Name: 使用无细胞自动诱导工作流程在24小时内从细胞到无细胞蛋白质合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学习无细胞自动诱导方法，在24小时内从大肠杆菌制备高产功能性细胞提取物。该技术简化蛋白质合成流程，降低操作复杂度，使更多研究人员能够应用无细胞表达技术进行生物研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 Jennifer VanderKelen 博士和 Andrea Laubscher 提供的技术支持。作者还感谢 Nicole Gregorio、Max Levine、Alissa Mullin、Byungcheol So、August Brookwell、Elizabeth (Lizzy) Vojvoda、Logan Burrington 和 Jillian Kasman 提出的有益讨论。作者同时感谢比尔和琳达·弗罗斯特基金、加州理工学院应用生物技术中心雪佛龙生物技术应用研究捐赠基金、加州理工学院研究与学术基金以及美国国家科学基金会（NSF-1708919）提供的经费支持。

1. 培养基培养
<ol>
	<li>按照表1所述配制960 mL CFAI培养基，并用KOH调节pH至7.2。</li>
	<li>将培养基转移至2.5 L带挡板的锥形瓶中，在121 °C下高压灭菌30分钟。</li>
	<li>按照表1所述配制40 mL糖溶液。通过过滤除菌将溶液转入另一个已灭菌的玻璃容器中。 
	注意：糖溶液可存放于30 °C培养箱中，待后续使用。</li>
	<li>高压灭菌后，让培养基完全冷却至40 °C以下。</li>
	<li>在接种CFAI培养基前，将糖溶液直接加入CFAI培养基中。</li>
	<li>接种时，用接种环蘸取先前划线的E. coli BL21 Star (DE3) 平板上的单菌落，直接接入培养基中。轻轻旋转接种环使菌体混入培养基，避免接触容器壁。确保划线平板新鲜，菌体具有活性。</li>
	<li>将接种后的培养基置于30 °C培养箱中，以200 rpm振荡培养过夜。若在晚间接种，次日早晨菌液在600 nm处测得的光密度（OD600）约为10。可根据需要调整接种和收获时间。</li>
</ol>
2. 细胞收获
<ol>
	<li>提前配制 S30 缓冲液并保持低温。按照以下配方配制 S30 缓冲液： 表2，调至终pH为8.2。 
	注意：S30 缓冲液可在细胞收获前数天配制。若提前配制，请勿加入二硫苏糖醇，于 4 °C 保存。使用前再加入二硫苏糖醇。</li>
	<li>从此时起，将所有溶液和材料置于冰上。取1 L培养基转移至1 L离心瓶中，在5,000 ×g下离心 x g 4–10 °C 下离心 10 分钟。倾去并弃除上清液。使用无菌刮勺将沉淀转移至预冷并预先称重的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用30–40 mL冷的S30缓冲液重悬沉淀，洗涤一次 通过 以30秒为一轮涡旋振荡，期间在冰上休息。 
	注意：由于沉淀体积较大，将细胞沉淀分装至两个50 mL锥形管中，有助于洗涤步骤的操作。将细胞以较小体积分装保存也可为后续处理提供便利。</li>
	<li>将细胞重悬液在5000离心 x g 4-10 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用干净的纸巾擦拭50 mL离心管内壁的残留液体，注意避免触碰沉淀。称重后将沉淀在液氮中速冻，于-80 °C保存备用。 
	&#8203;注意：如果用户计划继续进行提取制备实验方案，则沉淀物可能无需进行速冻。</li>
</ol>
3. 提取物制备
<ol>
	<li>将每1 g细胞沉淀与1 mL S30缓冲液混合，置于冰上解冻约30–60分钟。通过涡旋振荡（每次30秒，间隔冰上静置）重悬解冻后的沉淀，直至无可见细胞团块残留。 
	注意：较小的团块可通过移液混合进行重悬。</li>
	<li>将1.4 mL细胞重悬液分装至1.5 mL微量离心管中用于细胞裂解。将各管置于冰浴中，使用20 kHz频率、50%振幅超声处理，每次超声45秒，每轮间隔59秒休息，共进行三轮。每轮之间颠倒混匀管内液体，并在最后一次超声后立即加入4.5 µL的1 M二硫苏糖醇（dithiothreitol）。 
	注意：由于超声过程中会产生热量，因此在未进行超声时必须确保所有样品始终置于冰上。冰浴应持续补充或足够大，以在整个超声过程中保持低温。</li>
	<li>将各管在18,000 x g、4 °C条件下离心10分钟。收集上清液，并以每管600 µL分装至1.5 mL微量离心管中。迅速冷冻分装样品并储存在-80 °C，直至后续使用。吸取时应注意仅取上清液部分。</li>
</ol>
4. 无细胞蛋白质合成
<ol>
	<li>从上一步骤中取出一份提取物，在1.5 mL离心管中进行四次重复的15 µL无细胞蛋白合成反应，将其解冻。</li>
	<li>每个反应体系包含240 ng DNA（终浓度为16 µg/mL）、2.20 µL溶液A、2.10 µL溶液B、5.0 µL提取物，以及适量的分子生物学级水补足至15 µL。该反应体系可按比例放大。比例详见表3。
	<ol>
		<li>根据表4配制溶液A和溶液B。每种溶液可按100 µL至1 mL的批量配制，分装后于-80 °C保存，以备后续使用。 
		注意：DNA用量可根据目标蛋白的不同而调整。本实验所用质粒pJL1-sfGFP已优化至在16 µg/mL（即597 µM）浓度下表现最佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将反应体系在37 °C下孵育至少4小时。</li>
</ol>
5. 报告蛋白（超折叠绿色荧光蛋白，sfGFP）的定量分析
<ol>
	<li>使用半面积96孔黑色聚苯乙烯板，将每种无细胞蛋白合成反应产物各2 µL与48 µL pH 7.2的0.05 M HEPES缓冲液混合。建议每种反应管设置三到四个重复。</li>
	<li>采用485 nm激发波长和528 nm发射波长测定sfGFP的荧光强度。</li>
	<li>为将相对荧光单位转换为sfGFP的体积产率（µg/mL），需使用纯化的pJL1-sfGFP建立标准曲线。</li>
</ol>

