Name: 加载编码RNA核酸适体和核糖开关的DNA质粒的多功能丝基微胶囊的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 了解利用丝素蛋白微胶囊固定DNA质粒模板以制备多功能生物传感器的实验方法。该技术可保持DNA传感器功能，用于研究基因激活动力学和体外生物过程监测。

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本工作获得了美国空军科学研究办公室 LRIR 16RH3003J 拨款以及用于军事环境的合成生物学应用研究（Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&amp;美国国防部研究与工程副部长办公室的#38;T优先（ARAP）计划
ThyRS 的质粒载体序列（pSALv-RS-GFPa1，3.4 kb）由马萨诸塞州塔夫茨大学的 J. Gallivan 博士慷慨提供。Bombyx mori 家蚕的蚕茧由塔夫茨大学的 D.L. Kaplan 博士慷慨捐赠。

1. 质粒载体的构建。
<ol>
	<li>构建质粒载体（pSALv-RS-GFPa1，3.4 kb），通过扩增来自pJ201:23976-RS-GFPa1载体（由DNA2.0设计并构建）中茶碱核糖开关（ThyRS）与GFPa1融合的编码序列，并将其插入 E. coli 表达载体，pSAL13. 使用上游引物（5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3'）和下游引物（5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3'）扩增与 GFPa1 融合的 ThyRS 编码序列，并进行 PCR 反应 50 µL 按照制造商方案，使用DNA聚合酶扩增体积14.</li>
	<li>准备1%琼脂糖凝胶，使用0.5 g琼脂糖、50 mL TAE缓冲液（40 mM Tris乙酸盐，1 mM EDTA，pH 8.0）以及 3 µL DNA染料</li>
	<li>混合 5 µL PCR扩增产物的等分试样 5 µL 无RNase/DNase水 2 µL 加入6x上样缓冲液，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用DNA分子量标准（0.1–10.0 kb）作为参照。以120 V电压电泳，直至染料前沿接近凝胶底部。</li>
	<li>使用紫外透射成像系统观察DNA片段，以确认DNA片段大小是否正确15.</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商的说明书纯化PCR产物16.</li>
	<li>用 KpnI 和 BlpI 限制性内切酶对PCR产物和pSAL表达载体进行双酶切消化 15 µL 反应，包含 10 µL PCR 产物或质粒载体（浓度 20-50 ng/µL), 1.5 µL 10倍酶缓冲液 1 µL 每种酶的 1.5 µL 无RNase/DNase水，于 37 °C 2小时。</li>
	<li>添加 3 µL 向反应混合物中加入6x上样缓冲液，在1%琼脂糖凝胶上分离消化产物，具体步骤如1.3-1.5所述。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒，按照生产商提供的操作说明纯化DNA片段16.</li>
	<li>将消化后的PCR产物与经消化线性化的质粒载体pSAL使用T4 DNA连接酶及配套连接酶缓冲液进行连接反应，置于 10 µL 含有3-20 fmol的酶切载体和9-60 fmol的酶切PCR产物的反应体系 2 µL 连接酶缓冲液， 1 µL (1单位) T4 DNA连接酶，以及无DNase/RNase的水。将连接反应在 25 °C 3小时。 
	注意：确保反应混合物中的总DNA含量为0.01–0.1 µg.</li>
	<li>转化 E. coli 根据制造商说明书，将10 ng连接反应混合物加入DH5α感受态细胞中17.</li>
	<li>培养转化后的细胞 37 °C 在添加氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养100 µg/mL).</li>
	<li>从平板上挑取3-4个细菌菌落，分别无菌转移至5 mL添加氨苄青霉素（ampicillin）的LB培养基中100 µg/mL。在过夜培养条件下培养菌液 37 °C 在225 rpm的摇床培养箱中。</li>
	<li>通过离心沉淀过夜培养物，离心条件为 11 x g 室温下持续3分钟。</li>
	<li>使用纯化试剂盒，按照生产商提供的操作说明纯化质粒16.</li>
	<li>通过DNA测序验证纯化质粒的序列。所得重组质粒（pSALv-RS-GFPa1）的质粒图谱及序列如图所示。 图1.</li>
</ol>
2. 大规模 DNA 纯化。
<ol>
	<li>根据制造商的说明17，将质粒载体 pSALv-RS-GFPa1（3.4 kb，编码茶碱核糖开关与GFPa1报告基因）或 pET28c-F30-2xBroccoli（5.4 kb，编码Broccoli适配体）转化至 E. coli DH5α 感受态细胞中。</li>
	<li>在添加氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB-琼脂平板上培养转化后的 pSALv-RS-GFPa1 载体细胞，或在添加卡那霉素（50 µg/mL）的LB-琼脂平板上培养转化后的 pET28c-F30-2xBroccoli 载体细胞，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>从平板上挑取3-4个细菌菌落，无菌条件下将每个菌落分别转移至5 mL添加相应抗生素（100 µg/mL氨苄青霉素或50 µg/mL卡那霉素）的LB培养基中，于37 °C、225 rpm振荡培养箱中过夜培养。</li>
	<li>取3 mL过夜培养物接种至150 mL添加相应抗生素（100 µg/mL氨苄青霉素或50 µg/mL卡那霉素）的LB培养基中，于37 °C、225 rpm振荡培养箱中过夜培养。</li>
	<li>在4 °C条件下，以≥3400 × g 离心10分钟，收集菌体沉淀。</li>
