Name: 毛细管电泳电喷雾电离质谱法绝对定量肌醇焦磷酸盐 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习毛细管电泳电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）绝对定量哺乳动物细胞中的肌醇焦磷酸盐。该方法快速灵敏，可提供结构信息，有助于深入研究细胞信号传导和代谢途径。

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该项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（资助协议编号864246，授予HJJ）。DQ感谢Brigitte-Schlieben-Lange项目提供的经济支持。AS获得了英国医学研究理事会（MRC）项目资助MR/T028904/1的支持。

1. 建立毛细管电泳-电喷雾电离质谱系统
<ol>
	<li>建立一套CE-ESI-MS系统，该系统由商用毛细管电泳（CE）系统和配备安捷伦喷射流（Agilent Jet Stream, AJS）电喷雾离子化（ESI）源的三重四极杆串联质谱仪组成。需要配备CE-ESI-MS喷雾器套件和等度液相色谱（LC, Liquid Chromatography）泵。</li>
	<li>将喷雾器套件中包含的鞘流液1:100分流器与等度LC泵的出口连接。</li>
	<li>确保毛细管电泳系统进样端的小瓶与质谱分析仪的喷雾尖端处于同一高度。</li>
	<li>使用MassHunter工作站（版本10.1）或功能相当的质谱软件，用于控制整个系统，并进行数据采集与分析。</li>
</ol>
2. 缓冲液、毛细管和CE-MS系统的准备
<ol>
	<li>配制毛细管电泳运行缓冲液：用氢氧化铵将40 mM醋酸铵溶液的pH值调节至9.0。建议使用250 mL容量瓶。用孔径为0.2 µm的膜过滤器过滤250 mL缓冲液。务必使用超纯去离子水和质谱级试剂。 
	注意：该缓冲液可在室温下保存2–3周，或在冰箱中保存数月。</li>
	<li>配制鞘液：在250 mL试剂瓶中混合100 mL超纯水和100 mL液相色谱-质谱级异丙醇。鞘液应至少每周更换一次。若使用高分辨质谱仪，需向鞘液中添加质量校准参考物质。</li>
	<li>安装鞘液：以5 mL/min流速冲洗5分钟，然后将流速设定为1 mL/min（进入毛细管电泳-质谱喷雾器的流速为10 µL/min）。泵压约为180 bar。确保回收管路重新连接回鞘液瓶中，以实现溶剂再利用。</li>
	<li>准备毛细管：购买用于毛细管电泳-质谱联用的毛细管（内径50 µm，外径365 µm，长度125 cm），并带有紫外检测窗口。用户也可从专业供应商处获取价格更低的条状熔融石英毛细管。将毛细管切割至100 cm长度。使用带有旋转金刚石刀片的毛细管切割器精确切割毛细管两端，并用打火机去除两端约2–3 cm的聚酰亚胺涂层。用异丙醇清洁毛细管表面。</li>
	<li>安装毛细管：将毛细管插入毛细管电泳-质谱卡盒中。点击更换卡盒按钮，并将卡盒安装到毛细管电泳设备中。毛细管的进样端应比电极低约2 mm。确保在进样过程中，毛细管进样端低于样品液面。</li>
	<li>活化毛细管：首次使用前，依次用1 M NaOH冲洗毛细管10分钟，再用水冲洗10分钟，最后用毛细管电泳运行缓冲液冲洗15分钟。</li>
	<li>将毛细管末端插入毛细管电泳-质谱喷雾器：轻柔地将毛细管插入喷雾器，确保毛细管末端从喷雾器尖端突出约0.1 mm。使用放大镜和喷雾器上的调节螺钉，精确调整毛细管出口端位置。将喷雾器重新插入离子源，操作时避免触碰调节螺钉。执行此操作时，质谱仪应处于待机模式。</li>
	<li>检查电喷雾离子化（ESI）喷雾状态：在全扫描模式下检查ESI喷雾器的稳定性。总离子电泳图的信号波动必须控制在5%以内。</li>
	<li>使用肌醇磷酸（InsP）标准品进行测试运行：采用2 µM InsP3-InsP8标准品混合物（通过定量31P NMR15,27进行校准）进行测试运行，进样条件为50 mbar下进样10秒（10 nL）。ESI和质谱参数设置详见表1。毛细管电泳电流约为26 µA，峰宽约为0.4–0.5分钟。确保信噪比至少达到400。</li>
</ol>
3. 从哺乳动物细胞中提取可溶性肌醇磷酸盐
注意：HCT116NIH 细胞由 Stephen Shears 惠赠28。HCT116UCL 细胞来自 Saiardi 实验室26。
<ol>
	<li>接种细胞
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2高湿度环境（下文简称标准条件）中，使用添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），将HCT116NIH或HCT116UCL细胞培养于T75培养瓶中。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）（5 mL）洗涤HCT116NIH和HCT116UCL的储备培养物，加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（3 mL，0.25%），在标准条件下孵育至细胞完全脱落。加入培养基（7 mL）终止胰蛋白酶活性，将细胞收集至离心管中，离心（200 × g，3 min）。</li>
		<li>弃去上清液，用培养基（10 mL）重悬细胞。计数细胞，并通过台盼蓝排斥法测定细胞活力。</li>
		<li>将细胞（每项检测接种600万个HCT116细胞）接种至150 mm培养皿中，总体积调整为20 mL培养基。接种前在离心管中预先混合培养基与细胞，以确保细胞在培养皿中均匀分布。若需按细胞数量进行归一化处理，则准备另一平行培养皿。</li>
		<li>在标准条件下继续培养细胞72 h，细胞将达到约80%–90%融合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用氟化钠（NaF）调节肌醇磷酸水平及细胞收获
	<ol>
		<li>NaF处理：在收获前1 h向培养基中加入NaF（10 mM）。轻轻晃动培养皿或用移液器吹打混匀培养基，在标准条件下继续孵育60 min。</li>
		<li>NaF处理结束后，移除培养基并将细胞置于冰上。</li>
		<li>用预冷PBS（5 mL，4 °C）洗涤细胞两次，并彻底移除培养皿中的PBS。</li>
		<li>加入高氯酸（PA）（1 mL，1 M，4 °C），确保完全覆盖整个培养皿表面（细胞因蛋白沉淀而变白）。将培养皿置于4 °C倾斜摇床上孵育10 min。</li>
		<li>收集PA至离心管中，离心去除杂质（17,000 × g，5 min，4 °C）。将上清液加入预先准备的TiO2微珠中，用于富集肌醇磷酸（InsPs）。</li>
		<li>用PBS（5 mL，室温）洗涤提取后的培养皿两次以中和酸性；彻底移除培养皿中的PBS。</li>
		<li>加入细胞裂解缓冲液（1.5 mL，室温；含0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]的0.1 M NaOH）溶解培养皿上的蛋白。在室温下于倾斜摇床上孵育15 min。将细胞裂解液转移至离心管中，离心（17,000 × g，5 min，4 °C）。上清液保存于-80 °C，待用牛血清白蛋白作为校准标准通过DC蛋白测定法测定蛋白浓度（通常一个150 mm培养皿含有约10 mg蛋白）。</li>
