鼠混合放置。</li>
	<li>使用剪刀小心而轻柔地剪断小鼠尾部与直肠探针导线之间的胶带，以将直肠探针从小鼠身上移除。</li>
	<li>用70%酒精和柔软的擦拭纸清洁直肠探针的金属尖端，使其为下一次试验做好准备。</li>
	<li>将小鼠置于恢复笼中继续观察，直至其恢复正常的活动行为（如行走、理毛等），然后将其送回原饲养笼。至此，该小鼠的实验试验结束。</li>
	<li>记录实验后动物的状态——是否存活并从测试中恢复，或已死亡。高强度惊厥（包括不受控制的跳跃和全身性强直-阵挛性惊厥）有时可能导致小鼠死亡。</li>
	<li>若小鼠在30分钟观察期内未出现热诱导惊厥，或其体温达到44 °C，则应将小鼠从加热舱中移出，并放置于冷却垫上，直至其体温恢复至36–37 °C。</li>
	<li>将小鼠加热舱的温度重置为50 °C，并使其平衡，直至数字温控器上的显示温度达到50 °C。</li>
	<li>在每只小鼠试验之间更换玉米芯垫料。</li>
	<li>按照第2节所述准备下一只小鼠进行筛查试验，并重复第3节中的步骤。</li>
</ol>
4. 处死动物
<ol>
	<li>尽管大多数动物在热诱导惊厥后能够恢复，但根据我们的经验，少数小鼠在热诱导惊厥后的24–48小时内会在饲养笼中发生癫痫猝死（SUDEP，Sudden Unexplained Death in EPilepsy）。在对每只小鼠完成30分钟试验的热诱导惊厥筛查后，应依照机构IACUC指南对所有小鼠实施安乐死。</li>
</ol>
5. 分析热诱导癫痫发作数据
<ol>
	<li>在完成对一组动物的筛选后，使用以下公式计算特定基因型小鼠中出现癫痫发作的百分比： 
	<img alt="小鼠热性惊厥实验图示中的百分比计算公式" src="/files/ftp_upload/62846/62846eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>通过计算特定基因型中所有出现热诱导癫痫发作的小鼠（步骤 3.7 中记录）的癫痫发作阈值温度的平均值，估算该基因型小鼠的平均癫痫发作阈值温度。</li>
	<li>在仍对小鼠的身份和基因型设盲的情况下，将每只小鼠在热诱导惊厥实验筛选期间的视频录像在电脑屏幕上回放，以评估惊厥发作的严重程度。</li>
	<li>使用改良的Racine分级标准对表现出热诱导癫痫发作行为的单个小鼠进行评分13 如先前研究所述13,14参见 表1 详情请见。</li>
	<li>若小鼠在热诱导惊厥过程中仅出现点头，则评分为2分。若小鼠惊厥发作始于点头，但同时伴有前肢阵挛、倾倒和/或跳跃，则评分为5分。</li>
	<li>使用改良的Racine评分标准记录每只小鼠的最高得分13 如上所述。</li>
	<li>绘制给定基因型所有小鼠表现出的最大Racine评分的散点图。</li>
	<li>采用最大Racine评分在不同小鼠组间进行统计学比较，以评估行为性癫痫发作（如热诱导癫痫发作）的严重程度。 
	注意：Racine评分有助于比较不同突变小鼠组或基因型之间的癫痫发作特征。预期野生型小鼠不会出现热诱导性癫痫发作，因此无需将其纳入Racine评分的比较分析。</li>
	<li>根据实验设计，进行适当的统计分析，以确定野生型小鼠与突变型小鼠之间出现癫痫发作的小鼠百分比及其平均癫痫发作阈值温度值是否存在显著差异。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Racine 评分</td>
