Name: 使用光学镊子测量禁闭中的亚细胞力学的直接力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习使用光学镊子直接测量斑马鱼胚胎细胞的细胞核力学特性。该方法可在不破坏细胞膜的情况下精确测量亚细胞结构的机械性能，为研究细胞极化、分化和迁移提供可靠手段。

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MK 承认获得西班牙经济与竞争力部通过国家计划（PGC2018-097882-A-I00）、欧洲区域发展基金（FEDER，EQC2018-005048-P）、R&amp;D 卓越中心塞韦罗·奥乔亚计划（CEX2019-000910-S；RYC-2016-21062）、Cellex 私人基金会、Mir-Puig 基金会，以及加泰罗尼亚自治区政府通过 CERCA 和研究计划（2017 SGR 1012）提供的资金支持，此外还获得欧洲研究理事会（ERC，MechanoSystems）和人类前沿科学计划（HFSP，CDA00023/2018）的资助。V.R. 承认获得西班牙科学与创新部对 EMBL 合作关系、塞韦罗·奥乔亚卓越中心的支持，以及西班牙科学与创新部国家计划（BFU2017-86296-P，PID2020-117011GB-I00）和加泰罗尼亚自治区政府（CERCA）的资助。V.V. 承认获得由欧盟“地平线 2020”研究与创新计划资助的 ICFOstepstone 博士项目的支持，该项目受玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议（665884）资助。我们感谢 Arnau Farré 对稿件的审阅；Maria Marsal 在 24 小时受精后胚胎成像与封片方面的帮助；以及 Senda Jiménez-Delgado 在斑马鱼显微注射方面的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了一种在活细胞内检测细胞核力学特性的独特方法。与其他力谱技术不同，非侵入性光镊技术使我们能够将细胞膜和细胞骨架的贡献与细胞核刚性分离开来。重要的是，光学微操作与多模态显微镜兼容，可使研究者同时研究细胞核力学生物学中涉及的多种过程。作为代表性结果，我们采用DNA-Hoechst染色法，在施加数百皮牛顿量级作用力进行压痕操作的同时，测量了细胞核的形变情况。
本方法在本方案所述示例之外的潜在应用 
能够在活细胞内部进行无外部扰动的定量力学信息提取，为大量前所未有的研究机会打开了大门，而这些机会才刚刚开始被探索。因此，本文介绍的光学微操作平台方案可扩展至更为复杂的实验，具有极高的灵活性。声光偏转器（AOD）可生成多个光镊，用于在细胞不同位置同步进行力学测量，也可用于宽频率范围内的主动微流变学研究51,61。如前所述，在压痕过程中产生的力学响应可能超过光镊的最大捕获力，导致微球从光阱中逃逸。在此情况下，可通过AOD配置力反馈系统，以钳制光学力。综上所述，多种微流变学方法，例如本方案中描述的应力松弛，以及主动微流变学或蠕变柔量，均可通过该平台实验获取，并利用新型软件包进行深入分析61,62,63,64,65。此外，施加力的对象不仅限于细胞核，原则上还可用于测量多种细胞内结构，甚至在复杂组织中进行操作，例如在完整血管内捕获流动的红细胞66,67，或捕获并形变叶绿体和线粒体68。光动量校准不依赖于被捕获物体的形状和大小，因此可对任意形状的力探针直接进行力学测量38,39。使用注射微球的方法使我们能够以相对较低的激光功率在细胞核上施加较大力量，相较于直接操控细胞结构更具优势69,70,71。然而，只要折射率差异足够大，则无需外加力探针，细胞内细胞器可被直接操控而无需注射微球（未发表观察结果及参考文献70）。
