Name: 体内 大型动物视网膜神经节细胞及视神经功能及结构的评估方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 了解山羊和恒河猴视网膜神经节细胞及视神经功能评估的体内电生理与成像方法。该方案结合闪光视觉诱发电位、图形视网膜电图和光学相干断层扫描技术，为青光眼、缺血性及创伤性视神经病变等转化研究提供可靠的大型动物模型实验基础。

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本研究由以下基金资助：国家重点项目&amp;中国国家重点研发计划（2021YFA1101200）；温州市医学科研项目（Y20170188），国家关键研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2016YFC1101200）；国家自然科学基金（81770926；81800842）；重点研发项目&amp;#38;D 计划浙江省项目（2018C03G2090634）；浙江省重点研发计划&amp;#38;D 温州眼视光医院项目（YNZD1201902）。资助方或资助机构未参与本研究的设计或实施。

实验严格遵循 ARRIVE 指南以及美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南，并符合温州医科大学（WMU）和集运实验室（苏州）机构动物护理与使用委员会批准的协议。4 至 6 月龄、体重为 19–23 kg 的雄性萨能山羊饲养于温州医科大学动物实验中心。5 至 6 岁、体重为 5–7 kg 的雄性恒河猴饲养于集运动物实验中心。所有动物均饲养在温度受控（21 ± 2 °C）的空调房间内，采用 12 小时光照/12 小时黑暗循环，自由进食。
1. 山羊闪光视觉诱发电位（FVEP）
<ol>
	<li>全身麻醉
	<ol>
		<li>使用电动剃刀剃除踝关节处的毛发。</li>
		<li>用70%酒精棉球擦拭皮肤三次以清洁皮肤，随后暴露皮下静脉。</li>
		<li>静脉插入外周静脉导管（0.9 mm × 25 mm），然后注射阿托品（0.025 mg/kg）和丙泊酚（5 mg/kg）。</li>
		<li>使用6 mm气管插管对山羊进行气管插管，并连接至人工呼吸机。</li>
		<li>以2 L/min的恒定流速，通过氧气输送3.5%异氟烷维持麻醉。 
		注意：丙泊酚诱导的麻醉在数分钟内即可消退，因此需迅速完成气管插管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心肺功能监测
	<ol>
		<li>将温度传感器置于舌下。</li>
		<li>将脉搏血氧仪连接至耳部近端。</li>
		<li>将血压袖带绑缚于大腿根部。</li>
		<li>将心电图夹正确夹在四肢上。 
		注意：山羊的正常心率为68–150次/分钟（bpm）。由于使用气体麻醉，山羊心率会升高，因此本实验中检测到的心率为170 ± 30 bpm。山羊在正常状态下的收缩压为110–130 mmHg，舒张压为50–60 mmHg。在吸入氧气的状态下，山羊的血氧饱和度可始终维持在99%。麻醉状态下山羊的呼吸频率与呼吸机同步，为10次/分钟。由于温度测量来自舌下，而非核心体温，因此山羊体温通常为35 ± 2 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颅骨螺钉植入与电极放置
	<ol>
		<li>使用剪毛器剃除毛发。用浸有聚维酮碘和70%酒精的棉球交替擦拭额骨中心区域皮肤三次，进行消毒。</li>
		<li>使用已灭菌的螺钉和剪刀。 
		注意：所有手术器械均需高压灭菌（121 °C，20分钟）。</li>
		<li>使用眼科剪做5 mm皮肤切口以暴露额骨，然后使用螺丝刀将已灭菌的螺钉植入额骨中心。</li>
		<li>剃除两耳之间枕骨中央区域的毛发，并用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭三次，进行皮肤消毒。</li>
		<li>使用眼科剪做5 mm皮肤切口以暴露枕骨，然后将已灭菌的螺钉植入枕骨中心。 
		注意：接地针电极应皮下插入额骨螺钉下方。活动电极和参考电极分别通过鳄鱼夹连接至枕骨和额骨螺钉，以降低电极阻抗16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>使用避光布覆盖眼睛，并用眼罩固定以遮蔽单侧眼睛。</li>
		<li>双眼滴加表面麻醉眼药水（盐酸丙帕他卡因眼药水）。通过滴加含托吡卡胺（5%）和去氧肾上腺素（5%）的散瞳眼药水，使双侧瞳孔散大。</li>
		<li>将山羊头部放入全视野刺激器中，并调暗周围环境光。 
		注意：研究发现山羊在麻醉状态下可保持良好的眼球固视，因此无需额外进行眼球固定操作干预。</li>
		<li>用黑色毯子覆盖刺激器及山羊头部，持续5分钟以适应环境。</li>