		<li>平行培养皿的细胞数量测定：按照步骤3.1.2所述方法，用胰蛋白酶收获平行培养皿中的细胞（150 mm培养皿使用5 mL胰蛋白酶-EDTA），并移除培养基。将细胞沉淀重悬于PBS（5 mL）中，充分混匀后计数细胞。应在直接淬灭前立即进行此步骤，以获得具有代表性的细胞计数。此外，使用适当方法（如库尔特计数仪）测量细胞体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TiO2富集肌醇磷酸 
	注意：为避免磷酸化化合物在酸性条件下分解，所有富集步骤（至洗脱前）均应在冰上操作，所有试剂需预冷至4 °C。尽量缩短提取时间（1.5–2 h）。所有提取步骤均使用1 M PA进行。
	<ol>
		<li>微珠制备：用ddH2O（1 mL）洗涤TiO2微珠（每样本5 mg），离心（3,500 × g，1 min，4 °C）。弃去ddH2O，用PA（1 mL）洗涤微珠，再次离心（3,500 × g，1 min，4 °C）后弃去PA。将微珠重悬于PA中（每样本50 µL）。</li>
		<li>将含有磷酸化化合物的上清液（参见第3.2节，步骤3.2.5）加入微珠悬液中，涡旋混匀，然后在4 °C下旋转孵育20 min。</li>
		<li>离心样品（3,500 × g，1 min，4 °C），弃去上清液。用PA（500 µL）洗涤微珠，离心（3,500 × g，1 min，4 °C），弃去上清液，并重复洗涤一次。</li>
		<li>向微珠中加入NH4OH（200 µL，3%），重悬并混匀。在室温下旋转孵育5 min。</li>
		<li>离心样品（3,500 × g，1 min），将上清液转移至新的离心管中。</li>
		<li>重复步骤3.3.4和3.3.5的洗脱过程，合并洗脱液，弃去微珠。</li>
		<li>将合并的洗脱液离心（17,000 × g，1 min，4 °C），以去除任何不溶性残留物。</li>
		<li>在真空蒸发条件下完全干燥上清液（70 min，60 °C，V-AQ）。向干燥后的含InsPs提取物中加入ddH2O（50 µL），涡旋混匀直至完全溶解。样品保存于-20 °C，待进行毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 进行毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）检测
<ol>
	<li>配制内标混合物，其中包含 40 µM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4、80 µM [13C6]5-PP-InsP5、80 µM [13C6]1-PP-InsP5、400 µM [13C6]InsP6 和 400 µM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5。使用经认证的参考标准品（如磷酸乙酸）辅助，通过定量 31P 和 1H NMR 测定 SIL 内标溶液的浓度。 
	注意：上述所有纯度高于 96% 的稳定同位素标记（SIL）内标（IS）均由 Fiedler 团队合成并提供15,27。与核苷酸类似，这些内标可能含有多个结晶水分子和不同的反离子。建议不要通过称量物质并计算浓度的方式确定浓度，而应采用定量 31P NMR 法测定 13C6 标准溶液的浓度。</li>
	<li>在毛细管电泳（CE）样品瓶中，将 10 µL 样品与 0.5 µL 内标混合物混合。样品中最终浓度为：2 µM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4、4 µM [13C6]5-PP-InsP5、4 µM [13C6]1-PP-InsP5、20 µM [13C6]InsP6 和 20 µM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5。</li>
	<li>使用补液系统时，点击 更换瓶子 按钮，将配制好的 250 mL CE 运行缓冲液放入电解质瓶中，然后点击 清洗管路。保持补液针插入装有水的样品瓶中。</li>
	<li>按照 表 1 所示设置电喷雾电离（ESI）和质谱（MS）参数。使用源优化器（Source Optimizer）配合肌醇多磷酸标准品混合物优化源参数。使用 Masshunter Optimizer 对所有标准品获取多反应监测（MRM）参数。根据不同仪器调整 ESI 和 MS/MS 参数。</li>
	<li>对 InsP 提取物进行一次运行，并检查结果（图 2）。当有多个样品时，设置序列运行。</li>
	<li>测量结束后使质谱仪进入待机模式。不要关闭液相色谱（LC）泵。鞘液的流动可保护喷雾针。当无鞘液供应时，应将 CE-ESI-MS 喷雾针更换为 LC-ESI-MS 喷雾针。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>打开定量分析软件（适用于QQQ），为所有样品创建一个批次。</li>
	<li>根据获取的MRM数据创建新方法。将[13C6]InsPs设为内标（ISTD）。检查MRM化合物设置、保留时间设置、内标设置、浓度设置以及定性离子设置。通过验证后退出，将该方法应用于当前批次，并保存方法。</li>
	<li>检查批次中每个色谱峰是否被正确积分；否则，需手动积分峰。</li>
	<li>将结果导出至电子表格。通过比较待测物峰响应值与已知浓度的稳定同位素标记内标（SIL IS）的相应峰响应值，进行肌醇（焦）磷酸盐的定量分析。5-PP-InsP5、InsP6和Ins(1,3,4,5,6)P5的理论与实验校准曲线及其线性范围见表2。 
	注意：使用理论校准曲线的前提是目标分析物具有高质量的同位素分布模式和可信的浓度。需评估线性范围。当无法完全获得上述同位素标准品时，校准曲线对于绝对定量至关重要。</li>
	<li>根据肌醇磷酸提取液中的测定浓度及其体积，计算绝对含量。进一步根据细胞数量或蛋白含量对结果进行归一化处理。基于细胞数量和HCT116细胞的平均细胞体积（1.68 fL），计算细胞内浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Stephens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection%2C+purification%2C+structural+characterization%2C+and+metabolism+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate%28s%29+and+bisdiphosphoinositol+tetrakisphosphate%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s).</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).</li>
<li>Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+inositol+polyphosphate+pyrophosphates+in+pancreatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+Why+so+many+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biological+Regulation%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).</li>