对本方法进行潜在改进以拓展其应用范围 
可根据实验需求注射不同尺寸的微珠，但必须设置相应的对照。例如，若需研究较晚阶段的细胞，可注射较小的微珠，但这会降低光镊所能施加的最大作用力（如参考文献55所示）。注射较大的微珠可施加更高的力，但其尺寸或注射时的发育阶段可能会影响胚胎的正常发育。在无法使用微珠注射的实验中，仍可通过光操控具有与细胞质不同折射率的多种细胞器，从而产生可通过光动量变化测量的光力42。如上所述，Bambardekar 等人已采用这些方法对果蝇胚胎中的细胞间连接进行形变操作70。同样，细胞核的折射率低于周围介质44，因此可在无微珠条件下实现压痕操作（未发表观察结果及参考文献72），尽管捕获强度较低。因此，细胞核难以被稳定捕获，容易逃逸出光阱。
旋涂法制备PDMS间隔层 通过 一种便捷快速的方法，但对于无法接触微米/纳米加工设备或工程实验室的研究组而言可能难以实现。因此，可使用实验室胶带或帕拉膜（parafilm）轻松组装间隔层（步骤4）。该方案还可通过制造微流控通道进行改进，以实现将单个细胞自动导入预设的测量孔或特定高度的腔室中，从而在同一标本内评估限域效应。然而，此类微流控装置必须设计为适配显微镜物镜与光力传感器收集透镜之间的空间，约为2 mm（见步骤3）。需注意，光力传感器必须置于适当高度，以避免散焦引起的光学像差影响光子动量的测量。
其他修饰可能包括更换生物报告分子。我们发现 Hoechst 荧光在光谱上会渗漏到 GFP 通道中，因此我们更倾向于将其与标记 mCherry 的组蛋白&#160;联用，作为细胞核标记物，以实现两个荧光通道的同步检测。或者，也可使用靶向内层核膜的标记物（如 Lap2b-GFP）轻松追踪细胞核形变（图 2）。
细胞核的压痕形变量约为2-3微米，我们可通过衍射受限的转盘共聚焦显微镜图像分析对此进行精确定量。对于更坚硬的细胞核或更小的作用力，采用该方法所获得的压痕形变将难以准确测量。然而，该&#160;绝对力校准的光镊也可用于对被捕获微珠的位置测量进行校准 原位 使用具有纳米级精度的BFP干涉测量法51通过该方法，电压信号和光学力传感器可通过参数转化为捕获探针的位置&#160;β [nm/V]，而该不变参数&#160;α [pN/V] 通过上述光动量校准产生力的数值41 （详见下文）。
故障排除 
我们发现在实验过程中可能出现以下问题：
未形成稳定的光镊，微球容易逃逸 
显微镜物镜表面的任何污物或校正环未对准均可能导致无法形成稳定光镊。若无法立即解决问题，应测量物镜的点扩散函数。如果目标样本位于光学密度较高的组织内部，激光焦点可能会产生严重的光学像差，从而导致捕获不稳定（该效应在分离的单个细胞中通常可忽略，但在较厚的组织中更为明显）。当细胞核刚度过高时，其恢复力可能超过光镊的逃逸力，导致微球丢失，压痕程序失败。初始阶段，靠近光镊的细胞核膜边缘几乎不发生形变（图S2A）。当此情况发生时，光镊激光不再受到作用力和布朗运动的影响，导致受力降至零，信号噪声减小（图S2B）。若出现此现象，可尝试提高激光功率以增强光镊强度，减小梯形轨迹推动微球进入细胞核的振幅，或将在光镊中微球的初始位置设置得离细胞核更远一些。
细胞在刺激过程中发生移动 
如果细胞贴附不充分，在进行细胞内压痕操作时，光镊梯度力陷阱会带动细胞移动，从而导致所测得的核力学参数及基础力学数据出现人为假象。为防止整个细胞发生位移，我们建议增加表面细胞黏附分子的浓度，例如刀豆球蛋白A（ConA）。
