Name: 使用短读和长读测序技术生成尿细菌完整基因组的杂交从 头 基因组组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 了解如何使用短读和长读测序技术对尿路细菌进行杂交从头基因组组装。该方法利用Unicycler生成完整的环状基因组，无需编程经验即可研究细菌定植和耐药性的遗传机制。

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感谢Moutusee Jubaida Islam博士和Luke Joyce博士对本实验方案的贡献。我们还要感谢德克萨斯大学达拉斯分校基因组中心提供的反馈与支持。本研究由Welch基金会资助（授予N.J.D.的奖项编号为AT-2030-20200401），美国国立卫生研究院资助（授予K.P.的奖项编号为R01AI116610），以及由P.E.Z.担任的Felecia and John Cain女性健康讲席基金资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的综合性杂合基因组组装方案提供了一种简化的流程，可用于成功培养多种尿液微生物群和尿路致病菌，并完成其基因组的完整组装。细菌基因组的全基因组测序（WGS）始于多样且有时难以培养的微生物的分离，以提取其基因组DNA。迄今为止，现有的尿液培养方案要么缺乏检测多种尿液菌种所需的灵敏度，要么涉及耗时较长且复杂的操作，需要大量时间和资源11。本文描述的改良增强型尿液培养方法提供了一种简化而全面的方案，可成功分离属于17种常见尿液细菌属的细菌，包括潜在致病菌或有益的共生菌，以及兼性或专性需氧菌和厌氧菌。这为细菌基因组的精确测序与组装，以及关键的表型实验提供了必要的起始材料，有助于深入理解泌尿系统健康与疾病。此外，这种改良的培养方法可更明确地实现对尿液样本中可存活微生物的临床诊断，并支持其生物样本保藏，以用于未来的基因组学研究。然而，该方案也存在一定的局限性。根据具体微生物的不同，可能需要较长的孵育时间，并依赖缺氧培养箱或可控温培养箱等未必普遍可用的资源。使用厌氧GasPak可作为替代方案，但成本较高，且无法始终维持稳定可控的环境。最后，由于培养过程中的选择性偏倚以及样本多样性差异，某些特定微生物或尿路致病菌可能在培养中占据优势，从而抑制难养菌的生长。尽管存在这些局限性，该方法仍使得多种尿液细菌的培养成为可能。
随着新一代测序技术的发展，基因组测序日益普及，这些技术极大地提高了测序数据的产量和准确性14,15。结合数据处理和从头组装（de novo assembly）算法的进步，完整的基因组序列已触手可及，无论是新手还是经验丰富的科研人员均可获得15,45。完整基因组所提供的整体基因组结构信息能够带来重要的进化和生物学见解，包括基因重复、基因丢失以及水平基因转移14。此外，与抗菌耐药性和毒力相关的重要基因通常位于可移动遗传元件上，而这些元件在草图基因组组装中通常无法被准确解析15,16。
本方案采用一种混合策略，结合短读长和长读长测序平台的测序数据，以生成完整的基因组组装结果。尽管本方案主要针对尿液来源的细菌基因组，但也可根据需要调整用于来自不同分离来源的多种细菌。该方法中的关键步骤包括严格遵循无菌操作技术，并使用适当的培养基和培养条件以分离纯化的尿液细菌。此外，提取完整且高产量的基因组DNA（gDNA）对于获得无污染序列读段的测序数据至关重要，可避免因污染读段干扰而导致组装失败。后续的文库制备流程对于生成足够长度和测序深度的高质量读段同样至关重要。因此，在文库构建过程中尤其需要小心处理gDNA，特别是用于长读长测序时，因为该技术的最大优势在于能够产生无理论长度上限的长读段。本文还概述了测序读段适当的质量控制（QC）步骤，以去除噪声数据并提高基因组组装效果。
尽管DNA提取、文库制备和测序已成功完成，某些物种的基因组结构特性仍可能成为获得完整闭合基因组组装的障碍45,46。重复序列常常使组装计算复杂化，即使使用长读长数据，这些区域也可能仅以低置信度被解析，甚至完全无法解析。因此，长读长的平均长度通常需超过基因组中最长的重复区域，或测序深度必须足够高（&#62;100x）19。某些基因组可能仍不完整，需要通过人工方法完成补全。然而，混合组装获得的不完整基因组通常比短读长草图基因组包含更少的重叠群（contig）。调整组装算法的默认参数，或对测序读段的质量控制采用更严格的截断标准，可能有助于改善组装结果。另一种建议的方法是将长读长序列比对到不完整的区域，寻找最可能组装路径的证据，然后通过PCR扩增目标区域并进行Sanger测序来验证该路径。建议使用Minimap2进行读段比对，而Bandage则提供了一种有效工具，可用于可视化比对到已组装重叠群上的读段，从而为重叠群之间的连接关系提供证据47。
获得完整基因组的另一个挑战在于对命令行工具的熟悉程度和使用熟练度。许多生物信息学工具的开发旨在为所有用户提供计算分析的机会；然而，这些工具的使用依赖于对 UNIX 基础知识和编程的基本理解。本实验方案旨在提供足够详细的指导，使无命令行使用经验的人员也能够完成闭环基因组组装并进行注释。

