毛细管电泳电喷雾电离质谱法绝对定量肌醇焦磷酸盐
2021年8月13日
描述了毛细管电泳电喷雾电离质谱法用于绝对定量哺乳动物细胞提取物中肌醇焦磷酸盐的程序。
这为我们迄今为止测试的所有生物体中的肌醇磷酸盐代谢提供了高质量的结果.它还将提供对我们目前所知的新细胞生物合成途径的见解。通过CE-ESI-MS分析肌醇磷酸代谢更快，灵敏度高，并且能够为肌醇磷酸组件提供结构信息。
首先，设置毛细管电泳电喷雾电离质谱或 CE-ESI-MS 系统，该系统由商用 CE 系统和配备安捷伦喷射流 ESI 源的三重四极杆串联质谱仪组成。接下来，连接鞘流1:100分流器和等度液相色谱泵出口，并确保CE系统入口小瓶与质量分析仪的喷雾器尖端处于同一高度。然后，利用MassHunter工作站版本或类似的MS软件，来控制整个系统以及数据采集和分析。
准备好CE电泳缓冲液和鞘液后，以每分钟5毫升的速度吹扫5分钟来安装护套液。然后将流速设置为每分钟一毫升，将泵压力设置为 180 bar。确保回收的管子连接回护套液瓶以重复使用溶剂。
接下来，使用带有旋转金刚石锯片的毛细管柱切割机，正确切割具有紫外线检测窗口的CE-MS毛细管的两端。然后用打火机去除两端两到三厘米的聚酰亚胺涂层，并用异丙醇清洁毛细管表面。要安装毛细管，请将毛细管匹配到CE-MS盒中。
然后单击"更换盒式磁带"按钮并将磁带安装到CE设备中。要激活毛细管，首先用一摩尔氢氧化钠冲洗毛细管，然后用水冲洗10分钟，然后CE电泳缓冲液15分钟。接下来，将毛细管插入CE-MS喷雾器中。
使用放大镜和喷雾器中的调节螺钉，精确调节毛细管出口，确保毛细管端从喷雾器尖端突出约 0.1 毫米。检查ESI喷雾器在全扫描模式下的稳定性。总离子电泳图的波动应在5%以内，然后用肌醇磷酸标准品进行试运行。
制备内标混合物后，将10微升样品与0.5微升内标混合物和CE样品瓶混合。使用补货系统时，单击"更换瓶子"按钮。将准备好的250毫升CE电泳缓冲液放入电解质瓶中。
然后点击清洁管，将补给针保持在水瓶中。设置 ESI 和 MS 参数。然后使用含有肌醇聚磷酸盐标准品混合物的源优化器优化源参数，并使用包含所有标准的MassHunter优化器进行多种反应监测设置。
接下来，对肌醇磷酸盐提取物进行运行并检查结果。设置有更多样本时的顺序。测量后，让MS处于待机模式，不要关闭液相色谱泵。
当没有护套液供应时，将 CE-ESI-MS 喷雾器更换为 LC-ESI-MS 喷雾器。对于数据分析，请打开定量分析软件并为所有样品创建一个批次。接下来，根据获取的多个反应监测数据创建一个新方法，并将碳-13肌醇磷酸盐设置为内标。
然后，检查多反应监测化合物、保留时间、内标、浓度和定性剂设置。传递验证并退出以将该方法应用于当前批处理。保存方法。
然后检查批次中的每个峰是否正确积分。否则，请手动积分峰值。将结果导出到电子表格中，并通过将阳极液峰响应与已知浓度的稳定同位素标记内标的相应峰响应进行比较，量化肌醇焦磷酸盐。
最后，用肌醇磷酸盐、提取物溶液及其体积中测得的浓度，计算绝对量，并通过细胞计数或蛋白质含量进一步标准化量。根据HCT116细胞的细胞计数和平均细胞体积计算细胞浓度。此处显示了浓度为2微摩尔的肌醇焦磷酸盐标准品的提取离子电泳图。
插入具有简化结构的哺乳动物中肌醇焦磷酸盐的代谢。这里显示了来自伦敦大学学院或伦敦大学学院的HCT116细胞的CE-ESI-MS运行。CE-MS用于量化UCL和NIH的HCT116细胞之间IP8水平的变化。
UCL的HCT116细胞的IP8水平比NIH高七倍。HCT116 UCL单元中1，5-IP8的显着积累与1-IP7的显着增加并行。来自NIH的氟化钠处理的HCT116细胞的CE-ESI-MS分析显示升高5-IP7，同时IP6降低和5-PPIP4外观。
尽管1-IP7的水平在一定程度上有所下降，但在氟化钠处理的细胞中并非完全不存在，但大多在检测限以下。形成稳定的CE-ESI-MS等级非常重要。我们建议在测量前检查系统的可重复性和灵敏度。
该技术允许提供肌醇磷酸盐代谢， 植入物和组织， 也提供了仔细研究生物学相关的肌醇焦磷酸盐的机会.