		<li>使用眼睑撑开器暴露球结膜。折叠上环，向上牵拉上眼睑，先将上环插入上眼睑结膜囊，再以类似方式插入下眼睑。</li>
		<li>按下 阻抗 按钮，检查电极与组织接触的阻抗值，各通道的阻抗值将显示出来。</li>
		<li>确保每个电极的阻抗低于10 kΩ，以避免同一房间内其他电器设备的电磁干扰。 
		注意：若阻抗高于10 kΩ，需重新连接或更换电极。若山羊所躺的金属手术床通电，可能导致阻抗异常升高。活动电极与参考电极之间的阻抗差异应小于1 kΩ，以减少电干扰17。</li>
		<li>按下 示波图 按钮，检查无光刺激时的基线噪声。 
		注意：若基线噪声较大，应关闭房间内所有其他电器设备并关闭手机。若基线问题持续存在，请跳转至步骤1.3.10，检查是否能诱发出典型的FVEP波形。若不能，则需另择时间重新安排FVEP检测。</li>
		<li>在右上角的白色背景框中分别选择光强为0.025、0.5和3.0 cd·s/m2，开始FVEP记录，然后按下 检测 按钮。注意，每种光强下的FVEP记录需重复两次。 
		注意：若两次波形明显不同，需再重复一次。</li>
		<li>若在红外摄像下观察到角膜干燥，使用人工泪液眼药水湿润角膜。 
		注意：记录前应通过内置红外摄像机监测眼位，确保视觉注视方向正确且瞳孔完全暴露（从而使闪光刺激的视野范围达到90°）。麻醉状态下山羊的眼位可通过适当转动其头部进行调整。根据我们的观察，在全身麻醉下山羊进行FVEP记录期间（约10分钟），极少发生注视偏移9，因此记录过程中无需暂停并重新调整注视方向。</li>
		<li>对对侧眼重复上述步骤。</li>
		<li>停止异氟烷供应，并略微增加呼吸机的潮气量，以帮助山羊从全身麻醉中恢复。</li>
		<li>全身麻醉结束后，给予庆大霉素（4 mg/kg，肌内注射）和头孢噻呋钠（一种头孢菌素，2 mg/kg，肌内注射）以预防感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FVEP测量与定量分析 
	注意：如 图1A 所示，FVEP波形中的第一个正相和负相波峰分别定义为P1和N1，第二个正相波峰为P2。P1、N1和P2的典型潜伏期分别约为40、60和120 ms。P1和P2的振幅分别从N1波谷至P1和P2波峰进行测量。
	<ol>
		<li>在单眼损伤情况下，可通过双眼振幅与潜伏期的比较，帮助减少不同检测会话间的变异，提高检测敏感性17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 恒河猴的PVEP
注意：图形视觉诱发电位（Pattern VEPs）可在恒河猴中诱发9，其在振幅和潜伏时间上的稳定性优于闪光视觉诱发电位（Flash VEP）17。因此，PVEP 被用于检测非人灵长类动物视网膜-外侧膝状体-皮层通路的完整性。
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>使用 Zoletil50（4–8 mg/kg，肌内注射，替来他明/唑拉西泮）诱导麻醉后，用异氟烷（1.5%–2%）维持猴的麻醉状态。</li>
		<li>将灭菌的接地电极置于耳垂处；将灭菌的有源电极和参考电极分别沿中线皮下插入额骨和枕骨部位。</li>
		<li>使用眼睑撑开器暴露球结膜。</li>
		<li>使用不透明黑色胶带遮盖对侧眼睛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视觉诱发电位（PVEP）记录
	<ol>
		<li>按下 阻抗 按钮以检查电极-组织接触阻抗，各通道将显示阻抗值；确保阻抗低于 10k Ω。若不符合要求，请重新连接或更换电极。</li>
		<li>在 阻抗测试窗口 中检查阻抗值，并确保有源电极与参考电极之间的阻抗差小于 1 kΩ，以减少电干扰17。</li>
		<li>按下 示波图 按钮，检查无刺激状态下的基线噪声。 
		注：若基线噪声较大，请拔掉同一房间内所有其他电器设备并关闭手机。若基线问题仍存在，请改日重新进行 PVEP 检测。</li>
		<li>在右上角白色背景框中分别选择 0.5 和 1.0 cycle/degree 的光强度，记录未遮盖眼的 PVEP 反应，然后按下 检测 按钮。 
		注：每次记录平均叠加 64 次扫描以获得一条波形。针对每个频率，至少获取两次记录以验证 PVEP 信号的可重复性。</li>
		<li>对对侧眼重复上述操作。</li>
		<li>完成后，停止异氟烷供给以使猴苏醒。</li>
		<li>全身麻醉结束后，给予庆大霉素（4 mg/kg，肌内注射）和头孢噻呋钠（2 mg/kg，肌内注射）以预防感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PVEP 测量与定量分析
	<ol>
		<li>如 图 1B 所示，PVEP 波形中的第一个负向和正向波峰分别定义为 N1 和 P1，其潜伏期通常约为 50 ms 和 90 ms。P1 振幅从 N1 波谷到 P1 波峰进行测量。</li>