尿液微生物组是一个新兴的研究领域，它打破了长期以来认为健康个体的泌尿道是无菌环境的错误观念。尿液微生物群的成员可能有助于维持泌尿环境的平衡，并预防尿路感染（UTI）1,2。尿路致病菌会侵入泌尿道，并利用多种毒力机制取代常驻微生物群、定植于尿路上皮、逃避免疫应答并抵抗环境压力3,4。尿液是一种营养相对匮乏的培养基，具有高渗透压、氮源和碳水化合物供应有限、低氧以及低pH值等特点5,6,7。此外，尿液还被认为具有抗菌特性，含有高浓度的抑制性尿素以及抗菌肽，例如人源防御素LL-378。研究常驻细菌与尿路致病菌在泌尿道定植过程中所采用的机制，对于深入理解泌尿道健康状况以及开发新的尿路感染治疗策略至关重要。此外，随着一线抗菌疗法失效的情况日益普遍，监测携带抗菌素耐药决定因子的可移动遗传元件在尿液细菌种群中的传播也变得愈发重要9,10。
为了研究尿液细菌的基因型和表型，必须成功培养这些细菌并进行全基因组测序（WGS）。依赖培养的方法对于检测和鉴定尿液样本中的可存活微生物至关重要11。标准的临床尿液培养包括将尿液接种至5%羊血琼脂（BAP）和麦康凯琼脂上，并在35 °C下有氧培养24小时12。然而，由于其检测阈值为≥105 CFU/mL13，该方法无法检出尿液微生物群中的许多成员。改进的培养技术，例如增强型定量尿液培养（EQUC）11，通过采用不同尿液体积、培养时间、培养基种类和大气条件的组合，能够识别出标准尿液培养常遗漏的微生物。本方案描述了一种EQUC的改良版本，称为改良增强型尿液培养法，该方法利用选择性培养基和最佳大气条件，实现多种尿液细菌及尿路致病菌的培养，但本身不具备定量能力。成功分离尿液细菌后，可提取基因组DNA（gDNA），用于后续的全基因组测序和基因组组装。
基因组组装，尤其是完整组装，有助于发现可能在常驻微生物群和尿路致病菌的定植、生态位维持及毒力中起作用的遗传因子。草图基因组组装包含数量不等的连续序列（contigs），这些序列可能含有测序错误，并缺乏方向性信息。在完整基因组组装中，每个碱基对的方向和准确性均已得到验证14此外，获得完整的基因组序列有助于深入了解基因组结构、遗传多样性以及可移动遗传元件15仅依靠短读长测序可能能够鉴定重要基因的存在或缺失，但无法精确定位其基因组背景。16。随着Oxford Nanopore和PacBio等长读长测序技术的发展，生成&#160;关闭 从头合成 细菌基因组组装不再需要手动闭合等繁琐方法 从头合成 通过多重PCR组装17,18短读长测序技术与纳米孔长读长测序技术的结合，使得以相对较低的成本快速获得准确、完整且闭环的细菌基因组组装成为可能。19短读长测序可产生准确但片段化的基因组组装结果，通常由平均40–100个重叠群（contigs）组成；而Nanopore测序可生成长度约为5–100 kb的长读长，准确性较低，但可作为骨架用于连接重叠群并解析基因组共线性。结合短读长和长读长技术的混合策略能够获得准确且完整的细菌基因组19.
本文介绍了一种从人类尿液中分离和鉴定细菌、提取基因组DNA、测序并利用混合组装方法进行完整基因组组装的综合实验方案。本方案特别强调了为准确组装闭合的细菌染色体及质粒等染色体外元件，对短读长和长读长测序所产生的数据进行适当处理所必需的关键步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>安捷伦</td><td>G29398A</td><td>可选但推荐</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>可用于离心锥形管和微量离心管的任何离心机（例如型号 5810R/5424R）</td></tr><tr><td>电泳</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>伯乐生命科学公司</td><td></td><td>ChemiDoc 型号</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>--</td><td>任何 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（例如 Thermo Forma model 3110）</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>12孔试管架</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>其他 Illumina 型号也可接受</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>--</td><td>Synergy H1</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2024</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>--</td><td>用于PCR反应的任何热循环仪（例如ProFlex PCR系统）</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE 缓冲液</td><td>--</td><td>--</td><td>1M Tris，1M 硼酸，0.2M EDTA（pH 8.0）</td></tr><tr><td>1429R 引物</td><td>Sigma Aldrich（定制寡核苷酸）</td><td>--</td><td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kb Ladder</td><td>VWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl（pH 7.5）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x 上样缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F 引物</td><td>Sigma Aldrich（定制寡核苷酸）</td><td>--</td><td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>63001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>厌氧袋系统 - GasPak EZ</td><td>BD诊断系统</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液肉汤</td><td>BD 诊断系统</td><td>212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC厌氧菌5%羊血琼脂</td><td>BD诊断系统</td><td>L007357</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar 显色培养基用于尿液菌群鉴定</td><td>BD诊断系统</td><td>PA-257481.04</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;和组织</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>干燥厌氧指示条</td><td>BD诊断系统</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 Proof</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>用于分子生物学</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP130210</td><td></td></tr><tr><td>流动池预处理试剂盒</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>流动池清洗试剂盒</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收小提试剂盒</td><td>BioBasic</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>连接测序试剂盒</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Research Products International Corp</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>原生条形码扩展 1-12</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 平末端/TA 连接酶预混液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA修复混合液</td><td>New England BioLabs</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext快速连接缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA CD Indexes</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Flex 文库构建 - (M) 标签化剪切</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>快速T4 DNA连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 流动池</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>绵羊血</td><td>止血实验室</td><td>DS13250</td><td></td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td>--</td><td>--</td><td>10 mM Tris，1 mM EDTA（pH 8.0）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD诊断系统</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件 &amp;与生物信息学工具：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>绷带</td><td>--</td><td>--</td><td>https://rrwick.github.io/Bandage/</td></tr><tr><td>基因组流行病学中心</td><td>--</td><td>--</td><td>http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench 12</td><td>QIAGEN</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRcasFinder</td><td>--</td><td>--</td><td>https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante（BUSCO）</td><td>--</td><td>--</td><td>https://gvolante.riken.jp/</td></tr><tr><td>Kbase Prokka 封装器</td><td>--</td><td>--</td><td>https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td></tr><tr><td>Minimap2</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>NanoFilt</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/wdecoster/nanofilt</td></tr><tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/wdecoster/nanostat</td></tr><tr><td>PHASTER</td><td>--</td><td>--</td><td>https://phaster.ca/</td></tr><tr><td>Prokka</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST</td><td>--</td><td>--</td><td>http://quast.sourceforge.net/quast</td></tr><tr><td>Trim Galore</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td>--</td><td>--</td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Unicycler</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#必要的读长</td></tr></tbody></table>