<ol><li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
<li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+supplement+mixtures%3A+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li>
<li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li>
<li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22System+for+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li>
<li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li>
<li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li>
<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li>
<li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+the+preparation+of+%22endotoxin-free%22+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li>
<li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li>
<li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li>
<li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system%3A+Practical+laboratory+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li>
<li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li>
<li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+A+highly+productive%2C+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li>
<li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li>
<li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益冲突。

在细胞培养过程中，传统上需要研究人员进行两项关键操作：T7 RNA聚合酶的诱导以及在特定OD600值时收获细胞。CFAI技术消除了这两项要求，从而减少了制备高质量细胞提取物所需的研究人员时间和技术培训。通过在培养基中用乳糖替代葡萄糖作为主要碳源，可实现T7 RNA聚合酶的自动诱导，不再需要人工监测细胞生长并在特定时间点加入IPTG&#160;进行诱导。同时，也无需再持续监测细胞培养物以在特定OD600&#160;值时收获细胞，使研究人员摆脱了对细胞培养过程的实时依赖。这一点进一步支持了近期已有研究证明的、在非传统时间收获仍可获得高质量提取物的可行性13,25,26。新型培养基配方优化了缓冲能力和碳源组成，即使在细胞培养接近稳定期时，仍可维持活跃的能量代谢。从高OD600培养物中获得高活性细胞提取物的能力，使研究人员可根据自身安排灵活选择收获时间27</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