		<li>在单眼损伤情况下，可通过双眼振幅和潜伏期的对比分析，帮助减少不同检测会话间的变异，提高检测敏感性17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 山羊的图形视网膜电图（PERG）
注意：在先前的研究中，山羊的PERG信号未观察到双眼间的交叉干扰，因此可以同时记录双眼的PERG反应9。
<ol>
	<li>检查前准备
	<ol>
		<li>使用赛拉嗪（3 mg/kg，肌内注射）对山羊进行麻醉，并将其置于检查台上。</li>
		<li>将温度传感器置于山羊舌下。</li>
		<li>将脉搏血氧仪连接至山羊耳部近端。</li>
		<li>将血压袖带绑在大腿上。</li>
		<li>将心电图夹按相应位置夹在四肢上。</li>
		<li>为降低电极阻抗，将已灭菌的颅骨螺钉置于额骨上，并用鳄鱼夹连接至接地电极。</li>
		<li>将两个已灭菌的针状参考电极分别皮下植入双侧外眦后方1 cm处。</li>
		<li>使用眼睑撑开器暴露球结膜。</li>
		<li>局部滴加人工泪液后，将两个已消毒的ERG-Jet记录电极置于双侧角膜中央。</li>
		<li>在双眼前方各放置一台尺寸为47.6 cm × 26.8 cm的LED显示器，视距为50 cm。</li>
		<li>调整每台显示器，使其与同侧瞳孔平面平行，并将显示器中心对准瞳孔平面。</li>
		<li>确保两台显示器均显示对比度反转的棋盘格图案（时间频率为2.4 Hz），且最大纵横比为4:3，该参数由设备设置决定。</li>
		<li>确保黑白方格之间的对比度保持在96%，平均亮度为200 cd/m2（坎德拉每平方米），并通过亮度计进行校验。 
		注：根据ISCEV标准，人类检查中所需的平均明视觉亮度为40–60 cd/m217。另一项使用小鼠模型的研究中，图案的平均亮度保持在800 cd/m218。标准PERG检查在人类中要求最小维度至少为15°17。若角膜电极未位于角膜表面中心，应调整其位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PERG记录
	<ol>
		<li>调暗环境光，按下阻抗按钮以检测电极与组织之间的接触阻抗。各通道的阻抗值将被显示出来。</li>
		<li>在阻抗测试窗口中查看阻抗值，确保阻抗低于10 kΩ。若不符合要求，则重新连接或更换电极。</li>
		<li>按下示波图按钮，在无光照刺激条件下检查基线噪声。 
		注：请注意保护脆弱的ERG-Jet记录电极。山羊的PERG基线噪声通常小于FVEP的基线噪声。</li>
		<li>从0.1、0.3、1.0、3.0到12.6 周/度的空间频率依次连续记录双眼的PERG信号。每个空间频率下平均叠加64次扫描以获得一个读数。</li>
		<li>最后关闭显示器，记录无视觉刺激条件下的PERG信号作为阴性对照。 
		注：PERG信号通常稳定，无需重复记录。</li>
		<li>移除额部颅骨螺钉，并注射伊德佐烷（1.5 mg/kg，肌内注射），即赛拉嗪拮抗剂，使山羊苏醒。</li>
		<li>全身麻醉结束后，给予庆大霉素（4 mg/kg，肌内注射）和头孢噻呋钠（2 mg/kg，肌内注射）以预防感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PERG测量与定量分析
	<ol>
		<li>将带通滤波器设置为1–75 Hz。对于3.0 cpd的PERG信号，带通滤波器设为1–50 Hz，以平滑波形而不影响其幅度。</li>
		<li>如图1C所示，波形中的第一个正向和负向波峰分别定义为P1（通常约25 ms）和N1（通常约55 ms）。PERG振幅由N1至P1测量。</li>
		<li>在单眼损伤情况下，我们采用双眼振幅和潜伏期的对比分析，以帮助减少不同测试会话间的变异并降低敏感性17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 恒河猴的PERG
注意：尚不清楚恒河猴的 PERG 信号是否存在双眼间的交叉对话，因此需分别记录双眼的 PERG 反应。
<ol>
	<li>检查前准备
	<ol>
		<li>注射 Zoletil50（4-8 mg/kg 肌注，tiletamine/zolazepam）并进行气管插管后，使用异氟烷（1.5%-2%）麻醉猴子。</li>
		<li>将灭菌的接地电极皮下植入额骨处。在同一侧外眦后方1 cm处，皮下插入灭菌的针状参考电极。</li>
		<li>滴用人工泪液后，将消毒过的ERG-Jet记录电极置于中央角膜上。 
		注意：若角膜电极未位于角膜表面中心，应调整其位置。</li>
		<li>使用粘性不透明黑色胶带遮盖一只眼睛。</li>
		<li>将显示器（47.6 x 26.8 cm）放置在距离50 cm的观察位置。</li>
		<li>确保显示器调整至与瞳孔平面平行，并将显示器中心对准瞳孔平面。</li>
		<li>确保黑白棋盘格图案以2.4 Hz频率翻转，纵横比为4:3，由设备设置确定。</li>