	<li>根据制造商的说明16，使用质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA。</li>
	<li>用0.5 mL无DNase/RNase的纯水洗脱DNA，测定DNA浓度，并配制1 mL DNA储备液（100 ng/µL）。将含DNA的离心管置于4 °C保存，待后续使用。</li>
</ol>
3. 蚕丝纤维蛋白的提取及初始材料的制备。
<ol>
	<li>根据先前详细描述的方法，制备来自Bombyx mori家蚕茧的重组丝素蛋白（SF）水溶液，以得到占 Silk-LiBr 溶液10%的浓度18。</li>
	<li>测定水相丝素蛋白溶液的最终浓度。取0.5 mL丝素溶液加入60 mm培养皿中，在60 °C下干燥，称量干燥后丝素薄膜的重量。将干重除以0.5 mL，计算出重量/体积百分比。</li>
	<li>使用无DNase/RNase的去离子水，通过移液管缓慢加水稀释浓缩的丝素溶液，获得终浓度为1 mg/mL的溶液。将该溶液储存于4 °C，以备后续使用。</li>
	<li>使用荧光标记试剂盒制备荧光标记的丝素蛋白。取1 mL浓度为2 mg/mL的丝素蛋白溶液，根据生产商说明书，将蛋白的N端α-氨基与NHS酯活化的荧光染料衍生物进行偶联19。</li>
	<li>制备50 mL浓度为6 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）水溶液，用1 M HCl调节pH至4。通过无菌0.2 µm滤膜过滤溶液。该溶液可在室温下保存数月。</li>
	<li>制备SiO2核颗粒。将300 µL SiO2颗粒移入2 mL微量离心管中。用1 mL无DNase/RNase的水洗涤微粒两次，每次在0.2 × g离心1分钟。</li>
</ol>
4. 进行逐层沉积，依次形成引发层、DNA质粒层和丝素层。
<ol>
	<li>将1 mL PEI溶液加入步骤3.6中离心沉淀的SiO2微粒中，以800 rpm在常温条件下于恒温混匀仪中振荡混合15分钟。通过在0.2 × g下离心1分钟，用1 mL无DNase/RNase的去离子水洗涤颗粒四次。</li>
	<li>为沉积DNA层，将步骤2.7中制备的1 mL质粒DNA水溶液加入经PEI预处理的微粒中，在4 °C、800 rpm条件下于恒温混匀仪中轻柔振荡15分钟。若需制备不同DNA载量的微胶囊，可使用无DNase/RNase的蒸馏水将质粒DNA浓度调节至50–200 ng/µL，并取1 mL该溶液用于DNA沉积。在0.2 × g下离心1分钟收集微粒。</li>
	<li>将编码茶碱核糖开关与GFPa1融合的质粒DNA标记为ThyRS-GFPa1，编码Broccoli适体的质粒DNA标记为BrocApt。 
	注：实验过程中应将装有DNA的微量离心管置于冰上保存。</li>
	<li>小心移除上清液，并在每次离心（0.2 × g，1分钟）后弃去上清液，用1 mL无DNase/RNase的蒸馏水对微粒洗涤四次。除非另有说明，所有实验均在室温（RT）下进行。</li>
	<li>为沉积丝素蛋白层，将步骤3.3中重构的1 mL水相丝素蛋白（SF）溶液加入已吸附DNA的微粒中，轻轻涡旋并混合，在10 °C、750 rpm条件下于恒温混匀仪中振荡15分钟。在4 °C、0.2 × g下离心1分钟收集微粒，移除上清液后用1 mL无DNase/RNase的蒸馏水洗涤一次。重复离心并弃去上清液。 
	注：实验过程中应将丝素蛋白溶液置于冰上，以防止温度诱导的凝胶化。</li>
	<li>逐步用甲醇处理微粒以诱导丝蛋白结构中β-折叠的形成。首先加入0.5 mL无DNase/RNase的蒸馏水，涡旋混匀微量离心管，随后加入0.5 mL 100%甲醇。在10 °C条件下于恒温混匀仪中轻柔振荡5分钟。在0.2 × g下离心1分钟收集微粒，移除上清液。</li>
	<li>用甲醇进一步处理微粒以促进β-折叠形成，并确保丝素蛋白层的牢固物理吸附。加入1 mL 100%甲醇，在10 °C、750 rpm条件下于恒温混匀仪中轻柔振荡10分钟。</li>
	<li>在4 °C、0.2 × g下离心1分钟收集微粒，每次用1 mL无DNase/RNase的蒸馏水洗涤两次，每次离心前轻轻涡旋并弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤4.5–4.8共20次，以获得多层丝素蛋白核壳结构。最后一次沉积步骤使用步骤3.4中制备的荧光标记丝素蛋白（Silk-DyLight550，1 mL）。</li>
	<li>完成最后一次洗涤后，将微粒保存在1 mL无DNase/RNase的蒸馏水中，置于常温条件下。 
	注：为防止丝素蛋白层沉积过程中微粒聚集，应对悬浮液进行目视检查，并使用1 mL移液枪头反复吹打以促进微粒均匀分散。</li>
	<li>使用公式（1）计算每个微胶囊中包封的质粒DNA拷贝数NDNA： 
	<img alt="用于分子量计算的DNA定量公式；化学研究符号。" src="/files/ftp_upload/62854/62854eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （1） 
	其中 N = 6.769 × 1011 —— 用于包封的SiO2核心颗粒数量；可通过已知浓度二氧化硅颗粒的标准曲线（基于系列稀释及在λ = 320 nm处的A320吸光度）计算得出； 
	C —— 吸附所用DNA的初始浓度； 
	V —— 吸附所用DNA的体积； 
	0.8 —— DNA在核心颗粒上的吸附效率； 
	Mw —— 质粒DNA的分子量； 
	NA —— 阿伏伽德罗常数（6.022 × 1023）</li>
</ol>
5. 溶解微芯以获得丝素蛋白微胶囊。
<ol>
	<li>通过将浓氢氟酸（48%）用蒸馏水稀释，配制8%的氢氟酸（HF）溶液（pH 5.5）。取一个50 mL离心管，小心地用移液器移取5 mL HF，加入25 mL蒸馏水，得到8%的HF溶液。 
	注意：HF是一种强腐蚀性酸，可能对组织造成严重灼伤。在实验操作和使用HF时必须格外小心。请严格遵守机构制定的HF安全操作规程（SOP），以避免意外泄漏事故。不得使用玻璃容器稀释HF。此步骤应在化学通风橱中进行。</li>
	<li>向步骤4.10中获得的核-壳微粒沉淀中加入1.5 mL 8% HF溶液，以溶解SiO2核。轻轻涡旋混匀，并在常温条件下以450 rpm轻柔振荡过夜，使核完全溶解。 