初始动量补偿 
如果光镊平台中没有提供初始动量补偿程序（步骤 6.5），则需要校正一个虚假的、与力无关的基线信号。即使未捕获微珠，该信号也会在力曲线中表现为斜率（图 S1E）。为进行校正，需在无微珠的情况下，在细胞外相同位置重复执行相同的轨迹操作。为此，可通过载物台控制将细胞移离光阱。作为参考，在我们的系统中，200 mW 激光功率下，整个视场范围内力的偏移量变化约为 5 pN；因此，在较短的轨迹中该偏移可忽略不计。或者，也可使用压电扫描载物台移动样品上的细胞，从而保持激光位置不变。
本方案的关键步骤 
微球应于胚胎右侧的1细胞期进行注射，以确保在胚胎中实现最大程度的分布。微珠不应具有荧光性，以免光线泄漏至成像所用的荧光通道。例如，即使普通的红色荧光微珠，由于其亮度较高，在用于Hoechst染色后细胞核成像的蓝色通道（激发波长：405 nm；发射波长：445 nm）中也明显可见。细胞与基底的稳定附着对于防止在压痕程序期间发生侧向位移至关重要。若细胞在程序中移动，则测得的力会被低估。若此类情况频繁发生，应优化附着方案。对于组织培养细胞，其他细胞黏附蛋白（如纤连蛋白、胶原蛋白或聚-L-赖氨酸）也可实现满意的附着效果（未发表观察结果）。在受限过程中，细胞会受到突然且强烈的机械应力。这可能导致细胞损伤，若操作不够谨慎，实验者常会遇到细胞破裂的情况。此外，若受限高度过小，所有细胞均可能出现核膜破裂或不可逆损伤。为减轻此类问题，应更缓慢地下降上层盖玻片和/或增加盖玻片之间的间距。
该技术的局限性及克服建议 
该技术的一个明显局限是激光对组织深层区域的穿透能力，这会导致像差和捕获不稳定。因此，穿透深度的下限取决于样品的透明度、可采用的像差校正方法73以及所使用的激光功率。需要注意的是，较高的激光功率会引起微球附近样品的热激发。然而，我们已尽量减少由1064 nm波长激光光斑引起的样品加热，以避免对生物样品产生可能的热相关应力74。
另一个局限性是可测量的最大力。尽管直接检测光动量能够实现远超光镊线性响应范围的力测量40,41，但所能施加的最大力通常仅为数百皮牛顿量级。这一限制主要源于激光功率以及软性生物材料的损伤阈值，同时折射率差异通常不超过0.1或0.3，也制约了力的提升44。已有多种方法被提出以提高力检测的上限，例如使用结构光75、抗反射涂层微球76、高折射率颗粒77或高掺杂量子点78。
通过BFP干涉测量法，光镊可用于纳米尺度的位置测量，此时小球在光阱中的位置为 Δx =  βSx，其中Sx为传感器的电压信号，&#160;β [µm/V] 可根据不同方案进行实时校准35,54。对于光学力传感器，可以证明电压到力的不变换算系数&#160;α [pN/V] 与&#160;β 及光阱刚度k [pN/µm] 直接相关，关系式为&#160;α = kβ 37。在光学成像无法检测到小球微小位移的实验中，该策略可用于在力测量的同时补充微小位置变化的检测。一个典型应用是将本文介绍的实验流程应用于非常刚硬的细胞核，此时在合理激光功率（200–500 mW）下产生的力不足以引起足够大的压痕形变。在这种情况下，需先将小球与细胞核接触，并在测量前校准光阱刚度（步骤8.6）。细胞核的压痕形变d 随作用力的变化关系可间接确定为：
d = xtrap - F/k
其中 xtrap 为光阱位置。与恒定的光动量因子&#160;α [pN/V] 不同，因子 β [µm/V] 在每次实验前均需校准，因其取决于多种决定捕获动力学的局部变量，例如颗粒尺寸、光阱光斑尺寸以及相对折射率。

