Name: 在生物安全3级（BSL-3）条件下使胃肠道类器官适应病原体感染和单细胞测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解如何在生物安全3级条件下利用人肠道类器官和单细胞测序技术研究宿主与病原体相互作用。该方法可分析病毒感染后不同细胞类型的免疫反应特征。

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Megan Stanifer 和 Steeve Boulant 获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的研究资助（项目编号：240245660、278001972、415089553 和 272983813 资助 Steeve Boulant，项目编号 416072091 资助 Megan Stanifer），以及巴登-符腾堡州的资助；Megan Stanifer 还获得了联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）项目 01KI20239B 的资助，Steeve Boulant 获得了项目 01KI20198A 以及&#160;（NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021）的资助。示意图使用 BioRender 绘制。

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作者声明不存在竞争性财务利益。

肠道病原体通常通过感染肠上皮细胞的顶膜（面向肠腔的一侧）来启动其生命周期。尽管类器官被公认为是重现肠上皮细胞复杂性和组织结构的良好模型，但其三维闭合结构使得病原体无法接触到顶膜。本方案描述了从顶膜、基底外侧膜或双侧感染肠道类器官的方法，适用于生物安全三级（BLS-3）病原体。通过遵循下文强调的几个关键步骤，这些方案可轻松适用于在生物安全二级（BSL-2）或生物安全三级（BLS-3）条件下研究任何肠道病原体，或应用于其他类器官模型。上述方法适用于根据德国法规进行单细胞液滴的分离与制备。需要声明的是，本方案未涉及在BLS-3条件下操作所需的生物安全处理措施（标准操作程序）。同时必须强调，不同国家的法规可能存在差异，应联系当地主管部门以确保遵守所有本地规定。
将类器官以二维方式接种用于顶膜感染时，一个关键步骤是确保细胞的分化程度与经典三维类器官生长时相似。根据不同的肠道病原体，其嗜性可能仅限于极少数细胞，或需要高度分化的细胞。在此情况下，若使用未充分分化的二维类器官，可能导致错误结论，即该肠道病原体无法感染肠类器官。建议在条件允许时，采用本方案中的三种配置进行感染实验：仅用于顶膜感染的二维类器官（第2节）、裂开的三维类器官用于顶膜和基底外侧膜感染（第3节），以及仅用于基底外侧膜感染的完整三维类器官（第3节）。该策略有助于明确病原体的入侵途径（顶膜 vs. 基底外侧膜），并可对照验证各组类器官达到相似的分化水平。二维顶膜感染的另一种替代方法是显微注射，该方法使用三维类器官，但将病原体直接递送至顶膜侧（详见 Bartfeld 等27 的研究）。此技术需要熟练的操作人员，以确保病原体准确递送且类器官保持完整。显微注射通常在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，可能不适用于生物安全三级（BSL-3）条件。
在二维培养的类器官中进行感染实验时，另一个重要的考虑因素是最终的细胞密度。如步骤2.3所述，将在一个48孔板或一个8孔玻璃底培养板的单孔中接种100-150个类器官。根据类器官细胞系以及操作人员的不同，这些类器官的大小可能存在显著差异，从而导致在48孔板或8孔玻璃底培养板中的细胞密度差异较大。对于不同的肠道病毒，有些病毒更倾向于感染稀疏分布的细胞，而另一些则也能有效感染汇合状态的细胞。目前尚不清楚不同细胞汇合度下病毒易感性差异的分子机制；因此，在开展后续深入表征实验之前，应首先通过预实验确定目标肠道病原体感染的最佳细胞密度。
在进行单细胞液滴乳化之前，通常需要先进行流式细胞分选（FACS）。该步骤常用于区分活细胞与死细胞，以及单细胞与双联体细胞。当处理生物安全等级3级（BSL-3）病原体时，要求实验设施配备相应的FACS分选仪，但这种情况并不常见。此外，类器官中的细胞并非大小均一，因此常常难以区分双联体细胞与体积较大的单个细胞，从而可能导致特定细胞类型被错误地排除。同时，领域内仍在讨论对每个样本分选5,000至10,000个细胞所需的时间是否会导致单个细胞转录谱发生显著改变。尽管已有报道适用于单细胞测序的细胞固定方法（如甲醇和RNAassist），但观察发现这些方法会导致测序质量下降。18最后，有观点认为，使用细胞死亡标志物进行细胞分选也可能导致偏差。鉴于细胞沿隐窝-绒毛轴方向进行增殖与分化，处于最高度分化的细胞将被脱落并释放，位于绒毛顶端。这些细胞通常对多种细胞死亡通路的标志物呈阳性（例如., 细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡）；然而，在观察轮状病毒对小鼠肠道的感染时，绒毛顶端是最易感染的区域28因此，若过滤掉可能呈现死亡标志物阳性的细胞，将导致对可能代表生理感染状态的感染细胞进行负向筛选。目前，在类器官进行单细胞测序之前，尚无理想的分选与固定方案。建议使用未经分选的活细胞，因为仍需进一步研究以寻找合适的替代方案。
单细胞测序技术彻底改变了细胞应答的评估方式。该技术能够在基础状态以及病原体感染条件下，识别出细胞谱系特异性的应答。这一方法为许多以往受限于群体细胞检测结果的研究领域打开了新的大门。尽管该技术功能强大，但仍存在一定的局限性。其中一个关键局限在于测序后续所需的大量生物信息学分析工作，尤其是在分析组织样本和鉴定尚无注释信息的细胞类型时尤为突出。因此，开展所有单细胞研究均需要有经验的生物信息学研究人员提供支持。
本方案描述了如何培养和处理人肠道类器官，用肠道病原体感染它们，并进行单细胞RNA测序（scRNAseq）。由于大多数器官均已建立类器官模型系统，该方法现已可推广至其他器官。肺和肝类器官的结构与肠道类器官相似，因此类似的方法可直接适用于这些类器官。关键的对照在于验证：当这些类器官以二维形式培养或被裂开时，其分化程度是否与其三维类器官对应物相当。定义分化状态的具体特征和基因因每种器官模型而异。其他类器官模型，如肾脏和血管类器官，因其为致密的大体积结构，需要额外的方法将其连续解离为单个细胞。

