Name: 通过选择性核糖体分析对共翻译相互作用网络进行全局鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 了解选择性核糖体分析技术，用于在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中全局鉴定共翻译相互作用网络。该方法可捕获新生肽链修饰、靶向与折叠过程中的关键分子机制，为研究蛋白质功能组与相关疾病提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢所有实验室成员的有益讨论，以及Muhammad Makhzumy对稿件的认真审阅。本工作由以色列科学基金会（ISF）资助，资助编号2106/20。

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细介绍了选择性核糖体谱分析（SeRP）方法，该方法可用于在接近密码子分辨率下捕获共翻译相互作用。&#160;由于核糖体在协调新生肽链进入拥挤的细胞质环境中发挥着核心枢纽作用，因此该方法对于识别和表征确保功能蛋白质组所必需的多种共翻译相互作用至关重要，同时也可用于研究多种疾病。迄今为止，SeRP 是唯一能够在体内直接捕获并表征这些相互作用的方法in vivo14,15,16。
第一步也是最关键的一步是细胞收集与裂解。必须在数秒内通过瞬时冷冻并随后在冷冻状态下裂解，以快速捕获正在进行的翻译过程。细胞收集必须迅速完成，以避免核糖体脱离以及诱导应激性翻译反应，这些变化可能迅速发生。第二步关键步骤是亲和纯化。必须通过严格的洗涤减少背景结合，同时确保共翻译相互作用得以保留，这一点可通过体内交联（in vivo cross-linking）加以促进。由于本方案基于高灵敏...

选择性核糖体谱析（Selective Ribosome Profiling, SeRP）是迄今为止唯一能够以直接方式在活体（in vivo）条件下捕获并表征共翻译相互作用的方法1,2,3,4,5,6。SeRP 能够以接近密码子分辨率对任何因子与正在翻译的核糖体之间的相互作用进行全基因组水平的谱析分析2,7。
该方法依赖于对生长中的细胞进行速冻，以保存其活跃的翻译过程。随后用RNase I处理细胞裂解液，降解细胞内所有mRNA，仅保留核糖体保护的mRNA片段，这些片段称为“核糖体足迹”。然后将样品分为两部分：一部分直接用于分离细胞内全部的核糖体足迹，代表细胞中所有正在进行的翻译活动；另一部分则用于亲和纯化与特定目标因子相关联的核糖体亚群，例如：修饰酶、转位因子、折叠伴侣蛋白以及复合物组装相互作用因子。这些经亲和纯化获得的核糖体足迹 collectively 被称为相互作用组（interactome）。随后，提取核糖体保护的mRNA并用于cDNA文库构建，继而进行深度测序。
对总翻译组和相互作用组样本进行比较分析，可鉴定出所有与目标因子相关联的orfs，并表征每个orfs的相互作用谱。该谱图报告了精确的结合起始与终止序列，据此可推断出被解码的密码子以及新生多肽链的相应残基，还可分析相互作用期间核糖体移动速度的变化7,8。图1以示意图形式展示了该实验流程。
<img alt="选择性核糖体谱分析流程图；流程：从培养到数据分析；cDNA文库构建。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：SeRP实验流程概览。 本实验方案可在7-10天内完成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>3'-磷酸化28 nt RNA对照寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>定制订购</td><td>无RNase HPLC纯化；5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC&lt;br/&gt; GACGCGA/3Phos/-3'</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>酸性苯酚&amp;ndash;氯仿</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>抗体：小鼠单克隆抗HA抗体</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>细菌蛋白胨</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>细菌胰蛋白胨</td><td>BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>细菌酵母提取物</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>盐酸抑氨肽酶素</td><td>Roth</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA连接酶*</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>100 U/&amp;mu;L</td></tr><tr><td>胶体考马斯亮蓝染色液</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC处理且无菌过滤的水*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>无水D-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DNA分子量标准，10 bp O'RangeRuler*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>DNA上样缓冲液*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6&amp;times;</td></tr><tr><td>DNase I，重组</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>无RNA酶</td></tr><tr><td>dNTP溶液混合物*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Phusion聚合酶*</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的己糖激酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>异丙基&amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Roth</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Roth</td><td>T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Roth</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>连接子L(rt)</td><td>IDT</td><td>定制订购</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>NHS活化Sepharose 4快速流动珠</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40替代物</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>预制胶</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% 和 12%</td></tr><tr><td>RNA酶I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS，20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>无RNA酶</td></tr><tr><td>乙酸钠*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M，pH 5.5</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In RNA酶抑制剂</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>TBE聚丙烯酰胺凝胶*</td><td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr><tr><td>TBE&amp;ndash;尿素聚丙烯酰胺凝胶*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&amp;ndash;尿素聚丙烯酰胺凝胶*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&amp;ndash;尿素上样缓冲液*</td><td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2&amp;times;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M，pH 7.0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M，pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 10&amp;times; TBE缓冲液*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - 用于文库制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>垫圈和弹簧夹，90 mm</td><td>Millipore</td><td>&amp;nbsp;XX1009020</td><td></td></tr><tr><td>磨口烧瓶 1 L</td><td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

