加载编码RNA核酸适体和核糖开关的DNA质粒的多功能丝基微胶囊的制备
2021年10月8日
该协议描述了稳健且生物相容的富含DNA的微胶囊的形成，作为能够跟踪多种配体的多重体 外 生物传感器。
该方案的意义在于，它提供了一种通过将 DNA 质粒模板固定到半透性生物相容性微胶囊中来保持 DNA 编码传感器功能的方法。拟议的 DNA 固定技术用途广泛。它允许制造具有不同体外激活机制的多功能生物传感器。
我们设想这些微胶囊与适当的传感元件相结合，可用于研究不同的生物过程，包括在不同环境（如生物膜和器官）中信号分子的释放。这项技术可以在微观尺度上提供对生物系统的见解，特别是 DNA 的固定化和分子拥挤如何影响基因激活的动力学和机制。首先将聚乙烯亚胺引物层沉积到牺牲二氧化硅或 SiO2 微粒上，方法是将 1 毫升聚乙烯亚胺溶液添加到 2 毫升微量离心管中的 300 微升微粒中。
在环境条件下，在 ThermoMixer 上以每分钟 800 转的速度搅拌混合物。在室温下以 0.2 g 离心 1 分钟收集微粒，然后小心去除上清液。15 分钟后，用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的去离子水在室温下以 0.2 g 离心 1 分钟，洗涤微粒四次，每次离心后弃去上清液。
接下来，用不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水将 DNA 质粒的浓度从 50 ng/μL 调整到 200 ng/μL，并使用 1 mL 制备的溶液将 DNA 沉积在聚乙烯亚胺引发的微粒上。在 ThermoMixer 上以 4 摄氏度和 800 rpm 的速度轻轻搅拌微粒混合物 15 分钟，然后以 0.2 g 离心 1 分钟收集微粒。标记编码茶碱核糖开关的 DNA 质粒的试管，与 GFPa1 偶联为 ThyRS-GFPa1，将编码西兰花适配体的 DNA 质粒标记为 BrocApt。
小心地去除上清液，如前所述，用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤微粒四次，每次离心后丢弃上清液。要沉积丝素蛋白层，将 1 毫升重构的丝素蛋白水溶液添加到 DNA 吸收的微粒中，然后在 ThermoMixer 上以 750 rpm 的速度在 10 摄氏度下轻轻涡旋搅拌混合物 15 分钟。如前所述，通过离心收集微粒，然后用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤一次。
重复离心，弃去上清液。加入 0.5 毫升 DNase 和 RNase 蒸馏水，涡旋混合微粒。然后，在 ThermoMixer 上用 0.5 毫升 100% 甲醇在 10 摄氏度下处理微粒 5 分钟。
通过离心收集微粒后，在 ThermoMixer 上用 100% 甲醇以每分钟 750 转的速度处理颗粒，在 10 摄氏度下持续 10 分钟以形成 β 折叠。如前所述，在 4 摄氏度下以 0.2 g 离心混合物 1 分钟以收集微粒，然后用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤颗粒两次。通过向颗粒核壳微粒中加入 8% 氢氟酸溶液来溶解微粒的 SiO 2 核心。
将溶解的颗粒溶液转移到透析装置中，并在烧杯中用去离子水进行透析。然后，使用 1 毫升移液器将透析装置中的丝微胶囊悬浮液收集到新的 2 毫升微量离心管中。将 100 μL 微胶囊样品转移到一个 8 孔室载玻片的孔中，让胶囊沉淀 20 至 30 分钟，然后使用共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 进行成像。
将 100 微升胶囊悬浮液移液到腔室载玻片的每个孔中。向每个孔中依次加入 300 微升从最低到最高分子量不同的荧光团溶液。通过上下吹打混合混合物，让混合物在室温下孵育 1 小时，直到荧光团溶液的扩散达到平衡。
然后，将载玻片转移到 CLSM，以使用 100 倍油浸物镜在 488 纳米激发波长下对每个孔进行成像。通过调整焦平面来确定感兴趣的区域，并专注于以最大直径的圆圈形式出现的胶囊。通过将无细胞组分依次添加到微胶囊样品中，并将试管在 30 摄氏度下孵育 4 小时，进行体外转录/翻译反应。
使用 488 纳米的激发波长和 GFP/FITC 滤光片在 510 纳米左右的发射波长上检查读板器上的荧光。最后，使用 488 和 561 纳米的激光在 CLSM 系统上对丝微胶囊进行成像。在该研究中，生产了尺寸均匀约为 4.5 微米、壳厚约为 500 纳米的坚固丝素蛋白微胶囊。
采用分子量截留法分析空心丝素蛋白胶囊壳的通透性。聚乙烯亚胺引物层浓度的增加导致具有更多渗透性壳的微胶囊的胶体稳定性增加，而消除引物层会导致具有较低渗透性壳膜的胶囊聚集。ThyRS 激活过程中的 GFPa1 表达动力学显示，与对照非包膜 DNA 相比，加载到丝微胶囊中的 DNA 质粒的 GFPa1 基因激活更高。
在代表性分析中，显示了在体外转录、翻译系统中孵育前后每个胶囊加载 32 个 DNA 拷贝的丝素蛋白胶囊的 CLSM 图像。丝素蛋白胶囊的横截面强度曲线显示 GFPa1 的表达。将每个胶囊载有 30 个 DNA 拷贝的 20 个分层丝微胶囊的转录动力学与对照非包封 DNA 进行了比较。
丝微胶囊的输出信号高于同等浓度的非包封 DNA 样品，证实了蚕丝微胶囊的有效性。按照该协议，几种高分辨率显微镜技术可以应用于对固定状态下的 DNA 纠缠和体外解耦的基因激活过程进行成像。该技术可用于回答最小人工细胞中的分子水平动力学。
具体来说，当与适当的基因元件结合时，微胶囊可用于研究细胞间通讯。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种制备生物兼容的载有DNA的微胶囊协议，这些微胶囊作为多重的体外生物传感器。这些微胶囊不仅保持了DNA传感器的功能，还能够在生物环境中监测各种配体。
关键研究组成部分
研究领域
- 生物兼容材料
- DNA传感器技术
- 体外生物传感
背景
- 固定DNA质粒模板对传感器功能的重要性
- 在研究生物过程中的应用
- 分子拥挤对基因激活动力学的影响
使用的方法
- 丝素纤维素微胶囊的创建
- 使用聚乙烯亚胺进行固定
- 共聚焦激光扫描显微镜用于成像
主要结果
- 开发出大约4.5微米的均匀尺寸的微胶囊
- 与未被包封的对照组相比，被包封的DNA中GFPa1基因的表达增强
- 评估微胶囊的通透性确认了稳定性和功能性
结论
- 该研究有效地展示了丝素纤维素微胶囊在维持DNA传感器功能方面的实用性。
- 研究结果突出了该技术在分子生物学研究中的相关性，特别是在监测基因激活过程中。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables the immobilization of DNA plasmid templates within biocompatible silk microcapsules, preserving sensor functionality for in vitro biosensing applications. By maintaining DNA accessibility and protecting against degradation, the approach supports reliable gene activation readouts in cell-free systems. This capability enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development for nucleic acid-based biosensors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA-encoded sensor function by immobilizing plasmids in a semipermeable membrane.