杂交 从头 基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

完整的基因组序列可为了解尿路微生物的遗传多样性及独特的定植因子提供宝贵数据。这些数据可能包含移动遗传元件，如质粒和染色体外噬菌体，它们可促进抗菌药物耐药性的传播，进一步增加尿路感染（UTI）治疗的复杂性。除了能够精细解析基因组结构外，完整且闭合的基因组还可实现详细的比较基因组学和进化分析。由于测序技术的局限性，长期以来从头（de novo）生成完整基因组一直是一项具有挑战性的任务。配对末端的高通量测序（NGS）可产生高质量的短读长序列，通常导致准确但片段化的基因组组装。相反，Nanopore测序可提供质量较低的长读长序列，通常导致易出错的完整组装。此类错误可能阻碍全基因组关联研究，或导致变异分析结果产生误导。因此，结合短读长和长读长的混合策略已成为获得高精度闭合细菌基因组的可靠方法。本文报道了一种综合性方法，包括多种尿路细菌的培养、通过16S rRNA基因测序进行物种鉴定、基因组DNA（gDNA）提取，以及分别利用NGS和Nanopore平台生成短读长和长读长序列。此外，该方法还描述了一个包含质量控制、基因组组装和基因预测算法的生物信息学分析流程，用于生成注释完整的基因组序列。结合多种生物信息学工具，可筛选高质量的测序数据用于混合基因组组装及后续分析。本方案中所述的混合从头（de novo）基因组组装的简化流程，可适用于任何可培养细菌的研究。

本方案已针对属于所列属的尿液细菌的培养与测序进行了优化 图1并非所有尿液中的细菌都能通过此方法培养。培养基和培养条件根据菌属的不同而有所规定。 图1. 典型的基因组DNA完整性凝胶电泳评估结果如图所示 图2测序读长处理、基因组组装与注释的生物信息学分析流程概述如图所示。 图3计算目录结构的指南如下所示 图 4 以简化对实验方案的理解，并为成功开展实验提供框架。此外，还包括两种克雷伯菌的代表性完整基因组 spp., K. pneumoniae 和 K. oxytoca，由本方案生成。这些组装产物的示意图如下所示 图5 还包括一个额外的不完整示例 K. pneumoniae 基因组。每个完全注释的完整基因组的详细概述如下所示 图6最后，提供了测序读长统计信息的汇总。 表1 以全面理解原始数据和修剪后数据，足以生成高质量的闭合基因组组装。此外，还包括两种代表性完整肺炎克雷伯菌的关键参数 种（复数形式）基因组已列出。基因组和原始数据已存入GenBank，登录号为BioProject PRJNA683049。
<img alt="细菌生长条件图表；厌氧与常氧；琼脂与肉汤；从链球菌属到副链状双歧杆菌属。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：多种尿源性细菌属的改良增强尿培养方法。 可用于培养多种尿源性细菌属的琼脂和液体肉汤培养基示意图。所有培养均建议在35 °C下进行，具体操作见第1.1节。圆圈表示适用于特定菌属培养的培养基，颜色为任意选择，用于区分不同类型的培养基。CDC-AN BAP（红色），CDC厌氧绵羊血琼脂；5% Sheep-BAP（橙色），绵羊血琼脂；BHI（绿色），脑心浸液培养基；TSB（黄色），胰蛋白胨大豆肉汤；CHROMagar Orientation（蓝色）。aGardnerella vaginalis 应在微需氧环境下，使用HBT双层G. vaginalis选择性琼脂以及特定肉汤培养条件进行培养44。 bLactobacillus iners 应在微需氧环境下，使用5%兔血琼脂平板（Rabbit-BAP）和NYCIII肉汤进行培养。 cLactobacillus spp. 可在微需氧条件下使用MRS培养基进行培养。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示第1-3泳道中DNA分离和条带分析的凝胶电泳图；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：基因组DNA提取琼脂糖凝胶图像。 代表性凝胶图像展示gDNA提取结果。（A）泳道1：1 kb DNA标记，泳道2：完整gDNA，表示提取成功，泳道3：弥散条带，提示gDNA发生片段化。