体内评估大动物视网膜神经节细胞及视神经功能与结构的方法

大家好，我是来自温州眼视光医院的Yikui Zhang。上神经缺乏来自食欲素神经节细胞的外显子，随后将视觉信号传递至大脑。

上神经损伤的大型动物模型对于将新型治疗方法从机器人模型转化为淋巴系统应用至关重要。本文介绍了一些在大型动物中评估上神经内食欲素神经节细胞结构与功能的体内研究方法。通过逐步展示该方法，我们希望提高实验的可重复性，并促进大型视神经病模型的应用。

使用电动剃须刀剃除毛发，并用70%酒精清洁皮肤三次，以清洁皮肤并暴露皮下静脉。静脉穿刺插入外周静脉留置针。

然后滴注阿托品和丙泊酚。使用6毫米气管插管对山羊进行气管插管，并连接人工呼吸机。以3.5%异氟烷与氧气混合，以恒定的每分钟2升流量维持麻醉。

将温度传感器置于山羊舌下。将血氧饱和度探头夹在山羊耳部近端。将血压袖带绑在大腿根部。

按顺序将心电图夹连接至四肢。随后，我们可以监测山羊的生命体征。在额骨中心部位，使用聚维酮碘和70%酒精反复消毒三次，并剃除局部毛发。

打开装有剪刀和钉子的灭菌袋。使用剪刀做皮肤切口以暴露颅骨。将钢螺钉植入额骨中心。

在枕骨两耳中间位置，用碘伏和70%酒精消毒皮肤三次，并剃除毛发。进行皮肤切口。在枕骨两耳中间位置植入钢螺钉。

将接地针电极插入额骨螺钉下方的皮下组织。使用鳄鱼夹将有源电极和参考电极分别连接至额部和枕部的螺钉，以降低电极阻抗。遮蔽一只眼睛。

将局部麻醉眼药水滴于眼表。使用散瞳眼药水扩大双侧瞳孔。将山羊头部置于充满气体的刺激器中，对准移动的光线。

将黑色毯子盖在刺激器和山羊头部，适应五分钟。使用眼睑拉钩充分暴露其瞳孔。检查电极与组织接触的阻抗。

确保每个设备的干扰范围低于10千米，以避免同一房间内其他电子设备产生的电磁干扰。在无光照刺激的情况下检查基线噪声。开始FVEP记录。

请注意，每个光照强度下的FVEP记录需进行两次。若角膜显得干燥，需用人工泪液湿润角膜。对对侧眼重复上述步骤。

依次在不同光照强度下开始FVEP记录。每次记录平均叠加64次以获得一个波形。FVEP波形中的第一个正向和负向波峰分别定义为P1和N1。灭菌后的接地电极置于耳垂处。

将灭菌后的活性电极和参考电极分别沿中线以及额骨和枕骨皮下插入。使用眼睑拉钩充分暴露瞳孔。遮盖一只眼睛。

依次记录另一只眼在不同空间频率下的图形视觉诱发电位（VEP）反应。使用鳄鱼夹连接接地电极。两个经过消毒的针状参考电极分别置于双侧外眦后方1厘米处的皮下。

使用眼睑撑开器充分暴露瞳孔。在滴入人工泪液后，将两个已消毒的视网膜电图（ERG）记录电极分别居中放置于角膜表面。两个刺激器置于每只眼睛正前方，视距为50厘米。

确保不敏感度低于10公里。在无光照刺激的情况下记录基线噪声。对准移动光源。

同时从双眼开始在不同空间频率下连续记录图形视网膜电图。最后，将屏幕恢复至无视觉刺激状态，以记录无视觉刺激器时的图形视网膜电图作为活性对照。对于3 cpd图形视网膜电图，带通滤波器设置为1至75赫兹。

带通滤波器的频率范围为1至50赫兹，用于平滑波形形状而不影响其幅度。波形中的第一个正相和负相峰值分别标记为P1和N1。图形视网膜电图（ERG）的振幅由N1至P1测量。为降低电极阻抗，将一根灭菌针状参考电极置于额部皮肤下，另一根灭菌针状参考电极置于一侧外眦后方1厘米处的皮下。

将消毒后的ERG记录电极置于滴有人工泪液的角膜上。遮盖一只眼睛。将显示器放置在距离受试者50厘米的视距处。

使用眼睑撑开器充分暴露瞳孔。然后将山羊放置在下巴托上。通过调整山羊头部位置，使其与相机对齐，从而在共聚焦扫描激光眼底镜图像中显示其视神经乳头。

单击开始按钮进入检测结束阶段。等待仪器完成加载。按下黄色开始按钮以启动正式成像。

调整操纵杆，使红外图像照明均匀，以提高图像质量。向前滑动相机，直到右上角屏幕显示直立的视网膜OCT图像。调节操纵杆，使视网膜OCT图像在水平方向上均匀分布。

按下操纵杆上的按钮以自动捕获图像。握住此操纵杆，以在实时图像屏幕上保持图像质量，直至图像采集完成。然后按下“获取”按钮。

选择一张高质量的初始照片。右键单击并选择设为参考。按下随访按钮，以允许程序自动将当前扫描与基线扫描进行匹配。

匹配完成后，按下操纵杆上的按钮以启动自动实时追踪。点击测量按钮进入测量平台。选择橡皮擦工具，擦除由机器自动标注的RFL线。

选择线条绘制工具，手动勾画内丛状层（IPL）与内核层（INL）之间的边界。红色线与蓝色线之间的区域即为神经节细胞复合体（GCC）。在恒河猴中进行的视网膜成像改变实验，所使用的设备和操作步骤与山羊中的一致。

图A显示了山羊的代表性FVEP。图B显示了山羊的代表性图形ERG波形。图C显示了猕猴的代表性图形FVEP。

图D显示了恒河猴典型的图形ERG波形。图2显示了山羊和恒河猴视神经乳头周围典型的视网膜OCT图像以及不同周边区域GCC复合体的厚度。大型动物模型在转化研究中具有重要作用。

在许多情况下，小动物模型中具有前景的治疗效果未能成功转化为对人类患者的疗效。本研究中，我们提供了山羊和恒河猴的FVEP、PERG和OCT的视频实验方案。这种活体方法可应用于多种视神经病变的大型动物模型，如青光眼、缺血性或创伤性视神经病变以及视神经炎。