由于缺乏原代人类细胞模型，对人类肠道病毒的细胞类型特异性趋向性以及细胞类型特异性免疫应答的研究一直面临挑战。随着类器官技术的发展，这一局限性目前已得到部分解决1。在胃肠道领域，已建立了人类及多种其他物种（例如， 小鼠、牛、猫、蝙蝠）的胃和肠类器官模型2,3,4,5,6。肠类器官能够重现人类肠上皮的结构架构，包含隐窝和绒毛样结构，具有功能性肠细胞谱系，甚至已被用于鉴定此前未知的细胞谱系。目前有两种不同的方法可用于培养肠类器官。第一种方法是从组织切除样本或活检标本中分离含有隐窝的肠干细胞，并在特定培养条件下（例如 Wnt3A、R-spondin、Noggin 和 EGF）进行扩增，随后将其分化为大多数肠细胞谱系（例如， 肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞）7。该方法可用于从胃肠道各个节段（例如， 胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠）分离类器官。第二种方法则依赖于人诱导性多能干细胞或胚胎干细胞，通过逐步分化过程生成肠上皮细胞8。这些基于诱导干细胞的类器官通常被认为相较于患者来源的类器官更具胚胎样特性。尽管所有这些类器官模型对于揭示形成肠道所需的发育信号至关重要，但其在感染性疾病研究中的应用仍处于起步阶段。
肠道病毒是一个广义术语，涵盖所有通过胃肠道感染的病毒，例如小RNA病毒（如.，EV-71），呼肠孤病毒（例如，轮状病毒），以及杯状病毒（例如，诺如病毒）9肠道病毒通过摄入被污染的食物和水启动其感染性生命周期，由于发展中国家将未经处理的废弃物排入环境，且感染发生后缺乏医疗护理，使人群面临较高的感染风险。10根据病原体类型的不同，感染可导致胃肠炎、呕吐和/或因肠黏膜渗漏引起的水样腹泻。人诺如病毒是一种高度流行且传染性极强的肠道病原体，全球每年导致超过6亿例感染和1500万例住院。11类器官在诺如病毒研究中发挥了关键作用，因为它们能够支持人类诺如病毒的感染与复制，而该病毒此前无法在标准的细胞培养模型中进行培养。12.
在过去二十年中，冠状病毒已成为重要的人类病原体13。该病毒家族包括高致病性的MERS、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，对这些病毒开展研究时需要严格的生物安全防护措施。有趣的是，尽管这三种病原体主要因其引发的呼吸道症状和呼吸困难而被认识，但现在已明确这些病毒不仅感染呼吸道，还可感染其他器官。除呼吸系统症状外，SARS-CoV-2感染患者中另一个重要的病理表现是出现胃肠道症状14。部分SARS-CoV-2感染者表现出此类症状，临床表现从极轻微到严重腹泻不等。此外，在感染者的粪便及胃肠道组织活检样本中均可检测到SARS-CoV-2基因组15。值得注意的是，胃肠道症状并不仅限于SARS-CoV-2感染，在MERS和SARS-CoV-1感染者中也观察到了类似现象。为了阐明SARS-CoV-2如何引发胃肠道损伤，并精确定义其在胃肠道中的嗜性，人类肠道类器官已成为关键研究工具，目前正被广泛用于解析该病原体对特定细胞类型的感染响应机制16,17。
对细胞群体进行转录谱分析（批量RNA测序）在评估病原体感染 immortalized 细胞系以及类器官时已成为常规做法。尽管这种方法能够帮助我们确定细胞对病原体的整体响应变化（例如细胞因子的上调），但批量RNA测序无法揭示为何群体中某些特定细胞比其他细胞更容易被感染。单细胞RNA测序（scRNAseq）已成为解析细胞谱系特异性转录程序的有力工具，可用于研究这些转录程序如何促进或抑制病毒感染18,19。scRNAseq的首次描述发表于2009年，当时用于分析小鼠卵裂球中不同细胞的转录谱20。目前，该技术已得到扩展，并可通过多种不同平台实现。早期技术采用荧光激活细胞分选仪（FACS）将单个细胞分离用于测序，通常局限于96孔或384孔板，每样本最多可分析约300个单细胞21。如今，单细胞测序平台已取得进展，采用微流控装置将单个细胞与携带条形码的微珠共同包裹进独立的液滴中。该技术可使每个样本条件下捕获多达10,000个细胞。