		<li>确保黑白方格之间的对比度为96%，平均亮度维持在200 cd/m2，并通过亮度计进行校验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>模式视网膜电图（PERG）记录
	<ol>
		<li>调暗环境光，并检查电极与组织接触的阻抗。</li>
		<li>确保阻抗低于10 kΩ；若不符合，重新连接或更换电极。</li>
		<li>在无光照刺激条件下检查基线噪声。</li>
		<li>遮盖一只眼，对另一只眼依次在空间频率0.1、0.3、1.0、3.0和12.6 周/度下开始PERG记录。</li>
		<li>对对侧眼重复步骤4.2.1–4.2.4。</li>
		<li>停止异氟烷供给以使猴子苏醒。</li>
		<li>全身麻醉结束后，给予庆大霉素（4 mg/kg 肌注）和头孢噻呋钠（2 mg/kg 肌注）以预防感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PERG测量与定量分析
	<ol>
		<li>如图1D所示，波形中的第一个正向和负向波峰分别定义为P1（通常约40 ms）和N1（通常约85 ms）。PERG振幅从N1到P1进行测量。</li>
		<li>在单眼损伤情况下，我们采用双眼间振幅和潜伏期的比较，以帮助减少不同记录会话间的变异，提高检测敏感性17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 山羊中的 OCT
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>使用赛拉嗪（3 mg/kg，肌内注射）对山羊进行麻醉，然后进行气管插管。</li>
		<li>通过滴注含托吡卡胺（5%）和去氧肾上腺素（5%）的散瞳眼药水，实现瞳孔散大。</li>
		<li>使用眼睑撑开器充分暴露瞳孔。</li>
		<li>将山羊头部置于下颌托架上。 
		注意：尽管未实施气体麻醉，仍需常规进行气管插管，以防止下颌托架压迫气道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OCT成像 
	注意：本研究中采用波长为870 nm的OCT系统进行视网膜OCT成像。OCT扫描仪的光学轴向分辨率为12 µm。采用高分辨率模式下的环形扫描方式对视神经乳头（ONH）进行扫描。通过平均100帧图像以优化图像质量。详细的培训指南可在线获取（参见材料表）。
	<ol>
		<li>初始OCT扫描（基线检查）
		<ol>
			<li>点击开始按钮进入检测界面。等待设备加载完成后，按下黄色的开始&#160;按钮以启动成像。</li>
			<li>调整山羊体位，使其在红外相机中的图像与共焦扫描激光检眼镜（cSLO）图像对齐，确保ONH位于图像中央。</li>
			<li>调节操纵杆，使整个红外图像受光均匀，以提高图像质量。</li>
			<li>向前推动操纵杆，直至正立屏幕上显示正立的视网膜OCT图像。</li>
			<li>调节操纵杆，使视网膜OCT图像密度均匀且呈水平排列。</li>
			<li>按下操纵杆上的按钮自动捕获图像，并在图像采集完成前持续握住操纵杆以维持实时图像质量。随后，点击采集。</li>
			<li>注射依地唑烷（1.5 mg/kg，赛拉嗪拮抗剂）使山羊苏醒。 
			注意：根据我们的经验，在基线检查中将ONH居中，有助于后续对齐基线扫描与随访扫描。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>随访OCT扫描
		<ol>
			<li>选择一幅高质量的初始OCT图像；右键点击并选择设为参考。</li>
			<li>按照上述方法启动OCT成像。</li>
			<li>点击随访按钮，使当前扫描自动匹配至参考扫描。</li>
			<li>匹配完成后（环形扫描圈变为绿色），按下操纵杆上的按钮以激活自动实时追踪功能。</li>
			<li>注射依地唑烷（1.5 mg/kg，赛拉嗪拮抗剂）使山羊苏醒。 
			注意：为便于匹配过程，(1) 可相应转动头部以在实时窗口中移动ONH，或 (2) 倾斜头部以在实时窗口中旋转ONH，使当前cSLO图像更接近基线图像。这种前庭-眼反射在赛拉嗪麻醉下效果良好19。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OCT测量
	<ol>
		<li>点击测量按钮进入测量界面。</li>
		<li>选择橡皮擦工具，擦除程序自动标注的RNFL线。</li>
		<li>选择线条绘制工具，手动勾画IPL与INL之间的边界（图2）。 
		注意：屏幕上可读取六个围绕视神经乳头的区域（T、TS、TI、N、NS、NI）的GCC厚度，以及围绕ONH的平均GCC厚度（G）（图2）。若数据呈正态分布，可采用学生t检验、单因素方差分析或双因素方差分析对OCT数据进行量化分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 恒河猴中的光学相干断层扫描