	注意：为防止HF泄漏，可用封口膜密封微量离心管。此步骤应在化学通风橱中进行。</li>
	<li>准备一个2 L的玻璃烧杯，加入2 L去离子水。将微胶囊溶液转移至透析装置（截留分子量50 kDa）中，并在去离子水中透析，接下来3天内每3小时更换一次水。 
	注意：在前三次换水过程中收集上清液，并按照危险废物处理规程予以废弃。</li>
	<li>使用1 mL移液器将透析装置中的悬浮液转移至新的2 mL微量离心管中，以收集微胶囊。 
	注意：微胶囊的水溶液可在常温条件下保存数年。</li>
</ol>
6. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对丝素蛋白微胶囊进行成像。
<ol>
	<li>使用DNA染料进行DNA染色。
	<ol>
		<li>将300 µL空心丝素蛋白微胶囊转移至一个新的1 mL微量离心管中，加入500 µL无RNase/DNase的蒸馏水。</li>
		<li>加入5 µL DNA染色染料，短暂涡旋混匀，于室温避光孵育2 h。</li>
		<li>每次以0.1 × g离心20 min（4 °C），共洗涤四次；每次小心移除400 µL上清液，并补充400 µL无RNase/DNase的蒸馏水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在配备三种主要激光器（405 nm、488 nm、561 nm）的倒置共聚焦显微系统上，使用100倍油镜（NA 1.49）对丝素胶囊进行成像。将100 µL胶囊样品转移至8孔腔室载玻片的单个孔中，成像前静置20–30 min，使胶囊充分沉降。 
	注意：染料对光漂白非常敏感。成像前应用铝箔覆盖载玻片以保护样品。</li>
</ol>
7. 使用分子量截留值（MWCO）法估算中空微胶囊的渗透性。
<ol>
	<li>分别制备2 mL的FITC标记的葡聚糖荧光素溶液（20 µM，diH2不同M的Ow （4 kDa、20 kDa、40 kDa、70 kDa、150 kDa、250 kDa、500 kDa 和 2 MDa）</li>
	<li>移液器 100 µL 将微胶囊悬浮液加入到玻璃培养皿滑片的单个孔中。分别分析每种微胶囊设计（PEI浓度、DNA质粒载量、丝素蛋白浓度以及层数）。</li>
	<li>向每个孔中加入 300 µL 从最低 M 开始的特定荧光染料溶液w 直至最高刻度，使每个孔对应特定的荧光染料溶液。通过反复吹吸混匀，室温孵育1小时，直至荧光染料溶液扩散达到平衡。</li>
	<li>将载玻片转移至共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），使用100倍油镜物镜在激发波长λ = 488 nm下对每个孔进行成像。
	<ol>
		<li>通过调节焦平面来确定感兴趣区域，确保胶囊呈现为最大直径的圆形。通常在观察因重力作用而沉降到孔板底部附近的样本时，可达到此效果。</li>
		<li>通过在 XY 方向上移动载玻片，采集多个微胶囊样品的图像。每个样品拍摄图像，确保涵盖 100–150 个微胶囊。</li>
		<li>使用 ImageJ 软件分析每个 M 中胶囊膜的通透性w 通过比较胶囊内外的荧光强度来测定荧光染料溶液。为此，绘制一个圆形的兴趣区域（ROI），以勾勒出胶囊的轮廓，然后点击 分析/测量 测量内部的荧光强度。将数据整理成电子表格。对每个微胶囊重复此操作，总计200-300个微胶囊。</li>
		<li>以相同方式评估外部荧光强度，勾画感兴趣区域（ROI），并在远离胶囊的位置测量荧光强度。进行3-5次测量以用于统计分析。</li>
		<li>为进行统计分析，使用配对样本比较胶囊内外的荧光强度 t-test (p &lt; 0.05).</li>
		<li>使用转换 表 2 基于不同分子量的FITC-葡聚糖的流体动力学半径来估算微胶囊的通透性 Mw.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 体外 丝素微胶囊中合成茶碱核糖开关的激活
<ol>
	<li>配制1 mL 茶碱储备液（100 mM，DMSO）。配制 E. coli S30 提取系统通过在冰上解冻组分 40 分钟来处理环状 DNA。</li>
	<li>获取一个 0.5 mL 无 DNase/RNase 的微量离心管。执行 体外 转录/翻译反应，按以下顺序将无细胞组分与微胶囊样品混合（50 µL 总体积）：不含氨基酸的 S30 预混液（20 µL）；S30 提取物，环状（15 µL）；完全氨基酸混合物（5 µL）；含有第4.10步中ThyRS-GFPa1质粒的中空微胶囊（9 µL）；以及茶碱，100 mM DMSO（1 µL). 
	注意：加入所有组分后，短暂涡旋混匀离心管，并在0.2 × g下短暂离心收集样品 g 几秒钟。</li>
	<li>将试管在指定条件下孵育 30 °C 孵育4小时，使用激发波长λ = 488 nm、GFP/FITC滤光片（发射波长510 nm ± 20 nm）在酶标仪上检测荧光。</li>
	<li>使用488 nm和561 nm激光在任意激光共聚焦显微系统（LCSM）上对胶囊进行成像。采用100倍油浸物镜和8孔腔室载玻片以获得最佳质量图像。</li>
</ol>
9. 体外 丝微胶囊中西兰花适配体的激活
<ol>
	<li>配制1 mL DFHBI-1T染料的储备液（30 µM，二氢2O) 将PURE（使用重组元件的无细胞蛋白合成）反应试剂盒的各组分置于冰上解冻40分钟，以完成配制。</li>
	<li>获取一个0.5 mL无DNase/RNase的微量离心管。执行 体外 通过以下顺序将无细胞反应组分与微胶囊样品混合，进行转录反应（50 µL 总体积）：溶液A（20 µL）；溶液B（15 µL）；含有第 4.10 步 BrocApt 质粒的中空微胶囊（14 µL）；以及 DFHBI-1T 染料（1 µL). 
	注意：加入所有组分后，短暂涡旋混匀试管，并在0.2 × g下短暂离心收集样品。 g 几秒钟。</li>
	<li>将试管在指定条件下孵育 37 °C 孵育6小时，然后使用激发波长λ在酶标仪上检测荧光ex = 470 nm，发射波长为 λem = 510 nm ± 20 nm</li>
	<li>使用488 nm和561 nm激光在任意激光共聚焦显微镜（LCSM）系统上对胶囊进行成像。采用100倍油浸物镜和8孔盖玻片培养板载玻片，以获得最佳质量的图像。</li>
</ol>