组织形态发生是一个复杂的过程，其中生化信号与物理力在时空上协调作用。在发育中的胚胎中，生化信号因子的浓度梯度决定细胞命运的特化，并确保组织模式的正确建立。1,2同时，内在力和外在力在胚胎结构的构建中起着重要作用3,4在此背景下，细胞皮层力学的影响已得到广泛研究5,6形态发生过程中机械与化学过程之间的紧密相互关联，依赖于单个细胞感知其组织微环境中机械力并作出响应的特性。细胞由此解码机械信号 通过 存在对力敏感的亚细胞和分子元件，可将机械信息转导为特异性信号通路，从而调控细胞行为、细胞命运及细胞力学特性。
发育过程的一个显著特征是细胞以群体形式组织，从而构建多细胞结构。因此，单个细胞很少独立地重排和移动，而是紧密地聚集在特定的微环境中，表现出诸如超细胞迁移7、（解）阻塞转变8,9或胚泡压缩10等集体行为。细胞内部及细胞之间产生的机械力作为重要信号，调控着细胞的集体动态行为7,11。即使在细胞单独移动的情况下，例如前体细胞在组织层之间或狭窄的组织生态位中挤过时，它们在穿越三维环境的过程中也会经历强烈的各向异性机械力。这些施加在细胞上的机械应力对细胞行为具有深远影响12,13。已有多种机制被研究，这些机制均指向细胞核作为主要的力传导元件14,15，在致密的三维组织环境中迁移时，细胞核可作为被动或主动的机械组分发挥作用15,16。
我们近期提出了一种机制，该机制使细胞能够利用细胞核作为弹性细胞内力学传感器来测量形态形变12。细胞核是细胞中最大的细胞器，当细胞发生极化、迁移，或在机械拉伸、空间受限或渗透压应激条件下改变其形态时，细胞核会经历显著的形变16,17,18,19。我们发现，核膜的拉伸以及细胞核在细胞内的位置为细胞提供了有关细胞形变程度和类型的信息（例如细胞压缩与细胞肿胀之间的区别）。细胞核的拉伸伴随着内核膜（INM）的展开，从而促进内核膜上钙依赖性cPLA2（胞质磷脂酶A2）的脂酶活性，随后释放花生四烯酸（AA），并快速激活细胞皮层的肌球蛋白II。这导致细胞收缩力增强，并在皮层收缩力超过某一阈值时促进类阿米巴型细胞迁移6。这种对细胞形变的力学敏感反应在不到一分钟内即可发生，并且在解除空间限制后可逆，表明细胞核在机械应力条件下作为细胞本体感知的应变传感器，调控细胞的适应性行为。该力学敏感通路在斑马鱼胚胎来源的前体干细胞中已被证实具有活性，无论是在多能性细胞还是谱系定向细胞中均如此12，且在不同物种和细胞系中具有保守性20。
除了细胞核作为细胞力学感受器的核特性外，核结构和力学特性在发育过程中以及响应细胞命运决定时也受到内在调控21，从而调节细胞的力学敏感性22,23。其结果可能是核顺应性的改变，使得细胞形态发生变化，并实现从非迁移状态向迁移状态的转变，或反之8。
已有多种技术被用于测量细胞核的力学特性，例如原子力显微镜24,25、微吸管抽吸26,27、微流控技术28和微针技术29。然而，其中许多技术具有侵入性，需要对整个细胞进行形变，从而限制了对细胞核自身力学特性和力依赖性响应的测量。为了规避细胞表面及其机械敏感性细胞皮层30同时发生形变的问题，研究人员在不同背景下对分离的细胞核进行了研究31,32。然而，不能排除细胞核分离过程本身可能伴随细胞核力学性质及其调控机制的改变（参考文献24及本研究未发表的观察结果）。
光镊（OTs）是一种多功能技术，已实现了大量细胞力学生物学实验，并在理解分子机器如何将化学&#160;能转化为机械能方面发挥了关键作用33,34。光镊利用高度聚焦的激光束对折射率高于周围介质的介电粒子施加光力33。这种力的大小可达数百皮牛（pico-Newtons），可使粒子在激光捕获焦点区域内被有效束缚，从而实现对被捕获粒子的三维操控。使用光作为工具具有重要优势，即测量可在活细胞内部以非侵入方式完成。光操控的作用范围仅限于激光束的捕获焦点区域，因此可在不刺激周围细胞膜的情况下进行操作，也不会干扰细胞膜处的肌动蛋白皮层或力敏感过程（例如离子通道的力依赖性激活）。
光镊技术的难点在于，使用依赖于能量均分定理或利用已知斯托克斯拖拽力来测量激光功率依赖性逃逸力的传统间接力校准方法，难以精确确定施加在微球上的力35。尽管这些方法在体外（in vitro）实验中易于实施，但通常无法应用于细胞环境。近年来，领域内已引入若干基于动量守恒第一性原理的直接力校准策略36,37。与其他力谱技术不同，该方法通过被捕获粒子（形状任意）与光动量之间的局部交换来推导力的测量值38,39。在我们的实验装置中，由光力引起的光动量变化可被直接测量，无需进行原位（in situ）光阱校准40,41,42,43。因此，该方法可在黏稠环境中（如细胞内部甚至组织内部）实现力的测量，并可轻松将力量化至皮牛（pN）水平。
在本实验方案中，我们描述了一种利用光镊装置对细胞内细胞器或结构进行机械操控，并定量评估其力学特性的检测方法。该装置集成于旋转盘共聚焦荧光显微镜中，可同步成像细胞行为或细胞内动态过程。该检测方法能够在对特定细胞区室（如细胞核）的力学特性进行表征的同时，研究其形变本身可能引发的力学响应及分子信号通路的激活。此外，通过将微珠注入细胞并利用光镊捕获，可显著提高压痕力，这是因为聚苯乙烯微珠的折射率（n = 1.59）远高于细胞核（n ~ 1.35）与细胞质（n ~ 1.38）之间固有的折射率差异44。本研究所提出的方法可轻松拓展应用于其他细胞内结构和细胞器的研究，也可结合主动微流变学、使用多个光镊同时探测相同或不同亚细胞结构，以及针对活体胚胎中细胞力学生物学的测量研究。