近年来，无细胞蛋白合成（CFPS）在生物技术应用中的使用已显著增长1,2,3。这一发展部分归因于人们对CFPS中发生的各种过程及其各组分作用的理解不断深入4,5。此外，由于系统优化和替代能源的使用降低了成本，使得新用户更容易实施无细胞技术6,7,8,9&#160;。为了实现蛋白合成所需的转录和翻译因子，通常使用细胞提取物来驱动无细胞反应10。最近发布的用户指南提供了制备功能性提取物的简单方案，使新用户和有经验的用户都能更方便地实施该技术1,11,12,13,14。细胞提取物通常通过裂解细胞培养物获得，而细胞培养物可根据具体应用需求选用不同生物体进行培养1,15,16。
Escherichia coli（E. coli）已迅速成为用于制备功能性提取物的最常用宿主生物之一17。BL21 Star (DE3) 菌株是首选，因为它缺失了外膜中的蛋白酶（OmpT 蛋白酶）和细胞质中的蛋白酶（Lon 蛋白酶），为重组蛋白表达提供了最佳环境。此外，DE3 含有 λDE3 噬菌体，其携带在 lacUV5 启动子控制下的 T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）基因；Star 组分包含一个突变的 RNaseE 基因，可防止 mRNA 的降解4,14,18,19。在 lacUV5 启动子调控下，异丙基-硫代半乳糖吡喃苷（IPTG）诱导可实现 T7 RNAP 的表达20,21。这些菌株用于培养和收获细胞，以获得提取物制备所需的原始材料。细胞裂解可通过多种方法进行，包括珠磨法、French 压力法、均质化、超声处理以及氮气空化法1,11,12,22。
细菌培养与收获的过程在使用大多数平台时具有一致性 大肠杆菌， 但需要多天时间并要求研究人员进行严密监督1,11,13该过程通常从LB肉汤中的过夜种子培养开始，经过过夜培养后，于次日接种至较大体积的2xYTPG（酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸盐缓冲液、葡萄糖）培养基中。持续监测该大体积培养物的生长情况，直至其达到对数生长早期至中期，光密度（OD）为2.5。14,20需要持续进行测量，因为已有研究证实，转录和翻译相关组分在对数生长早期至中期具有很高的活性。23,24尽管该过程能够制备出可重复的提取物，但本实验室近期开发了一种新方法，即使用无细胞自动诱导（CFAI）培养基，该方法可减少研究人员的干预，提高每升细胞培养物的总体提取物产量，并改善获取效率 E. coli基于提取物制备的方法，适用于有经验及新用户（图1）本文提供了实施CFAI工作流程的逐步指南，可在24小时内从细胞划线平板完成至CFPS反应。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Phenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td></tr><tr><td>1L 离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>辅酶 A（CoA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 细胞成像多功能读板仪</td><td>Biotek</td><td>BTCYT5F</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>D-乳糖</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria Broth）</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 微型离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42/42R 恒温摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH₄(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>草酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Acros, Organics</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Acros, Organics</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 质粒提取试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L 带挡板摇瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>超声波处理器</td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

24 小时内利用无细胞自动诱导工作流程从细胞到无细胞蛋白质合成

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一种生物技术平台，已能够体外捕获转录和翻译机制。in vitro。近年来的诸多进展使CFPS平台对新用户更加友好，并拓展了其应用范围。对于基于裂解液的CFPS系统，细胞提取物可来源于多种生物体，利用宿主特有的生物化学特性来增强蛋白质合成。在过去20年中，Escherichia coli（E. coli）因其成本低廉且用途广泛，已成为支持CFPS最常用的生物体之一。尽管已有诸多关键进展，E. coli细胞提取物制备的工作流程仍是新用户应用CFPS的主要瓶颈。提取物制备过程耗时较长，且需要专业技术才能获得可重复的结果。为克服这些障碍，我们此前报道了一种24小时无细胞自诱导（CFAI）工作流程，可减少用户操作和所需的技术经验。CFAI工作流程在降低制备细胞提取物所需人力和技术要求的同时，也提高了所获得细胞提取物的总量。本文将逐步描述该工作流程，以促进更广泛地获取并推动基于E. coli的CFPS的广泛应用。