（B）泳道1：1 kb DNA标记，泳道2和3：在1.5 kb至3 kb之间出现两条条带，表明存在rRNA污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因组组装流程图：测序读段处理、混合从头组装、注释步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：混合基因组组装工作流程。从读段质量控制和预处理到组装注释各步骤的示意图。读段修剪可去除不确定和低质量的读段。Q值和长度参数已标明，代表被保留的读段。组装过程同时利用短读段和长读段生成混合的de novo基因组组装结果。通过指定工具和参数，基于完整性和准确性评估组装质量。最终的基因组组装结果对所有基因及特定关注位点进行注释。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA测序工作流程；合并、压缩、Unicycler、Prokka；生物信息学目录结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：生物信息学目录结构指南。 本图展示了短读长和长读长数据处理、混合组装以及基因组注释与质量控制过程中推荐使用的目录和文件组织方式。关键的命令行数据处理步骤在相应文件和目录旁进行了标注。其中突出显示了命令和参数（粗体）、输入文件（蓝色）、输出文件或目录（红色）、用户输入（如文件命名规范，洋红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色体序列，质粒图谱；DNA组装，遗传分析，质粒鉴定" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：利用 Bandage 生成的基因组组装图谱。 代表性完整基因组组装图谱（A) 产酸克雷伯菌 KoPF10 和 (B) 肺炎克雷伯菌 KpPF25 及其不完整的基因组组装C) 肺炎克雷伯菌 KpPF46。KoPF10的完整基因组表现为一条闭合染色体，KpPF25的完整基因组由一条闭合染色体和五个闭合质粒组成。KpPF46的不完整染色体由两个相互连接的重叠群构成。Unicycler混合组装 从头合成 组装生成的组装图谱由Bandage可视化。该组装图谱为基因组提供了简化的示意图，通过连接单个重叠群（contig）两端的连接片段来指示闭合的染色体或质粒。若存在多个相互连接的重叠群，则表明组装不完整。在Bandage中还可查看重叠群的大小和测序深度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="环形基因组图谱；带有基因注释的DNA序列；质粒图谱；基因组分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：注释后的杂合组装完整基因组图谱。 由Geneious Prime生成的完整基因组组装图谱，分别展示（A）K. oxytoca KoPF10 和（B）K. pneumoniae KpPF25 的基因组，其中质粒骨架上的彩色箭头表示注释基因。为简化图示，染色体上仅显示rRNA和tRNA基因。基因组注释使用Prokka完成，具体操作见本实验方案第10节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细菌基因组测序数据表；包含读长统计、GC含量和质粒信息。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="表1"> 
表1：代表性克雷伯菌 种（复数形式）完整的组装特征 组装参数 K. oxytoca 菌株KoPF10和 K. pneumoniae 菌株 KpPF25。在 NCBI 上提交数据的登录号已提供。两种测序技术在修剪前后读段数量均已注明。N50 仅针对长读段提供，因为短读段长度是固定的。使用 PlasmidFinder v2.1 肠杆菌科数据库预测质粒复制子，参数设置为 80% 相同性与 60% 长度。 a MLST，多位点序列分型 b CDS，编码序列。 c 使用PlasmidFinder v2.1的Enterobacteriaceae数据库，以80%序列一致性与60%覆盖长度为参数，预测质粒复制子类型。 d Oxford Nanopore Technologies (ONT) 存入的测序读长数据 e Illumina 测序读长数据 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