概述
本文介绍了一种利用毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）定量哺乳动物细胞提取物中肌醇焦磷酸盐的方法。该方法具有快速、灵敏度高以及能够提供肌醇磷酸酯结构信息的优点。
关键研究组成部分
科学领域
- 质谱分析
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 肌醇焦磷酸盐在细胞信号传导中起着至关重要的作用。
- 了解其代谢过程有助于深入认识多种生物学过程。
- 毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）提供了一种快速且灵敏的分析方法。
- 以往的方法在效率和细节方面均不及CE-ESI-MS。
研究目的
- 建立一种可靠的肌醇焦磷酸盐定量方法。
- 分析哺乳动物细胞中肌醇磷酸盐的代谢过程。
- 探究不同细胞系中肌醇焦磷酸盐水平的差异。
使用的方法
- 使用特定设备配置搭建 CE-ESI-MS 系统。
- 制备 CE 运行缓冲液和鞘液。
- 冲洗并活化毛细管以获得最佳性能。
- 使用 MassHunter 软件进行数据采集与分析。
主要结果
- CE-ESI-MS 成功定量了 HCT116 细胞中的肌醇焦磷酸水平。
- 不同来源的 HCT116 细胞之间，IP8 水平存在显著差异。
- 经氟化钠处理后，观察到肌醇磷酸代谢发生改变。
- 该方法表现出高重复性和高灵敏度。
结论
- 毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术（CE-ESI-MS）是研究肌醇磷酸代谢的有力工具。
- 该技术有助于加深我们对细胞生物合成途径的理解。
- 未来应用可能包括在多种生物学背景下对肌醇磷酸进行更广泛的研究。
常见问题
行业重要性概述
准确测定肌醇焦磷酸（PP-InsPs）有助于在靶点验证过程中通过提供磷酸盐稳态和细胞能量状态的定量读数来降低机制性风险。该毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）方法可支持细胞内信号通路的检测开发，实现区域异构体的良好分离并提供绝对浓度数据。该方法通过在实验条件下对PP-InsPs进行时间序列监测，提高了早期发现阶段的预测可信度，为临床前模型选择中的“推进/终止”决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够验证将焦磷酸肌醇（PP-InsPs）与代谢信号传导及胰岛素敏感性通路相关联的治疗假说。
- 操作价值：无需使用放射性示踪剂，即可实现对低丰度PP-InsPs的高通量、高灵敏度定量，降低检测复杂性和成本。
- 预测价值：通过提供PP-InsPs（包括次要异构体）的绝对细胞浓度，支持生物学层面的风险评估，助力靶点信心判断。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：实现PP-InsP区域异构体的基线分离，能够特异性检测哺乳动物细胞中具有生物学意义的物种。
- 操作价值：通过稳定同位素标记的内标提供可重复的定量结果，确保不同实验间的检测标准化。
- 可扩展性：便于在与疾病相关的体系中，重复使用该平台筛选化合物对肌醇磷酸代谢的影响。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过监测实验条件下（如氟化钠处理）HCT116 细胞中 PP-InsP 动态的时序变化，将发现阶段的 PP-InsP 研究与临床前验证相连接。
- 机制去风险化：揭示 IP7/IP8 水平的变化及 PPIP4 的出现，支持通路特异性生物标志物的匹配以及基于风险评估的推进决策。
- 疾病相关体系：适用于在肿瘤学和代谢性疾病模型中研究磷酸盐稳态和细胞能量状态。
流程与工作流整合
该方法通过提供可定量且具有结构解析度的PP-InsP数据，阐明作用机制并支持检测体系的建立，从而整合到从靶点验证、先导化合物鉴定直至临床前评价的完整发现流程中。
- 发现生物学：通过定量检测作为代谢信使的焦磷酸肌醇（PP-InsPs），监测磷酸盐稳态和胰岛素敏感性，支持假设验证与信号通路解析。
- 筛选：通过高灵敏度检测和PP-InsPs的基线分离，实现检测就绪，可在代谢信号通路检测中可靠评估化合物活性。
- 分析学：利用多反应监测（MRM）提供定量因变量测量结果（绝对浓度、时间变化），实现不同条件和细胞系间的统计学比较。
- 转化研究：通过在疾病相关体系中监测PP-InsPs的调控，连接临床前研究的连续性，支持生物标志物匹配和基于风险的决策制定。
- 企业级复用：建立可重复使用的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）能力，用于跨多个项目和治疗领域的肌醇磷酸盐代谢的纵向研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过焦磷酸肌醇（PP-InsPs）的绝对定量实现可预测的置信度，降低肌醇磷酸盐信号通路中的机制模糊性。
- 操作价值：采用毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS），结合内标归一化和优化的离子源参数，实现方法的标准化、可重复性和高灵敏度。
- 战略价值：通过定量的PP-InsP检测结果支持更优的立项或终止决策，避免使用放射性方法以提高资本利用效率，并通过早期通路去风险化降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于PP-InsP调控数据进行风险校正后的优先级排序，推动影响磷酸盐稳态和能量信号通路的化合物进入下一阶段研发。
实施注意事项
- 需要具备毛细管电泳、质谱优化以及使用稳定同位素标记标准品进行代谢物定量方面的专业知识。
- 需要配备商用毛细管电泳系统、配备安捷伦喷射流电喷雾离子源的三重四极杆质谱仪，以及用于数据采集与分析的MassHunter软件。
- 要求跨团队统一毛细管电泳运行缓冲液的配制、鞘液流速（1 mL/min）和毛细管安装流程，以确保电喷雾离子源的稳定性（总离子流波动小于5%）。
- 涉及针对不同样品类型（细胞、组织）的适应性调整，需根据细胞数量或蛋白质含量进行归一化处理，并选择合适的内标物。
- 包含实际操作中的局限性，例如测量前需进行系统重复性和灵敏度检查，以及在方法开发过程中可能受到高丰度肌醇磷酸盐的干扰。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