			<td colspan="3">癫痫发作特征</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="3">无癫痫发作</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">口部和面部运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">头部点动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">前肢阵挛，通常为单侧肢体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">前肢阵挛伴直立</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">全面性强直-阵挛发作，伴有直立、跳跃和跌倒</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Racine评分。

<ol><li>Hirtz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+common+are+the+%27common%27+neurologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">How common are the 'common' neurologic disorders.</a> Neurology. 68, 326-337 (2007).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们描述了一种简单且有效的方案，用于检测小鼠在高温诱导下是否发生惊厥，该行为表型相当于人类患者中的热性惊厥。该检测评估多个参数——&#160;包括出现惊厥的小鼠百分比、惊厥阈值以及在Racine量表上的惊厥严重程度，以比较对照组和实验组小鼠对体温升高的敏感性差异。
该方案中的一个关键步骤是在持续监测小鼠体温的同时，逐步升高实验舱内的温度。必须确保小鼠在检测过程中所达到的最高体温不超过44 °C，因为野生型动物在体温&#62;44 °C时可能发生热诱导性癫痫发作。预先使用全身麻醉剂或镇痛药可能会降低动物的核心体温或干扰体温调节功能，从而影响癫痫发作阈值温度数据的准确性。因此，在此筛选方案中，小鼠在30分钟的试验窗口期内不得接受这些药物处理。所有操作必须&#160;经由机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。为确保在检测过程中持续监测小鼠的核心体温，应将直肠温度探头牢固地用胶带固定在小鼠尾部。如果在检测过程中发现，即使已升高小鼠实验舱的温度，小鼠体温仍长时间保持不变，需确认直肠温度探头是否已脱出或在尾部固定不牢。
小鼠模型的遗传背景可影响其对 SCN1A 突变及药物诱导癫痫发作的敏感性18,25,26,27如上文结果所述，小鼠的遗传背景可能影响其对热诱导惊厥的易感性。 Scn1a K1270T GEFS+ 突变小鼠在两种遗传背景下进行了测试——129X1 和 B6NJ，发现在对癫痫敏感的 B6NJ 背景中，一小部分野生型小鼠（33%）也出现热诱导癫痫发作。然而，与杂合突变体相比 Scn1aKT/+ 小鼠中，B6NJ野生型小鼠出现热诱导性惊厥的温度阈值显著更高。这证实了该基因突变（Scn1a 通过CRISPR基因敲入引入的K1270T突变使突变小鼠对高热诱导的癫痫发作更加易感。
采用本实验方案具有多项优势，总结如下。首先，与使用干燥气流或加热灯的方法不同，在密闭空间内采用温度可控的强制气流系统，可使实验人员更精确地控制测试环境的升温速率。本加热方案中的各步骤可灵活调整，例如升高或降低起始温度、改变每一步的持续时间等，从而适用于对年龄较大、体重较重的小鼠，或大鼠等体型更大的啮齿类动物进行筛选。其次，通过连接直肠探头对小鼠体温进行持续监测，可在整个实验过程中获取每只小鼠体温变化速率的宝贵数据。这使得实验人员能够密切观察小鼠体温变化速率是否超过0.25–0.5 °C/min（该速率可能对动物造成应激），从而在将本方案应用于其他测试环境时进行优化。