近年来，研究发现核糖体不仅负责解码mRNA，还指导多肽链进入拥挤的细胞环境。核糖体为膜靶向因子、修饰酶和折叠伴侣蛋白提供了在空间和动力学上受控结合的平台。甚至高等级寡聚复合物的组装以及蛋白质-蛋白质相互作用网络的形成步骤，也被发现与蛋白质的合成过程相协调。
在此，我们介绍选择性核糖体谱分析法（Selective Ribosome Profiling），一种用于捕获共翻译相互作用的方法。 体内我们将详细阐述用于捕获核糖体-新生肽链复合物及其共翻译相互作用因子的各种亲和纯化步骤，以及为解析接近密码子分辨率的共翻译相互作用所必需的mRNA提取、尺寸排阻、逆转录、深度测序和大数据分析步骤。

如本实验方案的流程图所示（图1），将细胞培养至对数生长期，随后通过过滤快速收集，并采用低温研磨法进行裂解。裂解液被分为两部分：一部分用于获取总核糖体保护的mRNA足迹，另一部分用于获取特定的核糖体保护的mRNA足迹，在后者中我们通过亲和纯化富集带有标签的蛋白-核糖体-新生肽链复合物。我们通过Western印迹分析验证了标签蛋白的表达以及富集实验的成功，结果如图2所示。我们通过小RNA电泳（2100 BioAnalyzer系统）验证了核糖体保护的mRNA足迹的分离效果，其长度通常为20–45 nt，根据仪器说明书，允许检测尺寸存在5–10 nt的偏移（图3）。随后，我们构建了用于深度测序和大数据分析的cDNA文库。在构建cDNA文库过程中需注意，循环次数不足可能导致产量偏低（如图3中第2泳道所示），但可通过重新扩增以回收已生成的文库。当PCR引物耗尽而反应继续进行时，可能发生过度扩增。若此时dNTP仍存...

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces cerevisiae中对这些相互作用进行体内直接分析的方法。