<table><tbody><tr><td>#1.5 22 mm 盖玻片</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm 盖玻片</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H 玻璃底培养皿</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10 微米微珠</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>1 毫米玻璃毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1 微米聚苯乙烯微珠</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1 微米红色荧光微珠</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>成像相机 sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>辅助相机（图 3，AUX）</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>双面透明胶带</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Cargille</td><td>型号 B：16484</td><td></td></tr><tr><td>红外防护眼镜</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器（Micro loader pipette）</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微米刻度载玻片</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 分度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>型号 P-97</td><td></td></tr><tr><td>光镊平台</td><td>Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>光镊软件（LightAce）</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 固化剂</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>后期处理软件（Matlab）</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无 RNA 酶水</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>短通二向色镜（图 3，IR-F）</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三角形显微注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>通用烘箱</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>水浸物镜</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

在多细胞生物的发育过程中，一个受精的单细胞通过分裂产生多种具有不同功能的组织。组织形态发生伴随着单个细胞水平上的分子和结构变化，导致亚细胞力学特性的差异。因此，即使在同一细胞内，不同的细胞器和区室对机械应力的抵抗能力也各不相同；而机械转导通路可主动调节这些力学特性。细胞适应组织微环境的能力，部分依赖于其感知和响应机械应力的能力。我们近期提出了一种新的机械感知范式，其中细胞核的形变与定位使细胞能够测量其所处的三维物理环境，并赋予细胞一种本体感受能力，以解码细胞形态的变化。本文中，我们描述了一种在活细胞内测量塑造细胞核的力和材料特性的新方法，并以贴壁细胞和机械受限细胞为例进行了说明。该测量可通过细胞内的光镊无创进行，且通过无需校准的光动量检测可直接获取作用力。这种方法使得细胞核力学特性的测量独立于细胞表面的形变，从而能够区分外部感知（exteroceptive）和内部感知（interoceptive）的机械转导通路。重要的是，光镊实验可与光学显微镜结合，利用细胞骨架、钙离子或细胞核形态的荧光成像，研究细胞响应及亚细胞动态过程。所介绍的方法操作简便，可与商用的力测量系统兼容，并可轻松拓展用于研究其他亚细胞区室（如线粒体、应力纤维和内体）的力学特性。