重要的是，不同小鼠组别在不同时间点的体温变化速率可反映其体温调节能力，有助于判断引起热性惊厥的基因突变是否同时影响小鼠的体温调节功能。第三，持续的体温监测确保了本方案所测得的惊厥阈值温度具有高度准确性，因为该温度值是在小鼠首次出现惊厥时同步记录的。若未对动物体温进行持续监测，或在将动物移出测试环境后再测量惊厥阈值温度，则由于惊厥后操作小鼠所需的时间，可能导致惊厥阈值数据出现波动。最后，本方法避免了通过注射病原体等侵入性手段在小鼠体内诱导发热，从而模拟人类患者热性惊厥的需要。
该方案的一个局限性在于，难以对幼年小鼠（年龄小于P30）进行热诱导癫痫发作的筛选。本方案的建立旨在检测成年小鼠（P30-P40及以上）对热或高热诱导癫痫发作的敏感性。根据我们的经验，年轻的野生型小鼠，尤其是体重低于15 g者，更易发生热诱导癫痫发作，这可能与体温调节机制尚未发育完全、生理性的热应激或两者共同作用有关。因此，使用本方案对幼年小鼠进行热诱导癫痫发作筛选并不理想。
未来的研究可通过在小鼠经历热诱导癫痫发作的同时进行脑电图（EEG）监测，揭示热诱导癫痫发作的EEG癫痫模式，类似于之前的一项研究19。在获取脑组织后，结合光遗传学方法和基于免疫组织化学的研究，可追踪小鼠大脑特定区域的神经元活动。此外，可通过让生酮饮食喂养的小鼠与普通饲料喂养的小鼠接受热诱导癫痫发作实验方案，评估限制性饮食（如生酮饮食）在减少热性惊厥方面的效果。类似地，可建立癫痫药物筛选范式，通过比较药物喂养或药物处理小鼠与对照溶剂喂养或对照小鼠在热诱导癫痫发作中的表现，测试并鉴定能够改善或抑制此类癫痫发作的候选抗癫痫药物。

癫痫，美国第四大常见的神经系统疾病家族1，其特征是中枢神经系统中兴奋性与抑制性驱动失衡，从而导致反复发作的癫痫。热性惊厥（febrile seizures, FS）或与发热相关的惊厥可发生于普通人群，最常见于3个月至6至7岁的儿童。然而，在某些携带基因突变（最常见为钠离子通道基因突变）的个体中，热性惊厥可能持续超过7岁，甚至延续至成年期。这种情况被称为热性惊厥附加症（febrile seizures plus, FS+）。基因组测序技术的快速发展已鉴定出人类钠离子通道基因中超过1,300种突变 SCN1A，使其成为癫痫突变的热点区域SCN1A 突变与多种癫痫发作性疾病相关，包括热性惊厥（FS）、伴热性惊厥的遗传性癫痫（GEFS+）以及Dravet综合征（DS）2,3,4,5,6约20%的SCN1A错义突变导致GEFS+5,7,8儿童期复杂性或长时间热性惊厥史可能随后发展为更严重的癫痫类型，如颞叶癫痫（TLE）。9,10,11Dravet综合征由SCN1A基因的截短突变或功能丧失性突变引起，是一种严重的难治性癫痫，通常在儿童期出现发热性惊厥，并进展为耐药性惊厥，常伴有认知、发育和运动功能障碍2,5,12由于许多患有GEFS+和/或DS的个体表现出热性惊厥，因此开发新型疗法以更有效地应对这些癫痫疾病显得尤为迫切。
SCN1A 相关癫痫的动物模型在表征不同类型的癫痫发作（热性发作与全面性发作）以及解析癫痫发作的神经元机制方面已被证明具有重要价值13,14,15,16,17,18。尽管通过脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录啮齿类动物脑内自发性癫痫发作的研究已较为成熟，并且是一种非常有用的工具，但仅有少数研究尝试在小鼠模型中模拟热性癫痫发作14,16,19,20,21,22,23。以往的研究曾采用加热的干热气流、配备温控系统的亚克力圆筒，或在封闭测试区域中使用带温度控制器的加热灯9,16,21,22,23,24，通过诱导高热来引发癫痫发作。为了在更可控的环境中升高体温，本文所述方案采用一个自行设计的温控加热舱，可实现小鼠体内体温升高速率的可重复性。该加热舱由木材制成（长 40 cm × 宽 34 cm × 高 31 cm），并配备带有 K 型热电偶的数字温度控制器。加热舱后板装有一个带加热器的小型轴流风扇，通过数字温度控制器调节，将热空气送入舱内。这种强制对流加热系统可控制舱内温度的上升速率（图 1A、B）。位于木质加热舱内部的 K 型热电偶向数字温度控制器发送反馈信号，以在实验过程中维持舱内温度恒定。通过设定数字温度控制器的温度值，可使电风扇将加热后的强制气流经通风口送入舱内，从而实现舱体的均匀加热（图 1A）。加热舱的前板为透明有机玻璃板，便于对实验过程进行视频记录。