本方案详细介绍了尿液细菌培养、测序及从头杂合基因组组装的综合方法。该方法提供了一种可重复的操作流程，用于生成完整的环状基因组序列，有助于研究参与尿路定植、致病机制以及抗菌药物耐药性传播的染色体和染色体外遗传元件。

完整的基因组序列可为了解尿液微生物的遗传多样性及独特定植因子提供宝贵数据。这些数据……

本综合实验方案指导如何获得多种尿液细菌的近完成图基因组，并使无编程经验的读者能够成功实施基于终端的基因组组装与分析流程。完整的基因组组装有助于发现共生菌和尿路致病菌中与定植及毒力相关的基因。近完成图基因组可揭示基因组结构及可移动遗传元件的信息。杂合基因组组装方法可应用于从其他解剖部位或环境生态位中分离得到的任何可培养细菌，以获得类似的基因组组成与结构信息。请遵循实验方案及制造商说明书制备双链DNA文库，随后通过向DNA文库中加入2.5倍体积的顺磁性磁珠进行纯化，并轻轻弹动离心管以混匀内容物。将样品在2,000 × g条件下短暂离心，室温下置于旋转仪上孵育5分钟，然后将样品置于磁力架上使磁珠聚集。接下来，用250微升新鲜配制的70%乙醇（溶于无核酸酶水中）重悬沉淀，洗涤两次，注意不要扰动沉淀。每次洗涤时将离心管置于磁力架上。每次洗涤后吸除乙醇，然后在2,000 × g下短暂离心样品，再放回磁力架。吸除残留乙醇，将沉淀在室温下干燥30秒。干燥后，将沉淀重悬于60至70微升无核酸酶水中，室温孵育2分钟，然后将样品置于磁力架上直至上清液澄清。将上清液转移至一支洁净的1.5毫升微量离心管中。使用荧光计定量浓缩的双链DNA文库，然后将700纳克样本配制成终体积为65微升的溶液，用于接头连接步骤，并将文库剩余部分保存于4摄氏度，待首次测序运行结束后用于第二次运行。按照制造商说明书继续进行接头连接。为进行测序，混合引物缓冲液并对流动池进行引物退火。制备DNA文库溶液，并将样品逐滴加入上样孔中。启动测序运行。打开测序操作软件，点击开始按钮，然后输入实验名称。前往继续选择试剂盒，以选择适用的文库制备试剂盒和条形码扩展包，然后单击继续进入运行选项。如果计划制备足够用于第二次运行的文库，请将运行时长从默认的72小时调整为48小时，然后按继续进入碱基识别。在配置快速碱基识别中勾选碱基识别选项。将条形码设置为启用状态，以便从输出的FASTQ文件中切除条形码序列，并根据条形码将数据解复用到不同的目录中。点击继续输出。接下来，选择保存输出测序数据的位置。如果仅保存 FASTQ 输出，预计数据量约为 30 至 50 吉字节；如果保存 FAST5 输出，则数据量将超过 500 吉字节。如果计划在测序后进行手动过滤，请取消勾选“读长未过滤”中的过滤选项 Qscore 七；否则，请保持该选项处于勾选状态。转到“继续运行设置”选项卡以查看所有设置。如果设置正确，请单击“开始”按钮；否则，请单击“返回”以进行必要的调整。在长读长数据目录中，为运行中使用的每个条形码创建新的目录。将与每个条形码对应的所有 fastq 文件复制到相应的文件夹中。合并每次运行中每个条形码的所有 fastq 文件。文件合并后，打开终端，使用 cd 命令进入长读长目录中的条形码子目录。将每个条形码对应的所有 fastq 文件合并为一个单独的 fastq 文件，执行相应命令，并对每个条形码重复此操作。通过执行命令使用 NanoStat 评估样本的读段质量，然后将输出结果复制到文本文件或 Word 文档中保存，以供后续参考。