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。

在多细胞生物体的发育过程中，一个受精的单细胞通过分裂产生多种具有不同功能的组织。组织……

本方案解析了细胞核的独立力学特性，这些特性使细胞核成为细胞极化、分化和迁移的力学传感器。该技术的主要优势在于，无需对外部膜或皮层细胞骨架造成干扰，即可测量亚细胞区域的力学特性并施加作用力。本方案可轻松适用于操作其他生物体细胞内的微珠，从而在不同细胞系或动物模型中研究细胞核力学。直接力传感器的对准对于捕获所有产生并离开光镊的光至关重要，这将确保在细胞的黏弹性介质中准确测量光动量。使用塑料巴斯德移液管将受精后四小时的球形阶段胚胎放入含有 E3 培养基的玻璃培养皿中，开始单细胞制备。然后选择对磁珠呈阳性且在mRNA注射情况下表达荧光蛋白的胚胎。使用镊子手动去除胚胎的外壳，并借助玻璃巴斯德吸管将约10至15个去壳后的胚胎转移至一个1.5毫升的反应容器中。移除试管中的E3培养基，加入500微升预热的不含二氧化碳的组织培养基。轻轻振荡试管，避免产生气泡，并确保试管内容物变得浑浊，表明细胞已解离，肉眼观察无明显团块。随后以200 ×g离心3分钟。离心后，弃去上清液，收集沉淀物以进行后续细胞染色。为了标记细胞核，向离心管中加入500微升新配制的DNA Hoechst染料染色液，重悬细胞。将染色后的细胞在避光条件下孵育7分钟。随后，按照前述方法离心细胞，并将沉淀重悬于DMEM中，悬浮样品加入50微升，受限细胞则加入20微升。为了准备悬浮细胞实验用的光镊或光阱（OT）腔室，裁剪一块双面透明胶带，使其中央具有一个约10毫米×10毫米的方形孔。撕去胶带的一层保护膜，将暴露的粘性面置于1.5号H型玻璃底培养皿的中央。轻轻按压胶带，使胶带整个表面均贴附于玻璃上，同时避免产生气泡，然后撕去胶带剩余的保护层。将100微升浓度为0.5毫克/毫升的刀豆球蛋白A滴加到表面，孵育30分钟。随后吸去刀豆球蛋白A液滴，并用DMEM冲洗表面。将30微升含细胞的溶液滴加到腔面。然后用一块 22 × 22 毫米的盖玻片非常轻柔地封闭样品腔。如有需要，可使用手术刀或镊子。接下来，启动光镊系统：在实验开始前至少 30 分钟，将激光器以较高功率开启，以优化输出功率的稳定性。操作完成后，开启光学生物操作与力测量单元的电子模块。在对准光学力传感器之前，向60X 1.2水浸物镜上滴加一滴水，并将含有细胞的样品腔室放置在载物台上。将焦距对准腔室的下表面，即细胞样品将被放置的位置。在样品盖玻片上滴加一滴浸油后，降低力传感器单元的收集透镜，直至其接触油滴。按照光力传感器对准的标准操作流程，通过辅助相机观察用于定位光镊的样品平面图像，然后降低光力传感器，直至其视场光阑在样品平面上共轭成像。使用伯特兰透镜检查气泡时，需通过辅助相机观察成像光路。若观察到任何灰尘或气泡，请使用无尘镜头纸清洁镜头和样品室，然后按照前述步骤重复操作，并添加更多浸油。利用光学力传感器支架上的侧向螺丝，将视场光阑调整至视野中心。为确保准确性，应将视场光阑几乎完全打开，使其接近辅助相机中可见的整个视野范围。将样品置于显微镜下并校准光力传感器后，若所研究的细胞核或细胞间结构的刚度未知，则使用旋转半波片将初始捕获功率设定为200毫瓦。完成后，通过透射明场显微镜，利用显微镜载物台软件控制器寻找带有1个或2个微珠的细胞。在数据表格中记录每一步后续轨迹的位移和时间。或者，从补充材料中加载表 S1。对于应力/松弛实验，设定要施加的梯形载荷。在 OT 软件中激活光镊。捕获微球时，使用显微镜载物台软件控制器将成像平面设置在微珠略上方。在已校准的辅助相机成像窗口中点击聚苯乙烯微珠。光镊成功束缚微珠后，将显著降低微珠的运动。点击并拖动微珠穿过细胞质，将其放置在距离核膜约两微米的位置。确保设定轨迹，使微珠的压痕垂直于核膜。当设置完成后，进入成像软件并点击采集按钮以开始图像采集。打开实时力读数窗口，点击数据，并在实时力读数窗口中保存。开始捕获位置和力测量数据。通过右键点击小球并选择“开始轨迹”，启动先前加载的轨迹。待轨迹结束后系统稳定，再停止捕获光阱力测量数据的记录。停止图像采集，并在后期处理软件中绘制结果。在代表性分析中，显示了一个孤立的斑马鱼前体干细胞，其附近靠近细胞核处附着一个微球。监测了聚苯乙烯微球在注射后五小时于胚胎内的分布情况。明场和荧光图像显示，微球已分散在胚胎组织中。共聚焦荧光Z轴层扫的最大投影以及同一区域子层扫的最大投影证实，大部分深层细胞中含有一个至两个微球。受精后24小时，珠子分布于胚胎全身。获得了限制性细胞中含一个或两个注射珠子的悬浮细胞的明场显微图像。此外，多种荧光标记有助于研究细胞的不同结构，如核膜、质膜、DNA以及转基因品系。代表性快照显示了在使用光镊微球进行压痕操作前5秒、压痕过程中以及压痕后5秒，经Hoechst标记的细胞核形态。研究了悬浮和受限细胞在压痕实验过程中，沿压痕路径三个不同帧的强度分布，以及细胞核远端和近端边界的运动轨迹。测量了在重复进行细胞核压痕实验时，光镊捕获微球的运动轨迹及其所受的力。悬浮状态及受限条件下的细胞核力学研究表明，受限会导致核投影面积扩大，而核刚度变化不显著。若将微珠注入单细胞期胚胎，则在后续发育阶段中微珠极可能均匀分布。请务必确保微珠被稳定捕获。如果微珠脱离光镊捕获范围，请重新定义轨迹或增加激光功率。这些实验可轻松地在同一细胞内的多个微珠上进行，并可扩展至主动微流变学测量。

