在生物安全三级（BSL-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型

本方案使我们能够了解人类肠道上皮中不同细胞类型对病毒感染的反应。本文介绍了三种独立的人类肠道类器官接种方法，以研究感染途径如何影响细胞的响应。我们重点阐述了在遵守涉及第三类病原体操作的生物安全规定的前提下，如何准备用于单细胞RNA测序的样本。

该方法可轻松适用于其他病原体和类器官培养。最重要的考虑因素是确保所用的类器官模型通过选定的接种方法已完全分化，并能够支持病毒感染。在收获感染的类器官之前，从零下80摄氏度取出单细胞凝胶微珠，并将其升温至室温。

此外，将逆转录试剂、还原剂B和逆转录酶C平衡至室温，并按照制造商说明书重新悬浮模板转换寡核苷酸。接下来，为收集感染了生物安全等级3级病原体的三维类器官，从培养箱中取出细胞培养板，放入细胞培养超净台中。然后使用P1000移液器，从24孔板的每个孔中移除分化培养基，向每孔加入500 µL预冷的PBS，室温孵育3分钟。

接下来，为彻底破坏细胞外基质溶液，上下吹打10次以重悬PBS、细胞外基质和类器官，然后将重悬的类器官转移至15毫升锥形管中，并将管子置于冰上。将每种感染条件分别收集到不同的15毫升锥形管中。更换手套后，清洁管子外表面，并将管子从细胞培养罩中取出。

将样品离心五分钟。将离心管移回细胞培养操作台，吸除PBS，注意避免重新悬浮管底的类器官沉淀。接着，用一毫升消化酶溶液重新悬浮沉淀。

然后更换手套，清洁离心管，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟。孵育期间，每10分钟将离心管移回细胞培养操作台，用移液器吹打上下混悬类器官。为确定类器官是否已解离为单个细胞，使用P10移液器取10 µL类器官悬液加入一次性塑料细胞计数板中，然后用透明胶带封住样品进样口。

更换手套后，清洁细胞计数仪的外表面，并使用明场显微镜确认已形成单细胞悬液。确认形成单细胞悬液后，加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM F12培养基以终止消化反应，轻轻吹打10次。随后更换手套，清洁离心管并离心样品。

离心后，小心移除含有解离酶的培养基，注意不要扰动底部的细胞沉淀。然后将单细胞重悬于含有0.1% BSA的少量PBS中。将细胞悬液通过滤膜过滤后转入FACS管以去除大块团，随后将FACS管置于冰上。

接下来，为了确定每微升中的细胞数量，取10微升细胞悬液加入一次性塑料细胞计数板中。然后在将样本移出细胞培养操作台之前，用透明胶带密封样品加样口。更换手套并清洁细胞计数板，随后使用明场显微镜对细胞数量进行计数。

接下来，在细胞培养超净台内，根据实验中样本的数量，按照试剂盒说明书，在一个1.5毫升离心管中配制包含逆转录试剂、模板转换寡核苷酸、还原剂B和逆转录酶C的预混液。针对每个样本，将33.4微升预混液分装至PCR管中，然后根据目标细胞数量向预混液中加入细胞和水。更换手套后，将单细胞控制器移入细胞培养超净台，并准备芯片。

接下来，将单细胞芯片放入芯片架中，并用50%甘油填充未使用的通道。根据制造商的说明，将主混合液、微珠和分区油加入含有样本的通道中，并用垫圈覆盖芯片。将芯片装入控制器后，启动程序。

程序完成后，取下芯片和垫圈，然后使用多通道移液器将100微升乳液转移至洁净的PCR管中。确保每份乳液呈均匀的白色，表明已形成完全的乳液。更换手套并清洁管子后，将PCR管转移至PCR仪中并启动程序。

PCR反应结束后，大多数包膜病毒将被灭活。此处展示的是类器官传代后第1天、第3天、第5天和第7天的代表性明场图像。通常情况下，当类器官中心变暗时，平均每周传代一次。

通过改变培养基条件，去除 Wnt-3a 并降低 R-spondin 和 noggin 的浓度，可以模拟人类肠道内的细胞复杂性。通常，细胞向潘氏细胞、杯状细胞和肠上皮细胞的分化需要四天的分化培养基诱导。对感染 SARS-CoV-2 的人结肠和回肠类器官的单细胞测序数据分析显示，在感染后 12 和 24 小时，仅有一部分人肠上皮细胞支持 SARS-CoV-2 的感染。

对感染SARS-CoV-2的结肠类器官中先天免疫反应的分析显示，SARS-CoV-2在感染细胞中诱导了促炎性信号级联反应，而未感染的旁观者细胞则表现出由干扰素介导的免疫反应。此外，单细胞RNA测序表明，由于病毒介导的通路阻断，感染细胞无法感知干扰素。类器官必须充分分化且状态健康。

这可以通过在感染前通过qPCR检测细胞分化标志物的水平来控制。如果细胞分化不良，则无法支持病毒感染，导致结果无意义。该技术使我们能够从黏膜的管腔侧和组织侧进行感染。

这一点非常关键，因为它使我们能够揭示黏膜表面在耐受一侧污染环境和另一侧无菌环境过程中所采用的机制。