将类器官技术与单细胞RNA测序（scRNAseq）相结合，使我们能够以细胞类型特异性的方式研究肠道病原体对胃肠道的影响。然而，需要考虑若干技术与生物安全因素。首先，传统的类器官培养方法（即三维（3D）类器官，嵌入于细胞外基质（ECM）中）会使上皮细胞的基底侧暴露于类器官外部。由于肠道病原体通常通过摄入受污染的食物或水而感染，感染通常起始于细胞的顶膜侧，而这一侧在这些3D肠类器官中是无法接触的。因此，必须对类器官进行处理，以使病原体能够接触到细胞的顶膜侧，可通过二维（2D）接种方式直接暴露细胞顶膜侧，或通过显微注射实现22,23。其次，在对感染样本进行scRNAseq分析时，必须考虑其传染性。尽管已有方法可在单细胞分离前通过固定细胞并灭活病原体来降低风险，但这些方法常导致测序质量下降18。以下方案将描述几种针对肠类器官进行肠道病毒感染的方法，考虑感染途径（顶膜侧 vs. 基底侧感染）（图1）。此外，该方案还将包括一个工作流程，用于从高度致病性病毒感染的类器官中解离并分离单细胞，以进行scRNAseq分析。本方案将重点说明在生物安全三级（BSL-3）防护条件下操作时需实施的关键步骤，以避免气溶胶的产生和潜在污染。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;重组小鼠noggin</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-胃泌素I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>24孔非细胞培养处理板</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>8孔玻璃底培养皿</td><td>iBIDI</td><td>Cart#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller &amp; Next GEM Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3&amp;prime; Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>用于单细胞悬液制备及乳滴中凝胶微珠（GEM）的制备</td></tr><tr><td>人胎盘来源胶原蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A 正向引物</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>CYP3A4 反向引物</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 细胞计数板</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Capricorn</td><td>Cat#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>该细胞系用于制备含有Wnt 3A、R-Spondin和Noggin的条件培养基。条件培养基的制备方案可在生产商网站上找到。</td></tr><tr><td>Matrigel GFR，无LDEV</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 正向引物</td><td>Eurofins</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCTCA</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>MUC-2 反向引物</td><td>Eurofins</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 正向引物</td><td>Eurofins</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>OLMF4 反向引物</td><td>Eurofins</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性FGF</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>重组人IGF-1</td><td>BioLegend</td><td>Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI 正向引物</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>SI 反向引物</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>用于检测分化状态的引物</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Caymann Chemicals</td><td>Cat#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