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发育生物学

使用光学镊子测量禁闭中的亚细胞力学的直接力

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。...

利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

我们通过在轴突膜上附着的光镊探针同时进行力谱测量，检测了使用激光显微切割仪部分损伤的轴突中的张力释放。该实验方案用于评估轴突与培养基底之间的黏附性。...

利用激光诱导轴突损伤过程中张力释放的测量，在皮牛顿和毫秒分辨率下评估轴突与基底的黏附力

我们介绍了一种将光镊与光片显微镜耦合的装置，及其在无微珠条件下用于探测细胞力学特性的应用 果蝇...

利用无微珠光镊技术探测细胞力学特性 果蝇 胚胎

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。...

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

本方案介绍了一种利用光镊研究RNA-蛋白质相互作用的完整实验流程。文中概述了多种可能的实验装置，包括光镊与共聚焦显微镜联用的设置。...

利用光镊研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本文介绍了一种高速磁镊装置，可在最高达 1.2 kHz 的采样速率下对受力敏感的生物分子进行纳米力学测量。我们以 DNA 发夹结构和 SNARE...

高速磁镊技术用于力敏感元件的纳米力学测量

学习使用光学镊子直接测量斑马鱼胚胎细胞的细胞核力学特性。该方法可在不破坏细胞膜的情况下精确测量亚细胞结构的机械性能，为研究细胞极化、分化和迁移提供可靠手段。

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

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