成年（P30-P40）小鼠，携带导致GEFS+的SCN1A错义突变的杂合子，以及同等数量的野生型同窝小鼠作为对照组，每项实验均选用上述动物。实验所用动物包括雄性和雌性，体重均不低于15 g；因体重较轻的野生型小鼠对热诱导惊厥的敏感性高于同龄较重个体。在预实验中观察到，突变型和野生型小鼠均倾向于寻找并长时间停留在实验箱后部较凉的角落。为避免该行为干扰，通过在箱体右侧放置一块木块B（尺寸为20 cm × 8 cm × 7.2 cm），将热刺激箱测试区域的有效底面积缩小至长16.5 cm × 宽21.5 cm × 高27.5 cm图1A）。热室由厚度为1.9 cm的胶合板制成（长40 cm × 宽34 cm × 高31 cm），外覆白色层压板，并配备带有K型热电偶的数字温度控制器。热室内壁的层压板表面不透水，可在每次实验后用70%乙醇擦拭进行快速消毒。热室的温度初始设定为 50 °C 并在此前至少预热1小时，以确保腔内温度均匀。每只小鼠均安装直肠温度计，以在整个实验过程中持续监测体温。每次将一只小鼠放入腔内，并将温度维持在 50 °C 1 之间st-10th 分钟。随后将温度升高至 55 °C 11th-20th 分钟，最后升高至 60 °C 21 天st-30th 分钟。这导致小鼠体温呈现出可重复的上升速率（图 2A每次试验均进行录像，行为分析在离线状态下进行。
可通过调整加热程序来改变加热室的初始温度以及加热速率，从而改变实验过程中小鼠体温升高的速度。因此，与传统方法相比，该方法在建立热诱导癫痫发作相关的行为学筛选实验时具有更高的灵活性。热诱导癫痫发作方案还可用于筛选能够使突变小鼠对热诱导癫痫发作更具抵抗力或提高癫痫发作观察阈值温度的抗癫痫药物。类似地，也可利用该方法比较正常饲料喂养与生酮饮食喂养的小鼠，以评估限制性饮食方案（如生酮饮食）对热诱导癫痫发作的有益作用。
<img alt="温控室装置与温度控制器；示意图显示气流和线路路径。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62846/62846fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：定制小鼠加热室的说明。（A）木制小鼠加热室的前面板显示了侧面控制面板，其上包含电源开关（用于开启数字温度控制器）、K型热电偶、风扇加热器的开关以及加热指示灯。图中以厘米（cm）为单位标示了箱体的外部尺寸和内部测试区域的尺寸。图中还展示了用于有效减小测试区域表面积的木块B。测试区域底部铺有玉米芯垫料，以防止小鼠直接接触加热的木质表面。（B）加热室的背板显示了安装在顶部通风口的风扇以及为加热室供电的电源线。本图改编自 Das et al., 2021, eNeuro14 中的图3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62846/62846fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>轴流风扇</td><td>Farnam</td><td>AF20-200-120-xx10-3.1</td><td>Farnam 定制产品 - 带风扇的轴流风扇加热器</td></tr><tr><td>数字温度控制器</td><td>Inkbird</td><td>ITC-100RH</td><td>配备 K 型热电偶的 Inkbird 数字 PID 温度控制器 ITC-100RH</td></tr><tr><td>小鼠直肠温度探头</td><td>ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc</td><td>RET-3</td><td>带温度计的小鼠直肠温度探头</td></tr></tbody></table>