近年来，人们逐渐认识到核糖体不仅能够解码我们的mRNA，还能够引导多肽链在拥挤的细胞环境中生成……

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、折叠及组装途径中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析技术，这是一种用于在模式真核生物酿酒酵母（Saccaromyces cerevisiae）中直接分析这些相互作用的体内方法。迄今为止，选择性核糖体谱分析是唯一能够以直接方式在体内捕获并表征共翻译相互作用的方法。选择性核糖体谱分析能够以接近密码子分辨率对翻译核糖体的任何因子及其相互作用进行全局分析。首先收集含有目标标签蛋白的构建酵母细胞。使用混合研磨仪在30赫兹条件下进行两次冷冻研磨裂解细胞，每次两分钟。在4°C、30,000 × g条件下离心两分钟以澄清裂解液，并收集上清液。取200 µL上清液转移至微量离心管中用于总RNA分析，另取700 µL转移至微量离心管中用于免疫纯化。将先前分离的总RNA样品加入10单位的RNase I，在4°C、旋转混合仪上以每分钟30转的速度孵育25分钟进行消化。按照文稿中的描述制备蔗糖垫主混合液。然后，将样品加至400 µL蔗糖垫上，于245,000 × g、4 °C条件下离心90分钟。用真空泵迅速吸除上清液，并在沉淀物上覆盖150 µL裂解缓冲液。用石蜡膜固定样品，并在4°C、300转/分钟条件下振荡一小时，使沉淀重新悬浮。每份样品使用100至400微升亲和结合介质，用一毫升裂解缓冲液重悬亲和介质，重复洗涤三次。然后，在4°C、旋转混匀仪上以30转/分钟旋转五分钟。通过离心沉淀。弃去上清液，并重复此过程三次。将亲和结合介质加入先前分离的免疫纯化样品中，并使用RNase I进行消化。在4°C、每分钟30转的旋转混合仪中旋转25分钟，使蛋白质与亲和介质结合。按照文稿中的描述配制洗涤缓冲液母液。用一毫升洗涤缓冲液在混合架上旋转洗涤亲和结合介质约一分钟。随后，在四摄氏度条件下以3000 × g 离心30秒，沉淀后弃去上清液。重复三次。每次用一毫升洗涤缓冲液洗涤五分钟，在混合架上旋转，共洗涤两次。再次通过离心沉淀。使用50微升珠子与等体积的2倍上样缓冲液进行蛋白质洗脱。离心使珠子沉淀，弃去上清液。用700微升10毫摩尔的Tris缓冲液进行洗脱。然后，用液氮速冻。将样品从液氮中取出，于负80摄氏度保存，用于后续RNA提取。使用各步骤的等分试样，通过Western印迹或考马斯亮蓝染色评估亲和纯化步骤的成功与否，以非标签野生型菌株的模拟免疫沉淀作为对照，排除非特异性结合到亲和基质上的情况。亲和纯化后的蛋白质印迹结果证明了标签蛋白表达成功。通过生物分析仪结果验证了核糖体保护片段的分离。在构建用于深度测序和大数据分析的cDNA文库时，循环次数不足会导致产量偏低。然而，由于dNTPs仍然存在，反应继续进行，导致PCR产物自我引物化，产生带有嵌合序列的较长PCR副产物。所构建的文库进一步通过高灵敏度DNA电泳验证其精确的片段大小分布及定量结果。对测序文库进行接头和条形码序列截除后，将获得的读段划分为编码序列、内含子及基因间序列等不同组别。此处展示了Vma2p与核糖体相关分子伴侣Ssb1p、Pfk2p和Fas1p共翻译相互作用的核糖体图谱，并附有每项亲和纯化实验的设计方案。与Ssb1p、Pfk2p和Fas1p相互作用组相比，总翻译组的开放阅读框上均存在核糖体占据。此处显示了Ssb1p、Pfk2p和Fas1p在开放阅读框各核糖体位置的平均富集程度。该方法能够鉴定和表征多种共翻译相互作用，确保蛋白质组的正常功能，同时也可用于研究多种疾病。迄今为止，选择性核糖体谱分析是唯一能够在体内直接捕获并表征这些相互作用的方法。

global-identification-co-translational-interaction-networks-selective

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过选择性核糖体分析对共翻译相互作用网络进行全局鉴定

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

本文描述了一种用于鉴定mRNA上翻译暂停位点的技术。该方法基于在体外翻译目标mRNA时，分离在核糖体上积累的新生多肽链，随后通过变性凝胶电泳对新生肽链的大小进行分析。...

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定...

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae...

通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。...

细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

核糖体在翻译过程中以每密码子三个核苷酸的规律解码生成肽链。核糖体沿mRNA移动的过程通过核糖体谱型分析（ribosome...

从头合成 利用核糖体谱分析数据鉴定活跃翻译的开放阅读框

了解选择性核糖体分析技术，用于在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中全局鉴定共翻译相互作用网络。该方法可捕获新生肽链修饰、靶向与折叠过程中的关键分子机制，为研究蛋白质功能组与相关疾病提供重要工具。

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

探索更多视频