<li>Irvine, R. F., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+in+the+water%3A+the+return+of+the+inositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back in the water: the return of the inositol phosphates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).</li>
<li>Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+inositol+pyrophosphates+on+cellular+energy+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics.</a> Science. 334 (6057), 802-805 (2011).</li>
<li>Wild, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+eukaryotic+phosphate+homeostasis+by+inositol+polyphosphate+sensor+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains.</a> Science. 352 (6288), 986-990 (2016).</li>
<li>Chakraborty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+inhibit+Akt+signaling%2C+thereby+regulating+insulin+sensitivity+and+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain.</a> Cell. 143 (6), 897-910 (2010).</li>
<li>Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+inositol+pyrophosphate+InsP8+directly+modulates+intracellular+Ca2%2B+oscillations+and+controls+C2AB+domain+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).</li>
<li>Hauke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+cell-permeant+caged+inositol+pyrophosphates+controls+oscillations+of+cytosolic+calcium+in+a+%CE%B2-cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line.</a> Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).</li>
<li>Koldobskiy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-mediated+apoptosis+requires+inositol+hexakisphosphate+kinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947(2010).</li>
<li>Rao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase-1+mediates+assembly%2Fdisassembly+of+the+CRL4-signalosome+complex+to+regulate+DNA+repair+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005(2014).</li>
<li>Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+possible+functions+of+inositol+pyrophosphates+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 67(2015).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+between+signalling+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism.</a> The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).</li>
<li>Harmel, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+13C-labeled+myo-inositol+to+interrogate+inositol+phosphate+messengers+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR.</a> Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).</li>
<li>Qiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+inositol+phosphate+metabolism+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nature Communications. 11 (1), 6035(2020).</li>
<li>Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+soluble+inositol+polyphosphates+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+radioactive+labelling+to+elucidate+inositol+polyphosphate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Phosphate+Labeling+and+Sensing+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling.</a> Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+purification+of+inositol+phosphates+from+biological+samples+reveals+that+no+phytate+is+present+in+human+plasma+or+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine.</a> Open Biology. 5 (3), 150014(2015).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PloS One. 4 (5), 5580(2009).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+InsP8+acts+as+an+intracellular+phosphate+signal+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis.</a> Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).</li>