在生物安全三级（bsl-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

人肠道类器官是研究胃肠道病原体感染的最佳细胞模型。这些类器官可来源于胃肠道的所有区段（胃、空肠、十二指肠、回肠、结肠、直肠），并在分化后包含各肠段天然存在的大多数细胞类型。例如，肠道类器官包含营养吸收性肠上皮细胞、分泌型细胞（杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞）、干细胞，以及所有谱系特异性的分化中间阶段细胞（例如&#160;早期或未成熟细胞类型）。利用胃肠道来源的类器官研究感染性疾病的最主要优势在于，能够精确定位何种细胞类型被肠道病原体靶向，并可探究胃肠道不同区段及其特异性细胞类型对病原体攻击的响应是否一致。近年来，胃肠道类器官模型以及其他组织来源的类器官已被广泛用于研究病毒嗜性及致病机制。然而，在使用高致病性病毒时充分运用类器官的各项优势仍面临技术挑战，并需要严格的生物安全考量。此外，由于类器官通常以三维形式培养，细胞的基底侧朝向类器官外部，而其顶端侧则朝向类器官内部（腔内）。这种结构对肠道病原体的研究构成了挑战，因为多数肠道感染在摄入后始于细胞的顶端/腔面侧。本文将提供一套全面的实验方案，用于准备人肠道类器官以进行肠道病原体感染研究，并考虑感染途径（顶端侧 vs. 基底侧），进而开展单细胞RNA测序，以表征细胞类型特异性的宿主-病原体相互作用。该方法详细描述了类器官的制备流程，以及在生物安全三级（BSL-3） containment 条件下开展此类工作所需注意的各项事项。

