使用光学镊子测量禁闭中的亚细胞力学的直接力
August 31st, 2021
在这里，我们提出了一种方案，用于研究分离的胚胎斑马鱼细胞在三维限制下的细胞内力学性质，并通过光学陷阱进行直接力测量。
该协议剖析了细胞核的各个机械特性，使其成为细胞极化，分化和迁移的机械仪表。该技术的主要优点是它可以测量机械性能并将力施加到亚细胞区室，而不会对膜或皮质细胞骨架进行外部扰动。该协议可以很容易地适应操纵其他生物体的其他细胞内的珠子，以研究不同细胞系或动物模型中的核力学。
直接力传感器的对准对于捕获产生和离开光学陷阱的所有光线至关重要。这将确保在电池的粘弹性介质中进行准确的光动量测量。通过使用塑料巴斯德移液器将受精后四小时的球体阶段胚胎置于含有E3培养基的玻璃皿中，开始单细胞制备。
然后选择对珠子呈阳性的胚胎，并在mRNA注射的情况下表达荧光蛋白。使用镊子手动脱脂胚胎，并在玻璃巴斯德移液器的帮助下将大约10至15个脱尿的胚胎转移到1.5毫升的反应容器中。从管中取出E3培养基，加入500微升预热的二氧化碳非依赖性组织培养基。
轻轻摇晃管子以避免气泡形成，并确保管内的内容物在细胞解离时变得浑浊，眼睛看不到大块。然后将管以200倍G离心三分钟。离心后，除去上清液并收集沉淀以继续进行细胞染色。
为了标记细胞核，通过向管中加入500微升新鲜制备的DNA Hoechst染料染色溶液来重悬细胞。在黑暗中孵育染色的细胞七分钟。接下来，如前所述离心细胞，并将沉淀重悬于50微升DMEM中，用于悬浮样品，或20微升DMEM用于限制细胞。
为了制备光学捕获物或OT室，用于悬浮细胞的实验，在中心切下一块双面透明胶带，中间有一个约10毫米×10毫米的方孔。剥离胶带的其中一个保护层，并将胶带的未覆盖面放在1.5 H玻璃底盘的中心。轻轻按压胶带，使胶带的所有表面粘附在玻璃上，同时避免气泡并剥离胶带的剩余保护层。
用100微升康卡那瓦林A以每毫升0.5毫克孵育表面30分钟。然后取出康卡那瓦林A的滴剂，并用DMEM冲洗表面。将含有细胞的30微升溶液加入到腔表面。
然后用22×22毫米的盖玻片非常轻柔地关闭腔室。如果需要，请使用手术刀或镊子。接下来，在实验前以相当高的功率打开激光器至少30分钟，以优化输出功率稳定性，继续进行光学镊子启动。
完成后，打开光学微操作和力测量单元的电子模块。在对准光学力传感器之前，将一滴水滴放在60X 1.2水浸物镜上，并将包含细胞的腔室放在载物台上。聚焦于将放置细胞样品的腔室的下表面。
在盖玻片顶部添加一滴浸没油后，放下力传感器单元的收集透镜，直到它接触到油滴。按照光学力传感器对准的标准程序，查看辅助相机上用于定位OT的样品平面图像，然后降低光学力传感器，直到其场停止与样品平面共轭。要使用Bertrand镜头检查气泡，请观察通过辅助相机的成像路径。
如果看到任何污垢或气泡，请用无尘镜片组织清洁镜片和腔室，然后重复所述程序，添加更多的浸入油。使用放置在光学力传感器支架上的横向螺钉，将场停止中心置于视野中。为获得精确度，请打开场停止，几乎占据辅助相机上可见的视野。
将样品放入显微镜并对齐光学力传感器后，如果原子核的刚度或所研究的细胞间结构未知，则使用旋转的半波板将初始捕获功率设置为200毫瓦。完成后，使用显微镜载物台软件控制器通过透射明场显微镜寻找具有一个或两个微珠的细胞。在数值表中，写下每个后续轨迹步长的位移和时间。
或者，从辅助材料加载表S1。对于应力/松弛实验，对要施加的梯形载荷进行编程。在OT软件中，激活光学陷阱。
为了捕获微球，使用显微镜载物台软件控制器将图像平面设置在珠子的略上方。单击校准辅助相机成像窗口中的聚苯乙烯微珠。通过光学陷阱成功约束磁珠将大大降低磁珠的运动。
单击并拖动磁珠穿过细胞质，并将其放置在距核包络约两微米的距离处。确保设置轨迹，使磁珠压痕垂直于核膜。设置准备就绪后，转到成像软件，然后单击采集按钮开始图像采集。
打开实时力读数窗口，点击数据，保存在实时力读取窗口中保存。启动陷阱位置和力测量数据。通过右键单击磁珠并选择起始轨迹来启动先前加载的轨迹。
等到轨迹完成并且系统稳定下来，然后才能完成陷阱力测量数据的记录。停止图像采集并在后处理软件中绘制结果。在代表性分析中，显示了一个分离的斑马鱼祖细胞干细胞，其单个微球靠近细胞核。
监测注射后五小时在胚胎内聚苯乙烯微球的分布。明场和荧光图像显示珠子分散在胚胎组织中。共聚焦荧光Z-堆栈的最大投影和同一区域中子堆栈的最大投影证实了大部分深层细胞包含一到两个珠子。
在受精后24小时，珠子分布在胚胎的整个身体中。获得具有一个或两个注射珠子的受限细胞上悬浮细胞的明场显微照片。此外，多个荧光标记有助于研究细胞的不同方面，例如核间膜，质膜，DNA和转基因系。
代表性的快照描述了Hoechst标记的原子核，在用光学捕获的微球压痕前五秒/期间和压痕后五秒。研究了在悬浮和密闭细胞的压痕实验中，沿着三个不同框架的压痕段以及细胞核远端和近端边界的轨迹的强度分布。测量了光学捕获微球在重复核压痕实验中经历的捕获轨迹和力。
悬浮和禁闭细胞中的细胞核力学证实，限制导致投影区域的扩大和核刚度的微小变化。如果将珠子注射到一个细胞阶段的胚胎中，它们很可能在后期均匀分布。请记住，珠子必须稳定地被困住。
如果磁珠逃逸光学陷阱，请重新定义轨迹或增加激光功率。这些实验可以很容易地在一个细胞内的多个微珠上进行，并扩展到主动微流变学测量。
概述
该协议使用光学陷阱研究孤立的胚胎斑马鱼细胞的细胞内机械性质。它允许直接测量力，同时最大程度地减少对细胞膜的外部扰动。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞力学
- 光学陷阱
- 胚胎斑马鱼
背景
- 细胞核是各种细胞过程的机械计量。
- 了解核力学对于研究细胞行为至关重要。
- 该技术提供了不破坏细胞结构的洞察。
- 它可以适用于不同的细胞类型和生物体。
研究目的
- 测量细胞核的机械性质。
- 探索这些性质在细胞极化和迁移中的作用。
- 开发可广泛应用于细胞力学研究的协议。
使用的方法
- 孤立的胚胎斑马鱼细胞的制备。
- 使用光学陷阱直接测量力。
- 用DNA Hoechst染料对细胞进行染色以便于观察。
- 对光学力传感器进行对齐以获得准确的测量。
主要结果
- 成功测量了核的刚度和细胞间结构。
- 展示了操纵亚细胞隔室的能力。
- 提供了研究核力学的可靠方法。
- 能够跟踪珠子相对于核的运动。
结论
- 该协议提供了一种研究细胞力学的新方法。
- 它增强了对各种生物学背景下核性质的理解。
- 未来的应用可能扩展到其他细胞类型和实验设置。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring subcellular mechanics enables de-risking of target validation by linking nuclear mechanics to cell fate decisions such as polarization, differentiation, and migration. This approach provides predictive confidence in early discovery by isolating mechanotransduction pathways without perturbing membrane or cortical cytoskeleton. It supports portfolio triage through quantitative, replication-ready force measurements that inform go/no-go decisions in mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by measuring nuclear mechanical properties as a gauge for cell polarization and migration.