<li>Riemer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITPK1+is+an+InsP6%2FADP+phosphotransferase+that+controls+systemic+phosphate+homeostasis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Whitfield, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATP-responsive+metabolic+cassette+comprised+of+inositol+tris%2Ftetrakisphosphate+kinase+1+%28ITPK1%29+and+inositol+pentakisphosphate+2-kinase+%28IPK1%29+buffers+diphosphosphoinositol+phosphate+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels.</a> The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+mammalian-derived+inositol+poly%2Fpyrophosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates.</a> Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).</li>
<li>Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+inositol+pyrophosphate+biosynthetic+pathway+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi.</a> ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).</li>
<li>Wilson, M. S. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+phosphates+purification+using+titanium+dioxide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads.</a> Bio-Protocol. 8 (15), 2959(2018).</li>
<li>Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+chemoenzymatic+synthesis+of+inositol+pyrophosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates.</a> Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).</li>
<li>Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KO+of+5-InsP7+kinase+activity+transforms+the+HCT116+colon+cancer+cell+line+into+a+hypermetabolic%2C+growth-inhibited+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).</li>
<li>Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+Pyrophosphate+Profiling+of+Two+HCT116+Cell+Lines+Uncovers+Variation+in+InsP8+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels.</a> PloS One. 11 (10), 0165286(2016).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍了一种用于定量哺乳动物细胞中高电荷肌醇焦磷酸盐的实用且灵敏的方法。将该分析方法与目前最先进的高氯酸提取肌醇磷酸酯并结合二氧化钛（TiO2）富集的技术相结合，毛细管电泳-电喷雾质谱（CE-ESI-MS）分析具有前所未有的优势。在通量、灵敏度、稳定性、绝对定量、异构体鉴定以及基质无关性方面，该方法相较于其他方法具有显著优势。本方案适用于哺乳动物细胞，但实际上该策略在多种不同样本中均能成功应用（例如酵母、植物、寄生虫、小鼠组织等）。
所采用的提取方案可完全回收哺乳动物细胞提取物中的焦磷酸肌醇（PP-InsPs）和肌醇六磷酸（InsP6）16,19。该方案同时也会提取许多其他阴离子代谢物，尤其是含磷酸基团的物质，例如糖磷酸酯和核苷酸。使用者需对该方案下目标分析物的回收率及降解情况进行评估。
通常情况下，CE-ESI-MS 系统运行稳定，采用本方案每周可处理约 200 个样品。然而，与 HPLC 不同，毛细管电泳（CE）长期以来被视为仅适用于专家和专业人员的技术，这限制了其市场推广和应用范围。因此，分析实验室通常缺乏 CE-ESI-MS 设备。希望开展 CE-ESI-MS 分析的研究人员可能缺乏 CE 操作经验，因而需要花费更多时间进行故障排查。本文重点强调了几个关键步骤：首要的是毛细管切割的质量，电喷雾（ESI）的灵敏度和稳定性在很大程度上依赖于高质量的毛细管切口。其次，毛细管出口端应精确地伸出喷雾针尖 0.1 mm，喷雾针与 CE 毛细管应保持轴向对齐。良好的 ESI 喷雾质量对定量分析至关重要，应通过技术重复实验评估其重现性。
根据所述方案，PP-InsPs 的定量限（LOQ）为 40 nM，进样条件为 50 mbar 下进样 10 秒（10 nL）。有多种方法可进一步提高该方法的灵敏度。首先，在 100 mbar 下进样 20 秒（40 nL）仍可获得良好的峰形，并足以分辨区域异构体 5-PP-InsP5 和 1-PP-InsP5。其次，可将 InsP 提取物溶解于更少体积的水中。第三，在定量分析时若减少多反应监测（MRM）跃迁的数量，则可增加驻留时间。此外，使用超低鞘液流速的毛细管电泳-质谱（CE-MS）离子源将显著提高灵敏度。
pH 9 的毛细管电泳运行缓冲液可为 InsP6-InsP8 提供最佳分辨效果。当 pH 升高至 9.7 时，InsP3-InsP6 之间的分辨率将显著提高。由于分辨率优异，建议采用较短的 72 cm 毛细管以进一步提高通量。此外，将毛细管电泳盒温度提高至 40 °C 可降低电泳缓冲液的黏度，并在电渗流作用下加快组分的迁移速度。根据不同的研究需求，对该方法进行适当调整可进一步促进肌醇多磷酸（InsPs）和焦磷酸肌醇多磷酸（PP-InsPs）的分析。因此，本文所述的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）方案有望为这一复杂的信号分子家族开辟全新的研究途径。