在配制CFAI培养基时，将葡萄糖替换为增加的乳糖和甘油作为培养基中的主要能量来源。此外，CFAI培养基的缓冲能力也得到了增强。这些特定成分见表1。
细胞随后培养至OD600 为10和CFAI培养基中的标准2.5，以证明尽管提取物用量不同，但提取质量具有一致性。2.5 OD600 CFAI 培养基在接种 LB 肉汤中的种子培养物后进行培养 37 °C，200 rpm，同时测量OD600 从平板直接接种10代培养物. 每批CFAI培养基均在各自的OD下进行监测并收获600生长至 OD600 10 的培养导致细胞沉淀量和总提取物量增加，获得的提取物体积为 9.60 mL，而 OD 值培养至 2.5 时仅获得 2.10 mL 提取物600 (图2）。总蛋白浓度的进一步分析表明，各提取物中的总蛋白含量无显著差异（表5</...

本研究描述了在24小时内完成大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）细胞提取物的制备及无细胞蛋白合成（CFPS）反应的过程。文中详细阐述了无细胞自动诱导（CFAI）方案的改进之处，旨在减少研究人员的干预，并提高所获得细胞提取物的产量。

无细胞蛋白合成（cell-free protein synthesis, CFPS）作为一种生物技术平台，近年来不断发展，可在体外模拟转录和翻译机制。多种……

无细胞自动诱导法减少了研究人员的监督工作和制备功能性细胞提取物所需的时间。该方法简化了以往耗时较长且操作繁琐的体外蛋白质合成流程。此技术操作更简便，同时产率较高，将使更广泛的用户能够开展无细胞表达实验。该方法强调了细胞生长及无细胞反应过程中能量代谢的重要性。首先准备960毫升无细胞自诱导培养基，然后将培养基置于2.5升带挡板的锥形瓶中，在121摄氏度下高压灭菌30分钟以实现灭菌。接下来，在配制40毫升糖溶液后，将其通过滤膜除菌并转入另一个已灭菌的玻璃容器中。待培养基经高压灭菌并冷却至40摄氏度以下后，直接将滤膜除菌的糖溶液加入培养基中。随后，用接种环从先前划线分离的新鲜大肠杆菌BL21 star平板上挑取大量菌落，并将接种环直接插入培养基中进行接种。将接种环轻轻旋转进入培养基中，注意不要触碰容器壁。然后，将接种后的培养基置于30°C摇床中过夜培养，摇床转速为200 RPM。次日，取一升培养液转移至1升的离心管中，在4至10°C条件下以5,000 × g离心10分钟，收集细胞。弃去上清液后，使用无菌刮勺将沉淀转移至预冷且预先称重的50毫升锥形管中。接着，用30至40毫升冷的S30缓冲液洗涤沉淀一次，通过涡旋振荡（每次30秒，间歇置于冰上）将沉淀重新悬浮。待沉淀完全重悬后，离心细胞悬液，弃去上清液，并用干净的纸巾擦拭50毫升管内壁上残留的多余上清液，注意不要触碰沉淀。随后，在液氮中快速冷冻沉淀物之前称重，并在 -80 摄氏度下保存，直至后续使用。为制备细胞提取物，每克冷冻细胞沉淀物中加入 1 毫升 S30 缓冲液，将沉淀物置于冰上解冻 30 至 60 分钟。然后，通过涡旋振荡重悬解冻后的沉淀物，每次振荡 30 秒，期间在冰上静置休息，直至无可见的细胞团块残留。进行细胞裂解时，将1.4毫升细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中。然后，在冰浴中使用20千赫兹频率、50%振幅对每根管中的细胞悬液进行超声处理，每次超声45秒，每轮循环间间隔59秒，共进行三轮。每轮循环之间颠倒混匀管内液体。最后一次超声处理后，立即向管中加入4.5微升1摩尔的二硫苏糖醇。完成所有管中细胞悬液的超声处理后，离心各管，并将上清液以600微升为一份收集至新的1.5毫升微量离心管中。将分装样品快速冷冻，并在负80摄氏度下保存，直至后续使用。为在1.5毫升微量离心管中进行四次重复的15微升无细胞蛋白合成反应，需解冻一份细胞提取物。每配制好一个15微升的反应体系后，在37摄氏度条件下孵育至少4小时以进行反应。为了定量报告蛋白，将48微升pH 7.2的50毫摩尔HEPES缓冲液与每种无细胞蛋白合成反应产物各2微升加入到黑色聚苯乙烯96孔板中。使用激发波长485纳米和发射波长528纳米测定超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的荧光强度。然后，通过使用纯化的pJL1 sfGFP质粒建立标准曲线，将相对荧光单位转换为sfGFP的体积产量。图中显示的是在不同600纳米光密度下收获细胞后得到的无细胞自动诱导培养基沉淀物。光密度达到10的培养基所产生的细胞沉淀物总量高于光密度为2.5的培养基。对总蛋白浓度的进一步分析表明，两种提取物之间的总蛋白含量无显著差异。尽管培养基的光密度值不同，但两种提取物在无细胞反应中表达sfGFP时表现出相似的结果。在配制培养基和糖溶液时，保持无菌条件非常重要。这种CFAI无细胞提取物方法可用于大多数无细胞表达应用。这些应用涵盖生物技术教育、蛋白质工程以及即时检测诊断。该方法减少了所需的时间和技术操作难度，提高了实验的可重复性，并能获得更高产量的提取物。