癫痫小鼠模型中热诱导惊厥的行为学筛选

A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy

转基因小鼠模型已被证明是研究人类神经系统疾病（包括癫痫）各个方面的有力工具。SCN1A 相关的遗传性癫痫包含一系列具有不完全外显率和临床异质性的癫痫发作性疾病。SCN1A 基因突变可导致多种癫痫表型，范围从简单的、自限性的发热相关热性惊厥（FS），到中等程度的伴热性惊厥附加症遗传性癫痫（GEFS+），再到更严重的德拉韦综合征（DS）。尽管热性惊厥（FS）常见于6-7岁以下且无遗传性癫痫的儿童，但在GEFS+患者中，热性惊厥可持续至成年期。传统上，实验性热性惊厥是通过将小鼠暴露于干燥气流或加热灯下诱导的，而体温变化速率往往难以精确控制。本文介绍一种定制的加热舱，其前端为有机玻璃材质，内置数字温度控制器和带加热功能的电风扇，可将加热后的强制气流以受控温度方式送入实验区域。将小鼠置于舱内，并通过直肠探针监测体温，通过调节舱内温度，可重复地将小鼠体温升高至40–42 °C。在加热过程中持续进行视觉观察，可发现携带热性惊厥突变的小鼠在该体温下出现热诱导性癫痫发作，而野生型同窝小鼠在相同体温下则不出现行为性癫痫发作。实验结束后可迅速将动物移出加热舱并置于冷却垫上，使体温快速恢复正常。该方法为癫痫小鼠模型中热诱导性癫痫发作的发生提供了一种简单、快速且可重复的筛选方案。

携带热性惊厥突变的动物模型在体温升高时应出现热诱导惊厥，而野生型同窝小鼠在相同体温下则不会发生惊厥。SCN1A 基因突变已被证实与热性惊厥相关，包括表现出热性和非热性全面性惊厥的 K1270T GEFS+ 患者7。我们近期在一项研究中描述了通过 CRISPR 技术构建的 SCN1A K1270T GEFS+ 突变小鼠14，并在两种遗传背景——对惊厥具有抵抗性的 129X1/SvJ（129X1）和对惊厥易感的 C57BL/NJ（B6N）——中检测其是否出现热诱导惊厥。年龄匹配的野生型同窝小鼠不携带任何 GEFS+ 突变，因此预期不会出现热诱导惊厥，作为对照组。通过绘制实验过程中每分钟记录的小鼠平均体温，评估体温随时间的变化速率。在各自的 129X1 和 B6N 遗传背景下，杂合突变小鼠与野生型同窝小鼠之间的体温变化速率无显著差异（图 2B、C）。这表明 K1270T GEFS+ 杂合突变小鼠的体温调节功能未发生改变。
来自129X1（n = 15）或B6N（n = 9）遗传背景的所有杂合突变小鼠均表现出热诱导性癫痫发作（图2D）。在129X1富集背景下的野生型小鼠中（n = 13），均未观察到热诱导性癫痫发作（图2D）。相比之下，在癫痫易感的B6N遗传背景下，接受检测的小鼠中有三分之一（n = 9只中的3只）表现出热诱导性癫痫发作。统计学比较显示，在129X1和B6N两种遗传背景下，表现出热诱导性癫痫发作的杂合突变小鼠比例均显著高于相应的野生型小鼠（图2D，Fisher精确检验，129X1 p &lt; 0.0001；B6NJ p = 0.009）。129X1与B6N遗传背景下的杂合突变小鼠之间的平均癫痫发作阈值温度相似。129X1突变小鼠的平均癫痫发作阈值温度为42.6 ± 0.20 °C，与B6N小鼠观察到的42.7 ± 0.06 °C的平均癫痫发作阈值温度相比，差异无统计学意义（图2E；双尾非配对Student t检验，p = 0.782）。值得注意的是，3只发生热诱导性癫痫发作的B6N野生型小鼠的平均癫痫发作阈值温度为43.7 ± 0.08 °C，显著高于B6N杂合突变小鼠的平均癫痫发作阈值温度42.7 ± 0.06 °C（图2E，双尾非配对Student t检验，p &lt; 0.0001）。