自1993年首次发现myo-肌醇焦磷酸（PP-InsPs）以来1,2，人们在阐明其生物合成、代谢转换及功能方面已取得显著进展3。肌醇焦磷酸普遍存在于真核细胞中4，作为重要的代谢信号分子，参与调控多种关键生物学过程，例如磷酸盐稳态5,6、胰岛素敏感性7、钙振荡8,9、囊泡运输10、细胞凋亡11、DNA修复12、免疫信号传导13等。肌醇焦磷酸所调控的众多重要生理过程，迫切需要深入理解其在细胞内的丰度、动态变化及亚细胞定位。
尽管肌醇多磷酸（InsPs）和焦磷酸肌醇（PP-InsPs）在多个学科领域引起了广泛关注，但对其丰度的分析通常仍采用20世纪80年代开发的方法，即用氚标记的肌醇对细胞进行标记，随后通过强阴离子交换色谱法（Sax-HPLC）分离提取的PP-InsPs，并结合闪烁计数进行检测。基于质谱的新方法仍面临重大挑战：含有最多八个磷酸基团的肌醇焦磷酸同时具有磷酸酯和酸酐结构，导致分子带有显著的负电荷，并在电离过程中容易发生磷酸基团丢失。哺乳动物中存在四种主要类型的PP-InsPs（图1）：1,5-(PP)2-InsP4（或1,5-InsP8）、5-PP-InsP5（或5-InsP7）、1-PP-InsP5（或1-InsP7）以及5-PP-Ins(1,3,4,6)P4（或5-PP-InsP4）3,14。PP-InsPs的生理浓度通常处于纳摩尔至低微摩尔范围，其中5-PP-InsP5含量最丰富，细胞内浓度为0.5 – 5 µM。1,5-(PP)2-InsP4 和1-PP-InsP5的水平估计约为5-PP-InsP5池的10%，在许多细胞中仍难以检测15。5-PP-InsP4因含有游离羟基，其丰度更低，通常仅在使用氟化钠（NaF）抑制磷酸水解酶时才可被检测到16。
PP-InsPs 的高电荷密度使其分离十分困难，而 PP-InsPs 区域异构体的存在进一步增加了分离的复杂性。因此，大多数实验依赖于使用 [3H]-肌醇对细胞进行代谢放射性标记来实现定量，该方法可排除基质背景干扰，并实现高灵敏度17,18。然而，该方法成本高、耗时长，且无法有效区分结构相关的 PP-InsPs 区域异构体。此外，[3H]-肌醇标记未能考虑葡萄糖内源性合成肌醇的途径。基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的方法是一种广泛应用的低成本替代方案，但其灵敏度有限19,20,21,22。已有其他避免使用放射性标记的方法被报道，包括离子色谱结合柱后衍生化紫外检测23、亲水相互作用色谱（HILIC）24，或弱阴离子交换（WAX）联用质谱（MS）25。然而，这些方法目前尚无法与经典的 [3H]-肌醇 SAX-HPLC 方法相媲美。
最近，毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）作为一种变革性策略被引入用于分析肌醇多磷酸（InsPs）和焦磷酸肌醇（PP-InsPs）的代谢，满足了上述所有要求16。该方法结合目前最先进的高氯酸提取肌醇多磷酸并利用二氧化钛微珠进行富集的技术26，已在从酵母到植物和哺乳动物的多种生物体中成功应用。InsPs 和 PP-InsPs 的同时定性分析得以轻松实现，包括所有可能的区域异构体。使用稳定同位素标记（SIL）的内标实现了快速而精确的绝对定量，且不受基质效应的影响。由于质谱能够检测同位素质量差异，CE-ESI-MS 还可用于研究 InsPs 和 PP-InsPs 在细胞内的区室化合成途径，例如通过向细胞提供 [13C6]-myo-肌醇或 [13C6]-D-葡萄糖进行示踪。
本文详细描述了一种利用毛细管电泳-电喷雾质谱法（CE-ESI-MS）对哺乳动物细胞中焦磷酸肌醇（PP-InsPs）和肌醇磷酸（InsPs）进行绝对定量的逐步实验方案。除了主要的5-PP-InsP5异构体外，本研究还对丰度较低的1,5-(PP)2-InsP4和1-PP-InsP5进行了定量分析。研究采用了来自两个不同实验室（NIH和UCL）的HCT116细胞系，并验证了HCT116UCL细胞中1,5-(PP)2-InsP4的含量比HCT116NIH细胞高出7倍，而5-PP-InsP5的浓度则相近。此外，HCT116UCL细胞中1-PP-InsP5的合成未见显著增加。同时，本研究还定量分析了使用氟化钠阻断去磷酸化过程后PP-InsP水平的升高情况。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td>-</td></tr><tr><td>15 cm 组织培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>168381</td><td>-</td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>623201</td><td>-</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>-</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td>260836</td><td>用于DC蛋白测定</td></tr><tr><td>CE熔融石英毛细管</td><td>CS 色谱法</td><td>105180</td><td>50 &amp;micro;M i.d. 360 &amp;micro;M o.d.</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700</td><td>10 mL，1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L型移液器吸头</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>三磷酸盐</td><td>94550, 94525, 94010, 94005</td><td>50 mL、25 mL、10 mL、5 mL 血清移液管</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>三磷酸盐</td><td>90076</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;化学品与试剂&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem</td><td>A6829,0500</td><td>分子生物学用氢氧化钠颗粒，用于细胞裂解缓冲液的配制</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>-</td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1677373</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>BSA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23209</td><td>用于标准曲线制备的白蛋白标准品（2.0 mg/mL）</td></tr><tr><td>DC 蛋白测定</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>5000116</td><td>DC蛋白检测试剂盒</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td>高葡萄糖，丙酮酸</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106，10500064（热灭活）</td><td>10270106 