加载编码RNA核酸适体和核糖开关的DNA质粒的多功能丝基微胶囊的制备

该方案的意义在于，它提供了一种通过将 DNA 质粒模板固定到半透性生物相容性微胶囊中来保持 DNA 编码传感器功能的方法。拟议的 DNA 固定技术用途广泛。它允许制造具有不同体外激活机制的多功能生物传感器。

我们设想这些微胶囊与适当的传感元件相结合，可用于研究不同的生物过程，包括在不同环境（如生物膜和器官）中信号分子的释放。这项技术可以在微观尺度上提供对生物系统的见解，特别是 DNA 的固定化和分子拥挤如何影响基因激活的动力学和机制。首先将聚乙烯亚胺引物层沉积到牺牲二氧化硅或 SiO2 微粒上，方法是将 1 毫升聚乙烯亚胺溶液添加到 2 毫升微量离心管中的 300 微升微粒中。

在环境条件下，在 ThermoMixer 上以每分钟 800 转的速度搅拌混合物。在室温下以 0.2 g 离心 1 分钟收集微粒，然后小心去除上清液。15 分钟后，用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的去离子水在室温下以 0.2 g 离心 1 分钟，洗涤微粒四次，每次离心后弃去上清液。

接下来，用不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水将 DNA 质粒的浓度从 50 ng/μL 调整到 200 ng/μL，并使用 1 mL 制备的溶液将 DNA 沉积在聚乙烯亚胺引发的微粒上。在 ThermoMixer 上以 4 摄氏度和 800 rpm 的速度轻轻搅拌微粒混合物 15 分钟，然后以 0.2 g 离心 1 分钟收集微粒。标记编码茶碱核糖开关的 DNA 质粒的试管，与 GFPa1 偶联为 ThyRS-GFPa1，将编码西兰花适配体的 DNA 质粒标记为 BrocApt。

小心地去除上清液，如前所述，用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤微粒四次，每次离心后丢弃上清液。要沉积丝素蛋白层，将 1 毫升重构的丝素蛋白水溶液添加到 DNA 吸收的微粒中，然后在 ThermoMixer 上以 750 rpm 的速度在 10 摄氏度下轻轻涡旋搅拌混合物 15 分钟。如前所述，通过离心收集微粒，然后用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤一次。

重复离心，弃去上清液。加入 0.5 毫升 DNase 和 RNase 蒸馏水，涡旋混合微粒。然后，在 ThermoMixer 上用 0.5 毫升 100% 甲醇在 10 摄氏度下处理微粒 5 分钟。

通过离心收集微粒后，在 ThermoMixer 上用 100% 甲醇以每分钟 750 转的速度处理颗粒，在 10 摄氏度下持续 10 分钟以形成 β 折叠。如前所述，在 4 摄氏度下以 0.2 g 离心混合物 1 分钟以收集微粒，然后用 1 毫升不含 DNase 和 RNase 的蒸馏水洗涤颗粒两次。通过向颗粒核壳微粒中加入 8% 氢氟酸溶液来溶解微粒的 SiO 2 核心。

将溶解的颗粒溶液转移到透析装置中，并在烧杯中用去离子水进行透析。然后，使用 1 毫升移液器将透析装置中的丝微胶囊悬浮液收集到新的 2 毫升微量离心管中。将 100 μL 微胶囊样品转移到一个 8 孔室载玻片的孔中，让胶囊沉淀 20 至 30 分钟，然后使用共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 进行成像。

将 100 微升胶囊悬浮液移液到腔室载玻片的每个孔中。向每个孔中依次加入 300 微升从最低到最高分子量不同的荧光团溶液。通过上下吹打混合混合物，让混合物在室温下孵育 1 小时，直到荧光团溶液的扩散达到平衡。

然后，将载玻片转移到 CLSM，以使用 100 倍油浸物镜在 488 纳米激发波长下对每个孔进行成像。通过调整焦平面来确定感兴趣的区域，并专注于以最大直径的圆圈形式出现的胶囊。通过将无细胞组分依次添加到微胶囊样品中，并将试管在 30 摄氏度下孵育 4 小时，进行体外转录/翻译反应。

使用 488 纳米的激发波长和 GFP/FITC 滤光片在 510 纳米左右的发射波长上检查读板器上的荧光。最后，使用 488 和 561 纳米的激光在 CLSM 系统上对丝微胶囊进行成像。在该研究中，生产了尺寸均匀约为 4.5 微米、壳厚约为 500 纳米的坚固丝素蛋白微胶囊。

采用分子量截留法分析空心丝素蛋白胶囊壳的通透性。聚乙烯亚胺引物层浓度的增加导致具有更多渗透性壳的微胶囊的胶体稳定性增加，而消除引物层会导致具有较低渗透性壳膜的胶囊聚集。ThyRS 激活过程中的 GFPa1 表达动力学显示，与对照非包膜 DNA 相比，加载到丝微胶囊中的 DNA 质粒的 GFPa1 基因激活更高。

在代表性分析中，显示了在体外转录、翻译系统中孵育前后每个胶囊加载 32 个 DNA 拷贝的丝素蛋白胶囊的 CLSM 图像。丝素蛋白胶囊的横截面强度曲线显示 GFPa1 的表达。将每个胶囊载有 30 个 DNA 拷贝的 20 个分层丝微胶囊的转录动力学与对照非包封 DNA 进行了比较。

丝微胶囊的输出信号高于同等浓度的非包封 DNA 样品，证实了蚕丝微胶囊的有效性。按照该协议，几种高分辨率显微镜技术可以应用于对固定状态下的 DNA 纠缠和体外解耦的基因激活过程进行成像。该技术可用于回答最小人工细胞中的分子水平动力学。

具体来说，当与适当的基因元件结合时，微胶囊可用于研究细胞间通讯。