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本文所表达的观点和意见仅代表作者个人，不一定代表美国国防部或其下属部门的观点

选择性透过的水凝胶微胶囊可按照本方案制备，其中装载有多种类型的DNA编码传感器设计。逐层自组装（LbL）方法的一个显著特征是在自下而上的构建过程中可调控微胶囊的复杂性，该过程通常始于分子物种在牺牲模板上的吸附。通过精确调节初始组分的浓度、pH条件以及层数，可制备出具有不同DNA载量参数、功能特性及可调渗透性的微胶囊。23为了增强胶囊的多功能性，可通过在壳层表面进一步功能化修饰金纳米颗粒（AuNPs）和免疫球蛋白G（IgG），从而开发出可用于生物相容性传感载体的系统 体内 诊断。这两种替代途径均依赖于丝素蛋白独特的分子结构。原位还原金3+ 由于存在酪氨酸残基（5.3% mol.），在合适的还原缓冲液条件下可实现金属离子的还原。特异性抗体可与功能化蛋白微胶囊表面的金纳米颗粒（AuNPs）进行偶联 通过 碳二亚胺活化化学的实施。这两个步骤都需要仔细开发和优化实验方案，以确保生物传感器胶囊在后续应用中具备适当的功能。例如，若要将这些微胶囊用作 &#34;智能&#34; 递送系统，其中分子载荷在特定刺激（如pH或化学信号）下释放，应表征并优化...