用于 HCT116&lt;sup&gt;UCL&lt;/sup&gt;, 10500064 用于 HCT116&lt;sup&gt;美国国立卫生研究院&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Carl Roth</td><td>AE73.2</td><td>99.95% LC-MS 级</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH，10%</td><td>Carl Roth</td><td>6756.1</td><td>用于制备 3% NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>-</td></tr><tr><td>高氯酸，70%</td><td>Carl Roth</td><td>9216.1</td><td>用于制备 1 M 高氯酸</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>SERVA</td><td>20760.02</td><td>用于细胞裂解缓冲液的配制</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td>-</td></tr><tr><td>TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 珠粒</td><td>GL Sciences</td><td>5020-75000</td><td>5 &amp;micro;微米级粒径</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>台盼蓝染色液（0.4%）</td></tr><tr><td>超纯（1级）水</td><td>Milli-Q</td><td>ZRQSVP3WW</td><td>型号：Direct-Q 3 UV 水纯化系统</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>30105893</td><td>型号：XPE26；用于称量珠子（每份样品 5–6 mg）</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40002</td><td>型号：LUNA-II 自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Hettich</td><td>1401</td><td>model: UNIVERSAL 320</td></tr><tr><td>带冷却功能的台式离心机</td><td>VWR</td><td>521-1647P</td><td>Microstar 17R 模型</td></tr><tr><td>毛细管电泳系统</td><td>安捷伦</td><td>G7100A</td><td>-</td></tr><tr><td>CE/MS适配器套件</td><td>安捷伦</td><td>G1603A</td><td>-</td></tr><tr><td>CE/MS 喷雾器套件</td><td>安捷伦</td><td>G1607A</td><td>-</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>LUNA 细胞计数载玻片</td></tr><tr><td>离心蒸发仪</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>型号：Concentrator plus 完整系统</td></tr><tr><td>ESI 源</td><td>安捷伦</td><td>AJS ESI</td><td>-</td></tr><tr><td>超级支持膜</td><td>Nisshin EM 公司，东京</td><td>647</td><td></td></tr><tr><td>加湿培养箱</td><td>结合剂</td><td>9040-0088</td><td>型号：CB E6.1，用于哺乳动物细胞培养</td></tr><tr><td>冰盒</td><td>-</td><td>-</td><td>应为样品、培养皿等提供足够的空间</td></tr><tr><td>等度液相色谱系统</td><td>安捷伦</td><td>G7110B 1260 Iso 泵</td><td>型号：Infinity II 四元系统</td></tr><tr><td>MSD</td><td>安捷伦</td><td>G6495C</td><td>三重四极杆</td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>Tecan</td><td>30086375</td><td>型号：SPARK 10 M</td></tr><tr><td>移液管助吸器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10072332</td><td>用于血清移液管</td></tr><tr><td>移液器</td><td>品牌</td><td>705884, 705880, 705878, 705872, 705870</td><td>各种移液器</td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Labnet</td><td>H5500</td><td>型号：Mini LabRoller 旋转器</td></tr><tr><td>Shortix 毛细管柱切割器</td><td>SGT</td><td>S0020</td><td>-</td></tr><tr><td>试管振荡器（涡旋混合器）</td><td>Carl Roth</td><td>HXH6.1</td><td>型号：Rotilabo-Mini Vortex</td></tr><tr><td>倾斜台</td><td>Labnet</td><td>S0600</td><td>型号：EDURO MiniMix 摇摆式混合器</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FSGPD05</td><td>型号：Isotemp GPD 05</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter 工作站</td><td>安捷伦</td><td>版本 10.1</td><td>-</td></tr><tr><td>MassHunter 工作站 LC/MS 数据采集</td><td>安捷伦</td><td>版本 10.1</td><td>-</td></tr><tr><td>MassHunter 工作站优化器</td><td>安捷伦</td><td>版本 10.1</td><td>-</td></tr><tr><td>MassHunter 工作站定性分析</td><td>安捷伦</td><td>版本 10.0</td><td>-</td></tr><tr><td>三重四极杆定量分析</td><td>安捷伦</td><td>版本 10.1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