该装置的亚克力前壁可实现检测过程中持续的视频记录，之后可根据改良的Racine评分标准对每只小鼠的癫痫发作严重程度进行评分，具体方法如前所述14,20。在典型的检测过程中，杂合突变小鼠在体温达到约42 °C时会出现热诱导性癫痫发作，表现为发声和/或点头（Racine评分2分），并迅速进展为前肢阵挛、侧倒、跳跃、后肢强直和/或全身性强直-阵挛性癫痫发作（Racine评分3-5分）。最高Racine评分代表突变小鼠中出现的最严重的热诱导性癫痫发作行为。在129X1遗传背景富集的小鼠（n = 15）中，杂合突变小鼠的最高Racine评分与在B6N遗传背景（n = 9）中的杂合突变小鼠相比无显著差异（图2F；Mann-Whitney检验，p &gt; 0.9999）。这表明K1270T GEFS+突变小鼠的热诱导性癫痫发作行为特征与品系背景无关。
综上所述，实验数据表明，所有突变小鼠均表现出热诱导性癫痫发作，其发作频率、惊厥阈值温度及行为学惊厥严重程度相似，且不受品系影响。大多数野生型同窝小鼠在44 °C及以下温度均未出现此类惊厥。在癫痫易感的B6N遗传背景下，约三分之一的野生型对照小鼠确实出现了热诱导性惊厥（可能与遗传背景效应有关），但其惊厥阈值温度显著高于相同背景下的突变小鼠。这些结果提示，携带SCN1A GEFS+突变的B6N遗传背景突变小鼠因该突变的存在，对热诱导性惊厥更为敏感，其发作阈值温度更低。因此，利用本实验方案，可有效评估癫痫突变小鼠的热诱导性惊厥，并将其与野生型同窝小鼠区分开来——后者通常不发生热诱导性惊厥，或仅在显著更高的温度下出现热性惊厥。
<img alt="温度诱导癫痫实验中的静态平衡；图表、曲线图、实验方案示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62846/62846fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：突变小鼠表现出热诱导癫痫发作。（A）小鼠热诱导癫痫发作行为学筛查的加热方案。（B-C）在两种遗传背景129X1和B6N中，野生型（Scn1a+/+ —黑色三角形）和杂合突变型（Scn1aKT/+ —橙色圆圈）小鼠随时间变化的平均体温。（D）在两种遗传背景下出现热诱导癫痫发作的小鼠百分比。野生型（Scn1a+/+）和杂合型（Scn1aKT/+）小鼠分别以黑色和橙色柱表示。129X1和B6N遗传背景下的杂合突变体分别以实心橙色柱和带黑色条纹的橙色柱表示。（E）两种品系中野生型（Scn1a+/+）和杂合突变型（Scn1aKT/+）小鼠发生热诱导癫痫发作的体温阈值。（F）两种遗传背景下杂合型（Scn1aKT/+）小鼠热诱导癫痫发作的最大Racine评分的散点分布图。每个点代表单只小鼠的最大Racine评分。每种基因型的动物数量在括号内标出。B-F图中的数据表示为均值 ± 标准误（S.E.M.）。本图改编自Das等，2021年，eNeuro14中的图 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62846/62846fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

该方法的目的是在小鼠模型中筛查高热或热诱导的癫痫发作。本方案描述了使用定制构建的实验舱，并通过持续监测体温，以确定体温升高是否会导致癫痫发作。

转基因小鼠模型已被证明是研究包括癫痫在内的多种人类神经系统疾病各个方面的有力工具。