合成生物学领域通过利用微生物进化出的天然机制来监测其环境及潜在威胁，为开发传感功能提供了独特的机会。重要的是，这些传感机制通常与保护微生物免受有害暴露的响应相关联，通过调控基因表达以减轻负面影响或阻止有毒物质的摄入。目前已有大量研究致力于改造这些微生物，利用这些天然响应机制构建全细胞传感器，但将其重新设计以识别新的目标分子和/或产生可测量的信号（通常是荧光）用于定量分析1,2。然而，由于基因改造微生物（GMOs）在环境或人体中应用时存在全细胞或部分遗传物质泄漏的风险，即使其被封装在聚合物基质中，人们对此仍存有担忧，因此有必要探索利用这些传感策略的替代方法3。
一种无需担忧转基因生物（GMOs）释放问题即可利用微生物传感优势的有效方法是使用 体外 转录/翻译（IVTT）系统。从实际角度来看，IVTT系统包含大多数处于活性状态的细胞组分混合物，该混合物已被 &#34;提取的&#34; 通过超声处理、珠磨或其他不同方法从细胞中提取4该过程的最终产物是一种已优化的生化反应混合物，可用于转录和翻译，能够用于测试不同的传感器 &#34;敞口容器&#34; 形式，且不受使用完整细胞（如膜扩散、转化效率、细胞毒性等）相关限制的影响。重要的是，可定量添加不同的传感器组分，并通过多种光学和光谱技术研究其效应，正如我们已展示的那样5人们注意到，体外转录翻译（IVTT）系统的性能可能存在不一致性；然而，近期研究已提出标准化其制备与表征的方法，这在研究IVTT系统用于传感器设计的性能时具有重要意义。6最近，已有许多实例展示了利用冻干技术将体外转录翻译（IVTT）系统的组分固定在纸质基质上，以构建基于纸张的检测方法，包括对重金属离子、药物、群体感应元件及其他物质的检测。7,8,9基于体外转录翻译（IVTT）的传感器一个令人期待的应用领域是其在多种环境中的检测应用，包括土壤、水体和人体。为了将这些IVTT系统部署到这些具有挑战性的环境中，需要采用封装策略来容纳IVTT组分，并保护其免受降解。
用于体外转录翻译（IVTT）系统的最常见封装方法包括使用脂质体胶囊、胶束、聚合体囊泡以及其他紧密封闭的微容器10,11,12。该方法的一个缺点是需要引入被动或主动机制，以实现物质在容器内外的运输，从而与外部环境进行通信并提供传感功能。为克服其中一些问题，本研究报道了一种简单而有效的方法，用于封装不同传感器设计所需的编码材料，使其可在IVTT系统中表达。该方法基于在目标质粒存在的情况下，采用逐层（Layer-by-Layer, LbL）沉积生物聚合物的方式，形成具有高孔隙率的中空微胶囊，从而使受保护的遗传物质能够与所选IVTT系统的各种组分相互作用。研究证明，封装的质粒在该聚合物基质内被激活后，能够指导转录和翻译过程，这一点已通过质粒编码的适配体和核糖开关对其相应靶标的响应得到验证。此外，这种LbL包覆层可在无需特殊储存条件的情况下，保护质粒长达数月之久.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-2-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-咪唑-5(4H)-酮 (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5× T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6× 蓝色凝胶上样染料</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，黑色圆形</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>生物试剂，用于分子生物学，低电渗（EEO）</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>粉末或晶体，生物试剂，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>BlpI 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>Corning 一次性真空过滤/储存系统</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜，DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS 试剂，&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>质粒 DNA，pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb)，BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>质粒 #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 抗体标记试剂盒（Invitrogen）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>用于环状 DNA 的大肠杆菌 S30 提取物系统</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆锥形离心管，15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆锥形离心管，50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 微量离心管，1.5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>氢氟酸，HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS 试剂，48%</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>卡那霉素 A（主要成分）与卡那霉素 B 和 C 的混合物</td></tr><tr><td>KpnI 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>添加 100 &amp;micro;g/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>预浇注含 100 &amp;micro;g/mL 氨苄青霉素的琼脂平板</td></tr><tr><td>添加 50 &amp;micro;g/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>预浇注含 50 &amp;micro;g/mL 卡那霉素的琼脂平板</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Lennox 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>溴化锂，LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus，&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>高效感受态大肠杆菌 DH5-&amp;alpha; 菌株</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>无水，99.8%</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Reference 水纯化系统</td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-二甲氨基丙基)-N&amp;prime;-乙基碳二亚胺盐酸盐，EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1× PBS，pH 7.4</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>平均分子量 ~25,000</td></tr><tr><td>PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin 质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>&amp;nbsp;27104</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load 2-Log DNA 标准品（0.1–10.0 kb）</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? 二氧化硅微球，4.0 &amp;micro;m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24331-15</td><td>10% 水溶液</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 透析夹，3.5K 截留分子量，15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠，Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS 试剂，无水，&amp;ge;99.5%，粉末</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 透析装置</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染色剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶（5 U/&amp;micro;L）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>茶碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>无水，&amp;ge;99%，粉末</td></tr><tr><td>Tris 乙酸盐-EDTA 缓冲液（TAE 缓冲液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>含 40 mM Tris-乙酸盐和 1 mM EDTA，pH 8.3。</td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II 质粒大提试剂盒</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