from-cells-to-cell-free-protein-synthesis-within-24-hours-using-cell

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用无细胞自动诱导工作流程在24小时内从细胞到无细胞蛋白质合成

本五日方案详细说明了从头开始创建和运行一种高效的内源性大肠杆菌（Escherichia...

用于合成生物学的基于 Escherichia coli 的 TX-TL 无细胞表达系统的实施方案

在本视频文章中，我们描述了 体外...

体外合成修饰mRNA以诱导人细胞中蛋白质表达

介绍了一种带有可密封飞升级反应腔室的微加工装置。本报告包含一项实验方案，用于在这些腔室内密封无细胞蛋白合成反应物，以研究拥挤效应和空间限域对基因表达作用。...

可密封飞升级微腔阵列用于无细胞生物学

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。...

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

本方案详细说明了在4天或更短时间内制备基于大肠杆菌（E. coli）的细胞提取物并实施体外（in...

大肠杆菌基于细胞的无细胞蛋白质合成：一种稳健、灵活且易于获取的平台技术的操作方案

本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。...

利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞

本研究描述了一种无需克隆或使用活细胞，即可从合成基因片段制备大量（µg至mg级）DNA用于蛋白质筛选实验的方案。该方法首先对最小模板进行酶切消化并环化，随后通过等温滚环扩增进行扩增。扩增产物无需纯化即可直接用于无细胞表达反应。...

快速、基于酶促反应的方法：利用无细胞系统对微量线性模板进行扩增以实现蛋白质原型构建

设计新型基因回路需要经过充分表征的基因元件。本文介绍一种经济高效、高通量的方法，可用于快速表征基因元件。该方法通过结合无细胞裂解物、线性DNA（避免克隆步骤）以及声波液体处理技术，显著降低了成本和时间，同时提高了通量并减少了反应体积。...

利用无细胞系统快速表征遗传元件

本文介绍了一种用于制备外切酶V基因敲除菌株细胞提取物及其缓冲液校准的实验方案 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 和...

利用线性DNA模板和核酸外切酶缺陷型细胞提取物进行无细胞蛋白质合成

本方案描述了用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统。该方案概述了在不同微区室中的关键步骤及代表性结果，旨在为合成细胞研究领域的各类实验室建立最佳实践，推动合成细胞研发的进展。...

无细胞蛋白质合成系统用于构建合成细胞

学习无细胞自动诱导方法，在24小时内从大肠杆菌制备高产功能性细胞提取物。该技术简化蛋白质合成流程，降低操作复杂度，使更多研究人员能够应用无细胞表达技术进行生物研究。

24 小时内利用无细胞自动诱导工作流程从细胞到无细胞蛋白质合成

探索更多视频