<ol>
	<li>使用与山羊相同的设备和操作流程，在恒河猴中进行视网膜光学相干断层扫描（OCT）成像。</li>
</ol>

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<li>Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+assessment+of+retinal+ganglion+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function.</a> Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).</li>
<li>Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+retinal+ganglion+cell+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Assessing retinal ganglion cell damage.</a> Eye. 31 (2), 209-217 (2017).</li>
<li>Schuman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+and+histologic+measurements+of+nerve+fiber+layer+thickness+in+normal+and+glaucomatous+monkey+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+reproducibility+of+VEP+recording+in+rats%3A+electrodes%2C+stimulus+source+and+peak+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis.</a> Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).</li>
<li>Odom, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISCEV+standard+for+clinical+visual+evoked+potentials%3A+%282016+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update).</a> Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil-induced+ocular+hypertension+and+glaucomatous+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse.</a> eLife. 8, 45881(2019).</li>
<li>Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical%2C+horizontal%2C+and+torsional+eye+movement+responses+to+head+roll+in+the+squirrel+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey.</a> Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).</li>
<li>Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+pattern+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The mouse pattern electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们介绍了山羊和恒河猴的视觉诱发电位（VEP）、图形视网膜电图（PERG）和光学相干断层扫描（OCT）的操作方案。这些体内方法可应用于多种视神经病变的大型动物模型，如青光眼、缺血性或创伤性视神经病变以及视神经炎9。
PVEP 比 FVEP 更稳定且更敏感17；然而，在山羊中无法诱发出 PVEP9。因此，在本实验室中，我们对山羊进行 FVEP 检测，对恒河猴进行 PVEP 检测，以评估视网膜-外侧膝状体-皮层通路的完整性。据我们所知，目前尚不清楚为何在山羊中可以诱发出 PERG 而不能诱发出 PVEP。可能的原因是山羊的视神经功能和结构与人类存在差异。
由于FVEP的振幅可能受瞳孔大小和环境光照的影响，我们在记录FVEP时会散大瞳孔，并在山羊头部覆盖一条黑色毯子。需要注意的是，在临床FVEP检查中无需散瞳17。类...