制备负载编码rna适配体和核糖开关质粒dna的多功能丝素微胶囊

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

我们介绍一种通过在可牺牲球形核心上采用逐层自组装（Layer-by-Layer, LbL）方法制备载DNA丝素蛋白微胶囊的方案。在吸附初始层和DNA质粒后，通过对单层丝素蛋白进行快速脱水，诱导丝素二级结构中β-折叠的形成，从而促进稳定微胶囊的构建。因此，层状结构的形成依赖于多重氢键和疏水相互作用。在多层壳结构吸附完成后，核-壳结构可进一步功能化修饰金纳米颗粒（AuNPs）和/或抗体（IgG），用于远程传感和/或靶向递送。通过调节在二氧化硅微球上依次沉积关键大分子过程中的多个关键参数，如聚合物引物的存在、DNA和丝素蛋白的浓度以及吸附层数，可获得具有可变通透性和DNA负载量的生物相容性载DNA微胶囊。在二氧化硅核心溶解后，该方案成功制备出中空且稳定的微胶囊，其中DNA质粒被固定于胶囊膜的内表面。在DNA质粒与外部环境之间构建一层选择性通透的生物相容性膜，可在长期储存过程中保护DNA，并对空间受限质粒产生的输出响应增强起到重要作用。DNA模板的活性及其可及性在以下过程中进行了检测 体外 无细胞转录和翻译反应。编码RNA发光适体和核糖开关的DNA质粒在壳膜中通过相应的分析物成功激活，并通过荧光标记的RNA转录本或GFPa1蛋白的定位可视化。