毛细管电泳电喷雾电离质谱法对肌醇焦磷酸的绝对定量

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）是一类重要的细胞内信号分子。这类分子由肌醇磷酸盐（InsPs）衍生而来，其特征是在myo-肌醇环上至少含有一个高能焦磷酸基团。PP-InsPs普遍存在于真核生物中，作为代谢信使参与调控磷酸盐稳态、胰岛素敏感性以及细胞能量状态。由于这些代谢物缺乏发色团、电荷密度极高且丰度较低，其分析通常需要使用放射性示踪剂，因而过程复杂且成本高昂。本文介绍了一种利用毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）对哺乳动物细胞中肌醇焦磷酸盐进行绝对定量和高通量检测的详细实验方案。该方法能够灵敏地检测哺乳动物细胞中所有具有生物学意义的PP-InsPs分子种类，并实现区域异构体的基线分离。文中展示了包括微量异构体在内的PP-InsPs的绝对细胞浓度，以及在多种实验条件下HCT116细胞中这些分子随时间变化的动态监测结果。

此处展示的结果旨在说明毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）分析的潜力。所报告的图示代表一次技术上无缺陷的CE-ESI-MS运行结果。首先，展示了肌醇焦磷酸标准品混合物（图1）和哺乳动物细胞提取物（图2）的结果。其次，提供了两种HCT116细胞系的比较（图3）以及氟化钠（NaF）处理的HCT116细胞的结果（图4）。
在浓度为 2 µM 时，肌醇（焦）磷酸盐标准品的提取离子电泳图（EIEs）如图1所示。图中插入了哺乳动物体内肌醇焦磷酸盐代谢及其简化结构示意图。利用所述方法可清晰区分哺乳动物体内的四种肌醇焦磷酸盐：1,5-(PP)2-InsP4、5-PP-InsP5、1-PP-InsP5 和 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4。HCT116UCL 细胞的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）检测结果如图2所示。借助稳定同位素标记（SIL）内标，通过将信号响应与已知浓度的添加SIL进行比较，可轻松实现绝对定量。图中展示了从 InsP5 到 (PP)2-InsP4 的肌醇磷酸盐的积分EIEs及其同位素分布模式的未积分EIEs。六次技术重复中所有分析物的相对标准偏差（RSD）均在4%以内。结合测得的浓度和提取物体积，可计算出分析物的总量。再根据细胞数量与细胞体积，或蛋白质含量，通常可获得以绝对细胞浓度（µM）或以蛋白质含量归一化的量（pmol/mg蛋白）作为此类分析的最终结果。
根据之前的一项研究，两批存在差异的 HCT116 细胞中 InsP8 水平存在差异，HCT116UCL 细胞中的 InsP8 水平比 HCT116NIH 细胞高出 6 倍29。利用 CE-MS 方法，可轻松定量 HCT116NIH 细胞中的 1,5-(PP)2-InsP4（图 3），而 HCT116UCL 细胞中的 InsP8 水平比 HCT116NIH 细胞高出 7 倍。此外，HCT116UCL 细胞中 1,5-(PP)2-InsP4 的显著积累伴随着 1-PP-InsP5 的显著增加，这一点在 图 3 中已得到定量展示。
通过使用氟化钠抑制去磷酸化，PP-InsPs 的水平得以升高。对 NaF 处理的 HCT116NIH 细胞进行 CE-ESI-MS 分析，结果显示 -5-PP-InsP5 水平升高，同时 InsP6 减少，并出现 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 （图 4）。此外，InsP8 水平的升高也较为明显，而 1-PP-InsP5 则在一定程度上减少。在 NaF 处理的 HCT116NIH 细胞中，1-PP-InsP5 并未完全消失，但大多低于检测限或定量限。
<img alt="色谱图显示肌醇磷酸代谢通路、化学结构及峰鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：采用所述方案在毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）分析中测得的肌醇（焦）磷酸标准品的典型提取离子电泳图（EIEs）。每种分析物的浓度为 2 µM。进样体积约为 10 nL，进样条件为 50 mbar 下持续 10 s。插图展示了哺乳动物中肌醇焦磷酸的代谢途径。IPPK：肌醇五磷酸2-激酶，IP6K：肌醇六磷酸激酶，PPIP5K：二磷酸肌醇五磷酸激酶，DIPP1：二磷酸肌醇多磷酸磷酸水解酶1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌醇磷酸的HPLC分析，色谱图和柱状图结果，细胞浓度研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：HCT116UCL细胞中肌醇磷酸盐的代表性图谱。（A）HCT116NIH细胞中主要肌醇（焦）磷酸盐的EIE图谱，以及添加的SIL内标物：2 µM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4 （1）、4 µM [13C6]5-PP-InsP5（2）、4 µM [13C6]1-PP-InsP5（3）、20 µM [13C6]InsP6（4）和20 µM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5（5）。插图显示了通过CE-ESI-MS进行的六次技术重复的InsP分析结果，数据以均值±标准差（SD）表示。（B）人源HCT116UCL细胞系中PP-InsPs和InsPs的细胞内浓度；（C）按蛋白含量归一化的PP-InsPs和InsPs含量。数据来自三次独立实验，以均值±标准误（SEM）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="1,5-(PP)_2-InsP_4、5-PP-InsP_5、1-PP-InsP_5 的色谱峰；分析图对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：两种不同来源的 HCT116 细胞中 InsP8 水平的差异。（A）HCT116UCL 与 HCT116NIH 细胞中肌醇焦磷酸（inositol pyrophosphate）的EIE图谱。HCT116UCL 中的 InsP8 显著高于 HCT116NIH。 （B） 两种 HCT116 细胞中肌醇焦磷酸与 InsP6 的比值（%）。HCT116UCL 细胞中的 InsP8 水平是 HCT116NIH 的 7 倍，而 5-PP-InsP5 的水平则相当。数据为三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="色谱图 HCT116 NaF；峰分析；柱状图；蛋白质水平；磷酸盐定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62847/62847fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：NaF 处理后 HCT116NIH 细胞中肌醇（焦）磷酸的水平。（A）经氟化钠处理（NaF，10 mM）的 HCT116NIH 细胞中肌醇（焦）磷酸的 EIE 图谱。通过 NaF 抑制去磷酸化作用，肌醇焦磷酸的水平升高，包括 1,5-(PP)2-InsP4、5-PP-InsP5 和 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4。（B）未处理与 NaF 处理的 HCT116NIH 细胞中肌醇（焦）磷酸的水平（含量按蛋白质含量归一化）。数据为三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/62847fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）参数设置。 离子源参数和iFunnel参数通过离子源和iFunnel优化器进行优化。肌醇（焦）磷酸盐的MSM参数设置通过MassHunter优化器进行优化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：理论与实验回归方程。[13C6]5-PP-InsP5、[13C6]InsP6 和 [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5 的浓度分别为 4 µM、20 µM 和 20 µM。回归方程中，5-PP-InsP5 的浓度分别为 0.04 µM、0.1 µM、0.2 µM、0.4 µM、1 µM、2 µM、4 µM、8 µM、16 µM、24 µM；InsP6 和 Ins(1,3,4,5,6)P5 的浓度分别为 0.2 µM、0.5 µM、1 µM、2 µM、5 µM、10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、120 µM。x 表示浓度，y 表示 (Area InsP)12C/(Area InsP)13C。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62847/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表。</a>

本文描述了一种用于对哺乳动物细胞提取物中的肌醇焦磷酸盐进行绝对定量的毛细管电泳-电喷雾电离质谱分析方法。

肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）是一类重要的细胞内信号分子。它们由肌醇磷酸盐（InsPs）衍生而来，这些分子……