视神经（ON）由视网膜神经节细胞（RGC）的轴突组成，负责将视觉信号从视网膜传递至大脑。视神经疾病，例如青光眼、外伤性或缺血性视神经病变，常导致不可逆的视神经/RGC退变及严重的视力丧失。尽管目前在啮齿类动物模型中已取得多项视神经再生和RGC保护的突破性进展1,2,3,4,5,6，但大多数视神经疾病的临床治疗在过去半个世纪中基本未变，疗效仍不理想7,8。为了弥合基础研究与临床实践之间的差距，利用大动物视神经疾病模型开展转化研究通常是必要且有益的，因为大动物模型在解剖结构上比啮齿类动物更接近人类。
山羊和恒河猴是本实验室用于模拟人类视神经疾病的两种大型动物模型。根据颅骨CT扫描结果，山羊眼球、视神经及其邻近结构（如眼眶、鼻腔、颅底等）的尺寸与人类相似9。因此，山羊模型为在人类应用前评估和优化治疗设备或外科手术操作提供了重要机会。恒河猴作为非人灵长类动物（NHP），具有与人类相似的独特视觉系统，而这种系统在其他物种中并不存在10,11。此外，非人灵长类动物对损伤和治疗的病理生理反应也与人类更为接近12。
体内测试可纵向评估视神经（ON）和视网膜神经节细胞（RGC）的结构与功能，在大动物研究中具有重要意义。图形视网膜电图（PERG）可用于评估RGC功能，闪光视觉诱发电位（FVEP）则反映视觉系统中视网膜-外侧膝状体-皮层通路的完整性。因此，PERG联合FVEP可反映视神经功能9,13,14。视网膜光学相干断层扫描（OCT）成像具有高时间与空间分辨率，可清晰显示视网膜结构，并实现对视网膜神经节细胞复合层（GCC）厚度的精确测量9,15。在本研究的电生理检查中，检测前监测生命体征（心率、呼吸频率、血压）及血氧饱和度（SpO2）水平至关重要，因为这些参数显著影响眼部血流，进而影响视觉系统的功能。然而，为简化操作，我们在进行OCT视网膜成像时未监测生命体征。根据我们先前的研究9，OCT测量的GCC厚度非常稳定，不同检测会话间的变异系数接近3%。山羊和恒河猴中的这些体内测试方法已在我们之前的研究中详细描述9。本文再次呈现这些方法，以促进实验的透明度与可重复性。

<table><tbody><tr><td>47.6 x 26.8 cm 显示器</td><td>DELL Inc.</td><td>E2216HV</td><td>对比反转的黑白棋盘格视觉刺激呈现在屏幕上</td></tr><tr><td>6.0 mm 气管插管</td><td>河南拓人医疗器械有限公司</td><td>PVC 6.0</td><td>确保气道通畅</td></tr><tr><td>鳄鱼夹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿托品</td><td>广东揭阳龙阳动物药业有限公司</td><td></td><td>减少支气管分泌物并保护心脏免受迷走神经激活的影响</td></tr><tr><td>卡波姆眼用凝胶</td><td>Fabrik GmbH，Bausch 的子公司 &amp;& 罗姆</td><td></td><td>润湿角膜并稳定记录电极</td></tr><tr><td>ERG-Jet 记录电极</td><td>Roland Consult Stasche&amp;amp;Finger GmbH</td><td>2300 拉绍德封</td><td>ERG 记录</td></tr><tr><td>眼睑撑开器</td><td>上海金钟医疗器械有限公司</td><td>ZYD020</td><td>睁眼裂</td></tr><tr><td>海德堡Spectralis OCT系统</td><td>海德堡工程公司</td><td></td><td>OCT 系统</td></tr><tr><td>成像</td><td></td><td></td><td>(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD生命科学有限公司</td><td>R510-22</td><td>异氟烷麻醉</td></tr><tr><td>雄性萨能山羊</td><td>中国杭州，蔡牧畜牧有限公司</td><td></td><td>4至6月龄、体重19公斤的雄性萨能山羊&amp;ndash;23 