本研究探讨了编码不同传感器设计（两种类型的RNA调控的转录/翻译元件）的DNA模板在丝蛋白微胶囊封装后的功能表现。微胶囊通过模板化逐层自组装（Layer-by-Layer, LbL）关键组分制备而成，主要包括：底层、编码传感器设计的DNA质粒以及丝素蛋白生物聚合物（图2）。大分子以分层方式沉积，可基于吸附层之间的分子间和分子内相互作用以及壳层厚度，调控胶囊膜的渗透性。该系统可调节的渗透性为控制必需小分子的扩散、同时限制大分子等不需要的物质穿过胶囊膜提供了可能20。
当严格按照方案操作时，可制备出尺寸均一（4.5 µm）、结构稳定的丝素蛋白微胶囊，其在水合状态下的壳层厚度约为500 nm（20层）（图3）21。通过逐层自组装（LbL）方法，可根据质粒的初始浓度调节DNA模板的载量。通过将DNA模板的初始浓度调节在50–200 ng/µL范围内，可实现最佳DNA载量。<st...

该方案描述了用于多重检测的坚固且生物相容的载DNA微胶囊的制备方法 体外 能够追踪多种配体的生物传感器

制备负载编码RNA适配体和核糖开关质粒DNA的多功能丝素微胶囊

我们介绍一种通过在可牺牲球形模板上采用逐层（LbL）自组装方法制备载DNA丝素蛋白微胶囊的方案。

本方案的意义在于，通过将DNA质粒模板固定在半透性生物相容性微胶囊中，提供了一种保持DNA编码传感器功能性的方法。所提出的DNA固定技术具有多功能性，可实现具有不同体外激活机制的多功能生物传感器的构建。我们设想，将这些微胶囊与适当的传感元件结合，可用于研究不同的生物过程，包括在生物膜和器官等不同环境中信号分子的释放。该技术可为微尺度下的生物系统提供深入见解，特别是DNA固定化和分子拥挤如何影响基因激活的动力学与机制。首先，在牺牲性二氧化硅（SiO₂）微粒上沉积聚乙烯亚胺引发层：向含有300微升微粒的2毫升微量离心管中加入1毫升聚乙烯亚胺溶液。在室温条件下，将混合物置于ThermoMixer上以800转/分钟的速度振荡。在室温下以0.2 ×g离心1分钟收集微粒，并小心移除上清液。15分钟后，用1毫升无DNase和RNase的去离子水对微粒进行4次洗涤，每次洗涤在室温下以0.2 ×g离心1分钟，并在每次离心后弃去上清液。接下来，用无DNase和RNase的去离子水将DNA质粒的浓度调整至每微升50至200纳克，并取1毫升制备好的溶液将DNA沉积到聚乙烯亚胺预处理的微粒上。在4摄氏度、800 rpm条件下，用ThermoMixer轻轻振荡微粒混合物15分钟，然后在0.2 ×g离心1分钟收集微粒。标记试管：编码茶碱核糖开关并偶联GFPa1的DNA质粒标记为ThyRS-GFPa1，编码Broccoli适体的DNA质粒标记为BrocApt。小心移除上清液，然后用一毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水将微粒洗涤四次，每次离心后弃去上清液，操作方法如前所述。为沉积丝素蛋白层，向吸附了 DNA 的微粒中加入一毫升重建的水相丝素蛋白溶液，在 ThermoMixer 上以 750 转/分钟轻轻涡旋振荡 15 分钟，温度为 10 摄氏度。通过离心收集微粒，然后用一毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤一次，操作方法如前所述。重复离心，并弃去上清液。加入0.5毫升经蒸馏的DNase和RNase水溶液，通过涡旋振荡混合微粒。然后，在ThermoMixer上用0.5毫升100%甲醇于10摄氏度处理微粒5分钟。离心收集微粒后，在 ThermoMixer 上以每分钟 750 转的速度用 100% 甲醇在 10 摄氏度下处理 10 分钟，以形成 β-折叠结构。在 4 摄氏度下以 0.2 ×g 离心 1 分钟，收集微粒，随后用 1 毫升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤微粒两次，方法如前所述。通过向沉淀的核壳微粒中加入 8% 氢氟酸溶液，溶解微粒中的 SiO₂ 核心。将溶解的颗粒溶液转移至透析装置中，并在烧杯中用去离子水进行透析。然后，使用1 mL移液器将透析装置中的丝素蛋白微胶囊悬浮液收集到新的2 mL微量离心管中。取100 µL微胶囊样品加入八孔腔室载玻片的单个孔中，在使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像前，静置20至30分钟使胶囊沉降。用移液器将100微升胶囊悬浮液加入玻片培养皿的每个孔中。随后，依次向每个孔中加入300微升不同分子量的荧光染料溶液，从最低分子量到最高分子量逐步添加。通过反复吹打混匀混合液，并在室温下孵育1小时，直至荧光染料溶液的扩散达到平衡。随后，将载玻片转移至共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），使用100倍油镜物镜，以488纳米激发波长对每个孔进行成像。通过调节焦平面确定感兴趣区域，并聚焦于呈现最大直径圆形的微胶囊。依次向微胶囊样品中加入无细胞组分，进行体外转录/翻译反应，并将反应管在30°C下孵育4小时。使用488纳米的激发波长，并在约510纳米的GFP/FITC滤光片下通过酶标仪检测荧光。最后，使用488纳米和561纳米激光在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）系统上对丝素蛋白微胶囊进行成像。在该研究中，制备了具有均一尺寸（约4.5微米）和约500纳米壳层厚度的稳定丝素蛋白微胶囊。通过分子量截留法分析了中空丝素蛋白微胶囊壳的渗透性。聚乙烯亚胺引物层浓度的增加可提高微胶囊的胶体稳定性，并使其壳层更具渗透性；而去除引物层则导致壳膜渗透性降低的微胶囊发生聚集。在ThyRS激活过程中，绿色荧光蛋白a1（GFPa1）的表达动力学显示，装载于丝素蛋白微胶囊内的DNA质粒相较于未包封的对照组DNA，能够实现更高的GFPa1基因激活水平。在代表性分析中，展示了每个胶囊载有32个DNA拷贝的丝素蛋白胶囊在体外转录和翻译系统中孵育前后共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。丝素蛋白胶囊的横截面强度分布图显示了GFPa1的表达。比较了每个胶囊载有30个DNA拷贝的20层丝微胶囊与未包封DNA对照组的转录动力学。与相同浓度的非包封DNA样品相比，丝素微胶囊产生的信号更强，证实了丝素微胶囊的有效性。按照本方案，可采用多种高分辨率显微技术对固定状态下的DNA缠结现象以及体外解耦的基因激活过程进行成像。该技术可用于研究最小人工细胞中分子水平的动力学过程。具体而言，当与适当的基因元件结合时，这些微胶囊可用于研究细胞间通讯。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