- Operational Value: Enable biological de-risking through force measurements that clarify mechanotransduction pathway contributions.
- Predictive Value: Support target confidence by decoupling nuclear mechanics from surface deformations to assess interoceptive signaling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated subcellular systems for downstream workflows by isolating nuclear mechanics from cellular confounders.
- Operational Value: Address assay standardization and reproducibility via calibration-free light momentum detection in viscoelastic media.
- Scalability: Highlight platform reuse across cell lines and organisms through adaptable optical trapping protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discuss disease relevance by connecting nuclear mechanics to tissue morphogenesis and mechanosensation paradigms.
- Preclinical Model Alignment: Describe continuity from discovery through preclinical validation using zebrafish embryos as a disease-relevant system.
- Risk-Adjusted Advancement: Address mechanistic de-risking by enabling dissection of exteroceptive and interoceptive pathways in confined microenvironments.
Pipeline & Workflow Integration
Position the method within early discovery to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in subcellular mechanics.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by measuring nuclear stiffness and intercellular structure without external perturbation.
- Screening: Describe assay readiness through quantitative force measurements that enable comparison of subcellular responses under confinement.
- Analytics: Highlight measurements such as trap force and displacement trajectories that help teams compare conditions across cell states.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity via fluorescence imaging of cytoskeleton, calcium, or nuclear morphology to assess cellular response.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability for investigating other subcellular compartments like mitochondria or stress-fibers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mechanotransduction.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of force measurements in living cells.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on nuclear mechanics as a phenotypic readout.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in optical tweezers, force sensor alignment, and fluorescence microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including laser stability, auxiliary camera, and post-processing software.
- Cross-team standardization requirements for trajectory programming, trap power calibration, and data acquisition protocols.
- Adaptation considerations across model systems such as varying cell lines, organism types, and subcellular targets.
- Practical limitations including bead trapping stability, avoidance of air bubbles in oil immersion, and need for dark incubation during staining.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:58
Single-cell Preparation and Staining
2:32
Optical Trapping (OT) Chamber Spacing and Optical Tweezers Start-up
3:58
Alignment of the Optical Force Sensor
5:17
Performing the Nucleus Indentation Experiments
7:22
Results: Measurement of the Forcesand Material Properties of the Cell Nucleus Inside Zebrafish Embryo
9:17
Conclusion