kg</td></tr><tr><td>针电极</td><td>Roland Consult Stasche&amp;amp;Finger GmbH</td><td>U51-426-G-D</td><td>用于FVEP接地电极和PERG参考电极</td></tr><tr><td>外周静脉导管静脉输注</td><td>BD 上海医疗器械有限公司</td><td>383019</td><td>静脉通路用于阿托品和异丙酚</td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>贤力邦企业联合会管理有限公司</td><td></td><td>在山羊中诱导异氟烷麻醉</td></tr><tr><td>复方托吡卡胺滴眼液</td><td>SANTEN OY，日本</td><td></td><td>5% 托吡卡胺和5% 盐酸去氧肾上腺素</td></tr><tr><td>视觉电生理设备</td><td>高特克有限公司</td><td>GT-2008V-III</td><td>用于FVEP &amp;和 PERG</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>华牧动物保健品有限公司</td><td></td><td>赛拉嗪麻醉：按3 mg/kg剂量行肌肉注射赛拉嗪</td></tr><tr><td>zoletil50</td><td>Virbac</td><td></td><td>在猴子中诱导异氟烷麻醉</td></tr></tbody></table>

体内评估大动物视网膜神经节细胞及视神经功能与结构的方法

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

视神经收集来自视网膜神经节细胞的轴突信号，并将视觉信号传递至大脑。由于大型动物模型在体型和解剖结构上更接近人类，因此在将新型治疗策略从啮齿类动物模型转化为临床应用的过程中，视神经损伤的大型动物模型至关重要。本文介绍了一些用于评估大型动物视网膜神经节细胞（RGCs）和视神经（ON）功能与结构的体内方法，包括视觉诱发电位（VEP）、图形视网膜电图（PERG）和光学相干断层扫描（OCT）。本研究采用了山羊和非人灵长类动物。通过逐步展示这些体内方法，我们希望提高不同实验室之间的实验可重复性，并促进视神经病变大型动物模型的应用。

图1A展示了山羊FVEP的代表性结果。尽管相同闪光强度下的波形具有相对相似性，我们仍建议对波形进行两次检查。电子设备产生的电磁波会干扰所采集的电信号，导致基线噪声较高且波形重复性差。因此，建议在进行电生理检查时，确保周围环境中没有多余的电子设备插电运行，以避免此类干扰，并建议至少重复测量两次，以确定实验结果的稳定性和可重复性。当双眼均被遮盖时，双眼记录的波形完全平坦，表明波形确实来源于我们的闪光刺激。图1B展示了山羊PERG的代表性结果。由于其信号稳定且强度高，我们在每个空间频率下仅需一次测量即可获得可靠的波形。随着空间频率的增加，棋盘格的尺寸将逐渐超出山羊眼睛的分辨能力。因此，我们可以看到在12.7 cpd时，PVEP波形已显著下降。与FVEP类似，当我们关闭屏幕时，波形消失。图1C展示了恒河猴PVEP的代表性结果。我们在每个空间频率下重复测量两次。随着空间频率的增加，波幅会下降。这是由于空间频率已超过眼睛的感知能力所致。<strong class="xfi...

本文演示了在山羊和恒河猴中进行的多种体内检测方法（闪光视觉诱发电位、图形视网膜电图和光学相干断层扫描），以研究视神经及其神经元的结构与功能。

视神经收集来自视网膜神经节细胞的轴突信号，并将视觉信号传递至大脑。视神经损伤的大动物模型……