加载编码RNA核酸适体和核糖开关的DNA质粒的多功能丝基微胶囊的制备

细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。本方案详细介绍了如何将该系统应用于多种不同场景的操作步骤。...

细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

递送仍是小干扰RNA（siRNA）在治疗应用中的主要挑战。本方案采用一种多功能且生物相容的siRNA递送平台，由精氨酸和聚乙烯亚胺接枝的多孔硅微粒组成。...

多孔硅微粒用于递送siRNA治疗剂

我们提出了一种新方法，该方法利用光响应性嵌段共聚物实现高效的时间和空间基因沉默控制，且未检测到脱靶效应。此外，通过简单的siRNA释放实验和简化的动力学建模即可预测基因表达的变化。...

通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本研究通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法制备了甲硫氨酸功能化的生物相容性嵌段共聚物（mBG），并考察了所得mBG与质粒DNA的复合能力及其转染效率。RAFT方法在聚合含有特殊官能团的单体方面具有显著优势。...

用于靶向质粒DNA递送的甲硫氨酸功能化生物相容性嵌段共聚物

本文介绍了一种利用天然阳离子多糖壳聚糖和合成线性聚乙烯亚胺（LPEI）包被来保护在低镁且富含核酸酶环境中DNA折纸纳米结构的方案。...

基因治疗启发的聚阳离子涂层用于保护DNA折纸纳米结构

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。...

用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

我们描述了一种新型DNA锚定的T7...

DNA锚定的RNA聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

我们介绍一种从两亲性DNA纳米星的组成DNA寡核苷酸出发，制备合成生物分子凝聚体的实验方案。该凝聚体可由单一纳米星组分或两种组分生成，并可进行修饰以维持 体外 从嵌入式DNA模板转录RNA...

两亲性DNA纳米结构构建的合成凝聚体与类细胞结构

本文介绍了一种通过摄食途径在家蚕 Bombyx mori 幼虫中递送壳聚糖/dsRNA...

通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送实现家蚕 Bombyx mori 的幼虫RNA干扰

了解利用丝素蛋白微胶囊固定DNA质粒模板以制备多功能生物传感器的实验方法。该技术可保持DNA传感器功能，用于研究基因激活动力学和体外生物过程监测。

制备负载编码RNA适配体和核糖开关质粒DNA的多功能丝素微胶囊

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