用于单细胞测序的类器官制备 
单细胞测序的结果高度依赖于高质量的细胞。为确保类器官的质量，应每天对其进行适当的维护和观察，以确定其何时达到需要传代的阶段（图2）。类器官的传代时间因供体而异：某些供体生长较快，需每5天传代一次；而另一些生长较慢，需每10天传代一次。通常情况下，当类器官中心变暗时，平均每周传代一次（图2B）。如果任由类器官过度生长，中心积聚过多死亡细胞，则会导致类器官死亡。
类器官在含有高浓度 Wnt3A 的培养基中维持培养。这有助于维持干细胞微环境，并促进类器官持续生长和增殖。在此类生长条件下，类器官中含有大量干细胞和过渡扩增细胞，而分化细胞群体（如成熟的肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞）的比例较低。然而，为了模拟人类肠道内存在的细胞复杂性，必须促进细胞分化，以产生更多上述分化细胞类型。这可通过改变培养基条件实现，包括去除 Wnt3A，并降低 R-Spondin 和 Noggin 的浓度（表 1）。通常，细胞向肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞的分化需要在分化培养基中培养 4 天（图 3）。获得良好的分化效果至关重要；否则，将难以评估病原体的细胞嗜性及特定细胞类型的反应。
BSL-3 病原体灭活的确认 
必须使用所选病原体确认完全灭活，并验证从 BSL-3 实验室移出 cDNA 的安全性。对于 SARS-CoV-2，通过取 100 μL 的 SARS-CoV-2 在 PCR 仪中于 85 °C 孵育 5 分钟来验证病毒的完全灭活。随后将该处理后的病毒重新加入 naive Vero 细胞中，并在感染后 24 小时、48 小时和 72 小时通过免疫荧光和空斑实验，与未经热处理的病毒进行比较，以确认所有病毒颗粒均不再具有感染性。这些结果提交至当地监管机构，经其批准后，方可开展单细胞实验及 cDNA 处理。
单细胞测序结果 
为了评估 SARS-CoV-2 如何感染人结肠和回肠类器官，进行了单细胞测序。类器官按上述方法制备，并以二维形式进行感染，以允许 SARS-CoV-2 从顶侧感染。在感染后 12 小时和 24 小时收集感染细胞，并按上述方法进行单细胞测序处理。对单细胞测序数据的分析使我们确定，仅有人肠道上皮细胞中的一个亚群（未成熟肠上皮细胞 2）支持 SARS-CoV-2 的感染（图 4）。此外，由于并非群体中的所有细胞都被感染，因此同时分析了被感染细胞和未感染的旁观者细胞（图 5）。这些结果表明，SARS-CoV-2 在被感染细胞中诱导了促炎性信号级联反应，而未感染的旁观者细胞则表现出干扰素介导的免疫反应。此外，单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）显示，由于病毒对信号通路的阻断，被感染细胞无法感知干扰素（图 5）。此类信息无法通过批量 RNA 测序获得。
<img alt="细胞感染示意图；二维/三维方法，顶面/基底面，t-SNE 图谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：示意图展示三种不同的人肠道类器官制备方法，用于肠道病原体感染研究。 通过将肠道类器官以二维形式接种，可实现顶面感染。通过破坏三维类器官结构，可进行顶面与基底面同时感染。最后，通过感染完整的三维肠道类器官，可实现仅限基底面的感染。上述每种方法均可用于制备单细胞测序所需的样本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养示意图及显微镜图像，显示时间线：传代、换液；第1-7天。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：类器官维持示意图及代表性明场图像。 （A）人肠道类器官的维持与传代示意图。（B）传代后第1、3、5和7天的代表性明场图像。至第7天，由于死细胞积聚，类器官变得较大且较暗，可进行传代。比例尺表示25 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达比较；点图；干细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠上皮细胞；相对于HPRT1；分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：人肠道类器官在转换至分化培养基后第4天的代表性qPCR结果。 肠道类器官维持在生长培养基中，或转换至分化培养基中培养4天。收集RNA并进行qPCR检测，分析干细胞标志物（OLFM4）、潘氏细胞标志物（LYZ）、杯状细胞标志物（MUC2）以及肠上皮细胞标志物（SI）的表达。N = 5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SARS-CoV-2在结肠和回肠细胞中表达的UMAP图；细胞感染比例的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：SARS-CoV-2感染的细胞群体鉴定。 人结肠和回肠来源的类器官被SARS-CoV-2感染。感染后12小时和24小时收集细胞，并进行单细胞RNA测序，以确定支持SARS-CoV-2感染的细胞群体。结果显示病毒感染随时间增加，主要感染未成熟肠上皮细胞2型。本图经修改自Triana等19。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="结肠基因表达分析；图表 A-C：log2 倍数变化 vs p 值；D-E：表达点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：固有先天免疫反应的确定。 人结肠来源类器官感染 SARS-CoV-2 后，在感染后 12 小时和 24 小时收集细胞，并进行单细胞 RNA 测序，以分析病毒直接感染细胞及未感染的旁观者细胞中的固有先天免疫反应。SARS-CoV-2 感染的细胞表现出强烈的促炎反应，而未感染的旁观者细胞则表现出干扰素介导的反应。该图经 Triana 等人19 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">生长培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+HEPES</td>
			<td>Pen 10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+P/S</td>
			<td>Strep 10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN</td>
			<td>50% by volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF basic</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">分化培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+HEPES</td>
			<td>Pen 10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+P/S</td>
			<td>Strep 10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>5% by volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：生长与分化培养基的培养基成分。

