使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

本方案解析了细胞核的独立力学特性，这些特性使细胞核成为细胞极化、分化和迁移的力学传感器。该技术的主要优势在于，无需对外部膜或皮层细胞骨架造成干扰，即可测量亚细胞区域的力学特性并施加作用力。本方案可轻松适用于操作其他生物体细胞内的微珠，从而在不同细胞系或动物模型中研究细胞核力学。

直接力传感器的对准对于捕获所有产生并离开光镊的光至关重要，这将确保在细胞的黏弹性介质中准确测量光动量。使用塑料巴斯德移液管将受精后四小时的球形阶段胚胎放入含有 E3 培养基的玻璃培养皿中，开始单细胞制备。

然后选择对磁珠呈阳性且在mRNA注射情况下表达荧光蛋白的胚胎。使用镊子手动去除胚胎的外壳，并借助玻璃巴斯德吸管将约10至15个去壳后的胚胎转移至一个1.5毫升的反应容器中。移除试管中的E3培养基，加入500微升预热的不含二氧化碳的组织培养基。

轻轻振荡试管，避免产生气泡，并确保试管内容物变得浑浊，表明细胞已解离，肉眼观察无明显团块。随后以200 ×g离心3分钟。离心后，弃去上清液，收集沉淀物以进行后续细胞染色。

为了标记细胞核，向离心管中加入500微升新配制的DNA Hoechst染料染色液，重悬细胞。将染色后的细胞在避光条件下孵育7分钟。随后，按照前述方法离心细胞，并将沉淀重悬于DMEM中，悬浮样品加入50微升，受限细胞则加入20微升。

为了准备悬浮细胞实验用的光镊或光阱（OT）腔室，裁剪一块双面透明胶带，使其中央具有一个约10毫米×10毫米的方形孔。撕去胶带的一层保护膜，将暴露的粘性面置于1.5号H型玻璃底培养皿的中央。轻轻按压胶带，使胶带整个表面均贴附于玻璃上，同时避免产生气泡，然后撕去胶带剩余的保护层。

将100微升浓度为0.5毫克/毫升的刀豆球蛋白A滴加到表面，孵育30分钟。随后吸去刀豆球蛋白A液滴，并用DMEM冲洗表面。将30微升含细胞的溶液滴加到腔面。

然后用一块 22 × 22 毫米的盖玻片非常轻柔地封闭样品腔。如有需要，可使用手术刀或镊子。接下来，启动光镊系统：在实验开始前至少 30 分钟，将激光器以较高功率开启，以优化输出功率的稳定性。

操作完成后，开启光学生物操作与力测量单元的电子模块。在对准光学力传感器之前，向60X 1.2水浸物镜上滴加一滴水，并将含有细胞的样品腔室放置在载物台上。将焦距对准腔室的下表面，即细胞样品将被放置的位置。

在样品盖玻片上滴加一滴浸油后，降低力传感器单元的收集透镜，直至其接触油滴。按照光力传感器对准的标准操作流程，通过辅助相机观察用于定位光镊的样品平面图像，然后降低光力传感器，直至其视场光阑在样品平面上共轭成像。使用伯特兰透镜检查气泡时，需通过辅助相机观察成像光路。

若观察到任何灰尘或气泡，请使用无尘镜头纸清洁镜头和样品室，然后按照前述步骤重复操作，并添加更多浸油。利用光学力传感器支架上的侧向螺丝，将视场光阑调整至视野中心。为确保准确性，应将视场光阑几乎完全打开，使其接近辅助相机中可见的整个视野范围。

将样品置于显微镜下并校准光力传感器后，若所研究的细胞核或细胞间结构的刚度未知，则使用旋转半波片将初始捕获功率设定为200毫瓦。完成后，通过透射明场显微镜，利用显微镜载物台软件控制器寻找带有1个或2个微珠的细胞。在数据表格中记录每一步后续轨迹的位移和时间。

或者，从补充材料中加载表 S1。对于应力/松弛实验，设定要施加的梯形载荷。在 OT 软件中激活光镊。

捕获微球时，使用显微镜载物台软件控制器将成像平面设置在微珠略上方。在已校准的辅助相机成像窗口中点击聚苯乙烯微珠。光镊成功束缚微珠后，将显著降低微珠的运动。

点击并拖动微珠穿过细胞质，将其放置在距离核膜约两微米的位置。确保设定轨迹，使微珠的压痕垂直于核膜。当设置完成后，进入成像软件并点击采集按钮以开始图像采集。

打开实时力读数窗口，点击数据，并在实时力读数窗口中保存。开始捕获位置和力测量数据。通过右键点击小球并选择“开始轨迹”，启动先前加载的轨迹。

待轨迹结束后系统稳定，再停止捕获光阱力测量数据的记录。停止图像采集，并在后期处理软件中绘制结果。在代表性分析中，显示了一个孤立的斑马鱼前体干细胞，其附近靠近细胞核处附着一个微球。

监测了聚苯乙烯微球在注射后五小时于胚胎内的分布情况。明场和荧光图像显示，微球已分散在胚胎组织中。共聚焦荧光Z轴层扫的最大投影以及同一区域子层扫的最大投影证实，大部分深层细胞中含有一个至两个微球。

受精后24小时，珠子分布于胚胎全身。获得了限制性细胞中含一个或两个注射珠子的悬浮细胞的明场显微图像。此外，多种荧光标记有助于研究细胞的不同结构，如核膜、质膜、DNA以及转基因品系。

代表性快照显示了在使用光镊微球进行压痕操作前5秒、压痕过程中以及压痕后5秒，经Hoechst标记的细胞核形态。研究了悬浮和受限细胞在压痕实验过程中，沿压痕路径三个不同帧的强度分布，以及细胞核远端和近端边界的运动轨迹。测量了在重复进行细胞核压痕实验时，光镊捕获微球的运动轨迹及其所受的力。

悬浮状态及受限条件下的细胞核力学研究表明，受限会导致核投影面积扩大，而核刚度变化不显著。若将微珠注入单细胞期胚胎，则在后续发育阶段中微珠极可能均匀分布。请务必确保微珠被稳定捕获。

如果微珠脱离光镊捕获范围，请重新定义轨迹或增加激光功率。这些实验可轻松地在同一细胞内的多个微珠上进行，并可扩展至主动微流变学测量。