保存结果后，使用 NanoFilt 对 MinION 测序数据进行过滤，执行命令以去除质量值 Q 小于 7 且长度小于 200 的读段。在生成的修剪后文件上，使用命令运行 NanoStat。将输出结果复制到文本文件或 Word 文件中进行记录，并与之前的结果进行比较，以确保过滤成功。对测序运行中使用的每个条形码重复上述步骤。为生成杂合基因组组装，将短读长文件和长读长文件整理到一个名为 trimmed_reads 的单一目录中，该目录包含先前生成的 fastq 文件。用于修剪后长读段的 gz 文件，以及用于修剪后短读段的两个 fastq.gz 文件（R1 和 R2）。在终端中使用 cd 命令导航至存储读段文件的 trimmed_reads 目录。进入正确的目录后，执行命令将两个短序列文件压缩，以 fastq.gz 格式存储。对 R1 和 R2 文件均重复此步骤。确保所有序列文件均为 fastq 格式。使用 gz 格式并确认所有文件均匹配同一分离株。通过运行命令启动 Unicycler 进行混合组装。运行完成后，查看 unicycler 结果。检查日志文件以确保无错误。记录生成的上下文的数量、大小以及完整或不完整状态。如果在 Unicycler 日志中发现不完整的上下文，则通过在命令中添加标志，以加粗模式重新运行 Unicycler。打开 Bandage 软件，点击文件，然后选择加载图谱，并选中之前保存的 assembly.gfa 文件，该文件由 Unicycler 生成并位于 unicycler_output_directory 目录中。文件加载后，点击左侧工具栏中的绘制图谱按钮，通过观察重叠群（contigs）的连接方式和组织结构，判断组装是否完整。使用 cd 命令在终端中导航至存储 Unicycler 输出结果的文件夹。然后通过执行命令运行 quast 程序。在输出目录 quast_output_directory 中查看 quast 生成的报告。在终端中使用 cd 命令导航至存储 Unicycler 输出结果的文件夹，然后通过执行命令运行 prokka。通过打开 tsv 表格以及将生成的 gff 文件上传至序列分析软件来查看注释结果。在软件中可视化并分析这些注释。在代表性凝胶图像中，展示了基因组DNA或gDNA的提取结果。可以观察到成功提取并分离出完整的gDNA。同时也展示了提取失败的情况，表现为gDNA片段化以及RNA污染。细菌的基因组组装图由Unicycler杂合从头组装生成，并通过Bandage进行可视化。产酸克雷伯菌KoPF10的完整基因组表现为一条闭合的染色体，而肺炎克雷伯菌KpPF25的完整基因组包含一条闭合染色体和五个闭合质粒。肺炎克雷伯菌KpPF46的不完整染色体由两个相互连接的重叠群组成。由 Geneious Prime 生成的克雷伯氏菌 Klebsiella oxytoca KoPF10 和肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae KpPF25 完整基因组的组装图谱，显示了沿质粒骨架分布的、以彩色箭头标注的基因。为确保流动池加载成功，需使用推荐设置过滤长读长序列，并确保所有文件均为 fastq.gz 格式。使用属于同一样本的文件运行正确的 Unicycler 命令。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用短读和长读测序技术生成尿细菌完整基因组的杂交从 头 基因组组装