本方案描述了如何从人肠道类器官的顶侧或基底侧进行感染，以利用单细胞RNA测序（scRNAseq）技术在单细胞水平上表征宿主与病原体之间的相互作用。

在生物安全三级（BSL-3）条件下建立用于病原体感染与单细胞测序的胃肠道类器官模型

人类肠道类器官是研究胃肠道病原体感染的最佳细胞模型。这些类器官可由……衍生而来。

本方案使我们能够了解人类肠道上皮中不同细胞类型对病毒感染的反应。本文介绍了三种独立的人类肠道类器官接种方法，以研究感染途径如何影响细胞的响应。我们重点阐述了在遵守涉及第三类病原体操作的生物安全规定的前提下，如何准备用于单细胞RNA测序的样本。该方法可轻松适用于其他病原体和类器官培养。最重要的考虑因素是确保所用的类器官模型通过选定的接种方法已完全分化，并能够支持病毒感染。在收获感染的类器官之前，从零下80摄氏度取出单细胞凝胶微珠，并将其升温至室温。此外，将逆转录试剂、还原剂B和逆转录酶C平衡至室温，并按照制造商说明书重新悬浮模板转换寡核苷酸。接下来，为收集感染了生物安全等级3级病原体的三维类器官，从培养箱中取出细胞培养板，放入细胞培养超净台中。然后使用P1000移液器，从24孔板的每个孔中移除分化培养基，向每孔加入500 µL预冷的PBS，室温孵育3分钟。接下来，为彻底破坏细胞外基质溶液，上下吹打10次以重悬PBS、细胞外基质和类器官，然后将重悬的类器官转移至15毫升锥形管中，并将管子置于冰上。将每种感染条件分别收集到不同的15毫升锥形管中。更换手套后，清洁管子外表面，并将管子从细胞培养罩中取出。将样品离心五分钟。将离心管移回细胞培养操作台，吸除PBS，注意避免重新悬浮管底的类器官沉淀。接着，用一毫升消化酶溶液重新悬浮沉淀。然后更换手套，清洁离心管，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟。孵育期间，每10分钟将离心管移回细胞培养操作台，用移液器吹打上下混悬类器官。为确定类器官是否已解离为单个细胞，使用P10移液器取10 µL类器官悬液加入一次性塑料细胞计数板中，然后用透明胶带封住样品进样口。更换手套后，清洁细胞计数仪的外表面，并使用明场显微镜确认已形成单细胞悬液。确认形成单细胞悬液后，加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM F12培养基以终止消化反应，轻轻吹打10次。随后更换手套，清洁离心管并离心样品。离心后，小心移除含有解离酶的培养基，注意不要扰动底部的细胞沉淀。然后将单细胞重悬于含有0.1% BSA的少量PBS中。将细胞悬液通过滤膜过滤后转入FACS管以去除大块团，随后将FACS管置于冰上。接下来，为了确定每微升中的细胞数量，取10微升细胞悬液加入一次性塑料细胞计数板中。然后在将样本移出细胞培养操作台之前，用透明胶带密封样品加样口。更换手套并清洁细胞计数板，随后使用明场显微镜对细胞数量进行计数。接下来，在细胞培养超净台内，根据实验中样本的数量，按照试剂盒说明书，在一个1.5毫升离心管中配制包含逆转录试剂、模板转换寡核苷酸、还原剂B和逆转录酶C的预混液。针对每个样本，将33.4微升预混液分装至PCR管中，然后根据目标细胞数量向预混液中加入细胞和水。更换手套后，将单细胞控制器移入细胞培养超净台，并准备芯片。接下来，将单细胞芯片放入芯片架中，并用50%甘油填充未使用的通道。根据制造商的说明，将主混合液、微珠和分区油加入含有样本的通道中，并用垫圈覆盖芯片。将芯片装入控制器后，启动程序。程序完成后，取下芯片和垫圈，然后使用多通道移液器将100微升乳液转移至洁净的PCR管中。确保每份乳液呈均匀的白色，表明已形成完全的乳液。更换手套并清洁管子后，将PCR管转移至PCR仪中并启动程序。PCR反应结束后，大多数包膜病毒将被灭活。此处展示的是类器官传代后第1天、第3天、第5天和第7天的代表性明场图像。通常情况下，当类器官中心变暗时，平均每周传代一次。通过改变培养基条件，去除 Wnt-3a 并降低 R-spondin 和 noggin 的浓度，可以模拟人类肠道内的细胞复杂性。通常，细胞向潘氏细胞、杯状细胞和肠上皮细胞的分化需要四天的分化培养基诱导。对感染 SARS-CoV-2 的人结肠和回肠类器官的单细胞测序数据分析显示，在感染后 12 和 24 小时，仅有一部分人肠上皮细胞支持 SARS-CoV-2 的感染。对感染SARS-CoV-2的结肠类器官中先天免疫反应的分析显示，SARS-CoV-2在感染细胞中诱导了促炎性信号级联反应，而未感染的旁观者细胞则表现出由干扰素介导的免疫反应。此外，单细胞RNA测序表明，由于病毒介导的通路阻断，感染细胞无法感知干扰素。类器官必须充分分化且状态健康。这可以通过在感染前通过qPCR检测细胞分化标志物的水平来控制。如果细胞分化不良，则无法支持病毒感染，导致结果无意义。该技术使我们能够从黏膜的管腔侧和组织侧进行感染。这一点非常关键，因为它使我们能够揭示黏膜表面在耐受一侧污染环境和另一侧无菌环境过程中所采用的机制。

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

科研

JoVE Journal

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该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

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