该方法为我们迄今为止测试的所有生物体中的肌醇磷酸代谢提供了高质量的结果。它还将揭示我们目前尚未认知的新的细胞生物合成途径。通过毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）分析肌醇磷酸代谢具有更快的速度、高度的灵敏性，并能够提供肌醇磷酸分子组装的结构信息。首先，建立毛细管电泳-电喷雾电离质谱联用（CE-ESI-MS）系统，该系统由商用毛细管电泳仪和配备安捷伦喷射流电喷雾离子源（Agilent Jet Stream ESI source）的三重四极杆串联质谱仪组成。接着，连接鞘流液1:100分流器与等度液相色谱泵的出口，并确保毛细管电泳系统进样瓶与质谱分析器的喷雾尖端处于相同高度。然后，使用MassHunter Workstation软件或类似质谱软件，控制整个系统并进行数据采集与分析。配制好毛细管电泳运行缓冲液和鞘液后，以每分钟5毫升的流速冲洗5分钟来安装鞘液。然后将流速设置为每分钟1毫升，泵压设置为180 bar。确保回收管路重新连接至鞘液瓶，以重复利用溶剂。接下来，使用带有旋转金刚石刀片的毛细管切割器，正确切割毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）毛细管两端带有紫外检测窗口的部分。然后用打火机去除两端约两到三厘米的聚酰亚胺涂层，并用异丙醇清洁毛细管表面。安装毛细管时，将其准确插入CE-MS卡匣中。然后单击“更换卡盒”按钮，并将卡盒安装到毛细管电泳（CE）设备中。为活化毛细管，首先用1摩尔的氢氧化钠冲洗毛细管，随后用水冲洗10分钟，再用CE运行缓冲液冲洗15分钟。接下来，将毛细管插入CE-MS喷雾头中。使用放大镜和喷雾器上的调节螺丝，精确调整毛细管出口，确保毛细管末端从喷雾器尖端突出约 0.1 毫米。在全扫描模式下检查电喷雾离子源的稳定性，总离子电泳图的波动应控制在 5% 以内。随后，使用肌醇磷酸标准品进行一次测试运行。配制内标混合物后，取10微升样品与0.5微升内标混合物混合，并加入毛细管电泳样品瓶中。使用补液系统时，点击“更换瓶子”按钮。将配制好的250毫升毛细管电泳运行缓冲液加入电解质瓶中。然后点击“清洗管路”，同时将补充针保留在装有水的小瓶中。设置电喷雾电离（ESI）和质谱（MS）参数。使用含肌醇多磷酸标准品混合物的源优化工具优化源参数，并利用MassHunter优化软件对所有标准品进行多反应监测（MRM）条件的优化。接下来，对肌醇磷酸提取物进行检测运行并检查结果。当样本较多时，设置序列。测量结束后，让质谱仪保持待机模式，不要关闭液相色谱泵。当无鞘液供应时，将 CE-ESI-MS 喷雾器更换为 LC-ESI-MS 喷雾器。进行数据分析时，打开定量分析软件，并为所有样品创建一个批处理。接着，根据获得的多反应监测数据创建新方法，并将碳-13标记的肌醇磷酸盐设为内标物。然后，检查多反应监测化合物、保留时间、内标物、浓度和定性离子参数设置。通过验证后退出，将该方法应用于当前批次。保存该方法。然后检查批处理中的每个峰是否已正确积分。若未正确积分，则需手动进行峰积分。将结果导出至电子表格，并通过比较阳极液峰响应与已知浓度的稳定同位素标记内标物的相应峰响应，对肌醇焦磷酸进行定量。最后，根据肌醇磷酸提取液中测得的浓度及其体积，计算其绝对含量，并进一步通过细胞数量或蛋白含量进行归一化处理。根据细胞计数和HCT116细胞的平均细胞体积，计算细胞内浓度。此处显示的是浓度为2微摩尔的肌醇焦磷酸标准品的提取离子电泳图。哺乳动物中肌醇焦磷酸盐的代谢及其简化结构如图所示。此处展示了来自伦敦大学学院（UCL）的HCT116细胞的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）检测结果。采用CE-MS技术定量分析了来自UCL与美国国立卫生研究院（NIH）的HCT116细胞之间IP8水平的差异。来自UCL的HCT116细胞中IP8的水平比来自NIH的细胞高出七倍。HCT116 UCL细胞中1,5-IP8的显著积累伴随着1-IP7的明显增加。对NIH来源的HCT116细胞进行氟化钠处理后的CE-ESI-MS分析显示，5-IP7水平升高，同时IP6减少，并出现5-PPIP4。尽管1-IP7的水平在氟化钠处理的细胞中有所降低，但并未完全消失，大多处于检测限以下。形成稳定的CE-ESI-MS级至关重要。我们建议在测量前检查系统的重复性和灵敏度。该技术可用于研究肌醇磷酸代谢、植入物及组织，同时也为深入研究具有重要生物学意义的肌醇焦磷酸提供了机会。

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毛细管电泳电喷雾电离质谱法绝对定量肌醇焦磷酸盐

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利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

肌醇焦磷酸盐在癌症、糖尿病和肥胖等人类病理过程中发挥着重要作用；然而，其确切的作用机制仍存在争议。由于 commercially available...

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本文介绍了一种全面的毛细管区带电泳方案，用于评估单克隆抗体作为质量属性的内在理化异质性。...

使用中性毛细管进行单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

学习毛细管电泳电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）绝对定量哺乳动物细胞中的肌醇焦磷酸盐。该方法快速灵敏，可提供结构信息，有助于深入研究细胞信号传导和代谢途径。

毛细管电泳电喷雾电离质谱法对肌醇焦磷酸的绝对定量

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