- Operational Value: Supports functional testing of RNA aptamers and riboswitches under controlled in vitro conditions.
- Predictive Value: Demonstrates enhanced gene activation output from encapsulated DNA versus non-encapsulated controls, improving assay signal-to-noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a tunable permeability platform via layer-by-layer assembly to modulate DNA accessibility and molecular diffusion.
- Operational Value: Allows standardization of DNA loading and capsule size (∼4.5 μm) for reproducible biosensor performance.
- Scalability Value: Facilitates functionalization with AuNPs or antibodies for multiplexed sensing and targeted delivery applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains DNA functionality during long-term storage, enabling delayed use in preclinical workflows.
- Mechanistic De-risking: Permits study of molecular crowding effects on gene activation kinetics in minimal artificial cell models.
- Continuity Value: Connects discovery-stage sensor validation to downstream applications in biofilm and organ-level signaling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of DNA-based sensors before progression to assay optimization and lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests transcriptional and translational activity of DNA plasmids encoding aptamers and riboswitches in cell-free systems.
- Screening: Enables quantitative output measurement via fluorescence (GFP/FITC) and confocal imaging to compare activation kinetics.
- Analytics: Uses molecular weight cutoff analysis to assess shell permeability and its impact on diffusion-controlled gene expression.
- Translational Research: Supports study of signaling molecule release in microscale environments, relevant to intercellular communication models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for immobilizing diverse DNA constructs, adaptable to various sensing elements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Preserves DNA template integrity and accessibility, reducing false-negative results in biosensor assays.
- Operational Value: Yields homogeneous microcapsules with controllable shell thickness and permeability for standardized workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing enhanced signal output from encapsulated DNA sensors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nucleic acid-based diagnostic candidates through improved predictive confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in layer-by-layer assembly, silk fibroin processing, and nucleic acid handling.
- Depends on access to ThermoMixer, centrifuge, dialysis devices, and confocal laser scanning microscopy.
- Necessitates DNase- and RNase-free conditions throughout to preserve DNA functionality.
- Involves optimization of prime layer concentration, DNA concentration, and layer number to tune permeability and loading.
- Limited to in vitro applications based on source material; in vivo use requires further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Perform Layer‐by‐Layer Deposition of a Prime Layer, DNA Plasmids, and Silk Layers
4:44
Dissolution of SiO2Cores and Imaging of Silk Fibroin Microcapsules
5:42
Estimation of the Permeability of Hollow Microcapsules Using Molecular Weight Cut‐Off (MWCO) Method
6:42
In Vitro Activation of Synthetic Theophylline Riboswitch in Silk Microcapsules
7:28
Results: Microscopy Studies, Membrane Permeability, and Gene Expression Kinetics of Silk Fibroin Microcapsules
9:25
Conclusion