GEFS+突变会导致患者出现热性惊厥。在GEFS+小鼠中研究由低温诱导的惊厥，使我们能够检验特定突变与惊厥特征之间的关系。数字温度控制器有助于以可重复的方式在加热箱中设置温度梯度。因此，可以以缓慢且稳定的速度升高小鼠体温。本方案可用于鉴定潜在的治疗方法（如药物或饮食限制），以减少或消除发热性惊厥。为避免损伤，在将直肠温度探头插入小鼠体内前，建议短暂麻醉小鼠，并对直肠探头尖端进行润滑。首先，按下电源按钮打开小鼠加热舱，然后按下加热按钮启动加热功能。使用数字温度控制器上的键盘，将加热舱的温度设置为 50 摄氏度。在加热舱底部铺上玉米芯垫料。在热室前方安装一个视频记录摄像机。用多层厚纸巾铺满直径为140毫米的培养皿，并将其置于冰上作为冷却垫。在进行筛选实验时，确保小鼠的体重为15克或以上。开始操作前，通过脚趾捏压确认小鼠已完全麻醉。将直肠温度探针的金属尖端涂上润滑剂，轻轻插入小鼠直肠。用胶带将直肠探针固定在小鼠尾巴上。将小鼠放入铺有玉米芯垫料的新恢复笼中。启动计时器，观察小鼠5分钟，同时监测其核心体温，直至小鼠完全从麻醉中恢复且体温稳定在35至36摄氏度。5分钟结束时，记录小鼠的体温作为第0分钟的初始体温。迅速将小鼠转移至预热的小鼠加热舱底部，以开始实验。将小鼠放入预热的加热舱后，立即启动摄像机和秒表，并以固定时间间隔逐步升高加热舱温度，使小鼠体温以每分钟2.5摄氏度的速率上升。在实验全程中，每隔一分钟开始记录一次小鼠的体温。在第9.5分钟时，将加热室的温度设置为55摄氏度，以确保在第10分钟时加热室的温度稳定在55摄氏度。同样，在第20分钟时使加热室的温度稳定达到60摄氏度。每次惊厥筛选实验持续30分钟。若小鼠出现癫痫发作，应记录其在发作期间的体温，作为癫痫发作阈值温度。注意观察小鼠表现出的癫痫行为特征，然后迅速将小鼠从实验舱中取出并放置于冷却垫上。若小鼠在30分钟观察期内未出现热诱导的癫痫发作，或其体温达到44摄氏度，则立即将小鼠置于冷却垫上。当小鼠体温降至36至37摄氏度时，将小鼠转移至恢复笼中。为从小鼠身上取出直肠探针，需小心剪断小鼠尾巴与直肠探针导线之间的胶带。使用70%乙醇擦拭并清洁直肠探针的金属尖端。观察小鼠直至其恢复，然后将其放回饲养笼中。持续监测小鼠的状态。标记实验试验结束。将小鼠加热舱的温度重置为50摄氏度，并在下一次检测前使其达到平衡状态。在热性惊厥检测中，使用加热程序每分钟记录一次小鼠的平均体温，并评估体温随时间变化的速率。在相应的遗传背景下，杂合突变型小鼠与野生型小鼠在体温变化速率方面无显著差异。在暴露于周期性体温升高时，实验组与对照组小鼠表现出不同的行为。来自129X1或B6NJ遗传背景的所有杂合突变小鼠均出现热诱导性癫痫发作。在富含129X1背景的野生型小鼠中无一出现癫痫发作，而在对癫痫敏感的B6NJ背景小鼠中，仅有三分之一出现癫痫发作。129X1突变小鼠的平均惊厥阈值温度与B6NJ小鼠的平均惊厥阈值温度相比，差异无统计学意义。在出现热诱导惊厥的B6NJ野生型小鼠中，有三分之一的惊厥阈值温度显著高于B6NJ杂合突变小鼠。惊厥严重程度采用改良的Racine评分标准进行评估。在129X1富集背景下的杂合突变小鼠的最大Racine评分与在B6NJ遗传背景下的杂合突变小鼠相比，差异无统计学意义。设置加热程序时，请确保小鼠体温上升速率不超过每分钟25摄氏度，否则可能对动物健康造成危害。将加热程序与同步脑电图（EEG）记录相结合将会非常有意义，这将使我们能够将不同类型的脑电活动模式与不同类型的癫痫行为相关联。

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制备并植入电极以电点燃VGAT-Cre小鼠，建立颞叶癫痫模型

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使用Theiler's小鼠脑脊髓炎病毒建立感染性病因癫痫模型

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