我们描述了一种基于化学诱变和全基因组测序的Chlamydia遗传分析方法。此外，还介绍了一种可在感染细胞内实现DNA交换的系统，可用于遗传定位。该方法可能广泛适用于缺乏转化系统和分子遗传工具的微生物体系。...

沙眼衣原体中的正向遗传学方法

表征微生物群落一直是环境微生物学中的长期目标。新一代测序技术如今能够以极低的成本和工作量，以前所未有的深度对微生物群落进行表征。本文详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。...

16S核糖体RNA基因扩增子的高通量测序

我们介绍一种高效、稳定且经济的从拭子中提取核酸的方法，用于通过16S...

高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

在微观生物的基因组测序过程中，污染问题仍然十分严重。本文介绍一种方法，仅需50...

单个缓步动物标本的超低起始量基因组测序文库制备

本实验方案的目的是结合计算研究与实验研究，寻找那些难以从共纯化序列中分离出来的新型序列，这些共纯化序列可能仅有部分被知晓。...

通过减法基因组学进行新序列发现

长读长测序技术显著促进了复杂基因组的组装以及结构变异的表征。本文介绍一种基于纳米孔测序平台生成超长读长序列的方法。该方法采用优化的DNA提取流程，结合改进的文库制备步骤，可从人类细胞中获得数百千碱基长度的读长，并达到中等测序深度。...

超长读长测序在全基因组DNA分析中的应用

我们此前已验证了一种基于扩增子的乌苏图病毒（USUV）全基因组测序方案，该方案在纳米孔测序平台上进行。本文中，我们对所使用的方法进行了更详细的描述，并确定了纳米孔R10流通池的错误率。...

以乌苏图病毒为例验证全基因组纳米孔测序

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter...

在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

本方案已针对18个耐药相关区域的靶向深度测序进行了优化 结核分枝杆菌...

使用长读长测序技术进行扩增子测序

本文介绍一种利用靶向富集技术对临床样本中细菌性性传播感染病原体进行全基因组测序的实验方案。这种基于综合征检测面板的创新方法克服了样本中人类DNA含量高而细菌载量低的技术难题，有助于对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）和生殖支原体（Mycoplasma...

利用靶向富集工作流程从临床样本生成完整的细菌基因组

本研究描述了一种在染色体序列已知或无需关注时，对质粒进行纳米孔测序的工作流程。初始的质粒DNA富集步骤可确保最佳的质粒测序深度，并最大化每张流动池可测序的样本数量。...

基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

了解如何使用短读和长读测序技术对尿路细菌进行杂交从头基因组组装。该方法利用Unicycler生成完整的环状基因组，无需编程经验即可研究细菌定植和耐药性的遗传机制。

杂交从头基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

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杂交 从头 基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

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