大家好，我是来自温州眼视光医院的Yikui Zhang。上神经缺乏来自食欲素神经节细胞的外显子，随后将视觉信号传递至大脑。上神经损伤的大型动物模型对于将新型治疗方法从机器人模型转化为淋巴系统应用至关重要。本文介绍了一些在大型动物中评估上神经内食欲素神经节细胞结构与功能的体内研究方法。通过逐步展示该方法，我们希望提高实验的可重复性，并促进大型视神经病模型的应用。使用电动剃须刀剃除毛发，并用70%酒精清洁皮肤三次，以清洁皮肤并暴露皮下静脉。静脉穿刺插入外周静脉留置针。然后滴注阿托品和丙泊酚。使用6毫米气管插管对山羊进行气管插管，并连接人工呼吸机。以3.5%异氟烷与氧气混合，以恒定的每分钟2升流量维持麻醉。将温度传感器置于山羊舌下。将血氧饱和度探头夹在山羊耳部近端。将血压袖带绑在大腿根部。按顺序将心电图夹连接至四肢。随后，我们可以监测山羊的生命体征。在额骨中心部位，使用聚维酮碘和70%酒精反复消毒三次，并剃除局部毛发。打开装有剪刀和钉子的灭菌袋。使用剪刀做皮肤切口以暴露颅骨。将钢螺钉植入额骨中心。在枕骨两耳中间位置，用碘伏和70%酒精消毒皮肤三次，并剃除毛发。进行皮肤切口。在枕骨两耳中间位置植入钢螺钉。将接地针电极插入额骨螺钉下方的皮下组织。使用鳄鱼夹将有源电极和参考电极分别连接至额部和枕部的螺钉，以降低电极阻抗。遮蔽一只眼睛。将局部麻醉眼药水滴于眼表。使用散瞳眼药水扩大双侧瞳孔。将山羊头部置于充满气体的刺激器中，对准移动的光线。将黑色毯子盖在刺激器和山羊头部，适应五分钟。使用眼睑拉钩充分暴露其瞳孔。检查电极与组织接触的阻抗。确保每个设备的干扰范围低于10千米，以避免同一房间内其他电子设备产生的电磁干扰。在无光照刺激的情况下检查基线噪声。开始FVEP记录。请注意，每个光照强度下的FVEP记录需进行两次。若角膜显得干燥，需用人工泪液湿润角膜。对对侧眼重复上述步骤。依次在不同光照强度下开始FVEP记录。每次记录平均叠加64次以获得一个波形。FVEP波形中的第一个正向和负向波峰分别定义为P1和N1。灭菌后的接地电极置于耳垂处。将灭菌后的活性电极和参考电极分别沿中线以及额骨和枕骨皮下插入。使用眼睑拉钩充分暴露瞳孔。遮盖一只眼睛。依次记录另一只眼在不同空间频率下的图形视觉诱发电位（VEP）反应。使用鳄鱼夹连接接地电极。两个经过消毒的针状参考电极分别置于双侧外眦后方1厘米处的皮下。使用眼睑撑开器充分暴露瞳孔。在滴入人工泪液后，将两个已消毒的视网膜电图（ERG）记录电极分别居中放置于角膜表面。两个刺激器置于每只眼睛正前方，视距为50厘米。确保不敏感度低于10公里。在无光照刺激的情况下记录基线噪声。对准移动光源。同时从双眼开始在不同空间频率下连续记录图形视网膜电图。最后，将屏幕恢复至无视觉刺激状态，以记录无视觉刺激器时的图形视网膜电图作为活性对照。对于3 cpd图形视网膜电图，带通滤波器设置为1至75赫兹。带通滤波器的频率范围为1至50赫兹，用于平滑波形形状而不影响其幅度。波形中的第一个正相和负相峰值分别标记为P1和N1。图形视网膜电图（ERG）的振幅由N1至P1测量。为降低电极阻抗，将一根灭菌针状参考电极置于额部皮肤下，另一根灭菌针状参考电极置于一侧外眦后方1厘米处的皮下。将消毒后的ERG记录电极置于滴有人工泪液的角膜上。遮盖一只眼睛。将显示器放置在距离受试者50厘米的视距处。使用眼睑撑开器充分暴露瞳孔。然后将山羊放置在下巴托上。通过调整山羊头部位置，使其与相机对齐，从而在共聚焦扫描激光眼底镜图像中显示其视神经乳头。单击开始按钮进入检测结束阶段。等待仪器完成加载。按下黄色开始按钮以启动正式成像。调整操纵杆，使红外图像照明均匀，以提高图像质量。向前滑动相机，直到右上角屏幕显示直立的视网膜OCT图像。调节操纵杆，使视网膜OCT图像在水平方向上均匀分布。按下操纵杆上的按钮以自动捕获图像。握住此操纵杆，以在实时图像屏幕上保持图像质量，直至图像采集完成。然后按下“获取”按钮。选择一张高质量的初始照片。右键单击并选择设为参考。按下随访按钮，以允许程序自动将当前扫描与基线扫描进行匹配。匹配完成后，按下操纵杆上的按钮以启动自动实时追踪。点击测量按钮进入测量平台。选择橡皮擦工具，擦除由机器自动标注的RFL线。选择线条绘制工具，手动勾画内丛状层（IPL）与内核层（INL）之间的边界。红色线与蓝色线之间的区域即为神经节细胞复合体（GCC）。在恒河猴中进行的视网膜成像改变实验，所使用的设备和操作步骤与山羊中的一致。图A显示了山羊的代表性FVEP。图B显示了山羊的代表性图形ERG波形。图C显示了猕猴的代表性图形FVEP。图D显示了恒河猴典型的图形ERG波形。图2显示了山羊和恒河猴视神经乳头周围典型的视网膜OCT图像以及不同周边区域GCC复合体的厚度。大型动物模型在转化研究中具有重要作用。在许多情况下，小动物模型中具有前景的治疗效果未能成功转化为对人类患者的疗效。本研究中，我们提供了山羊和恒河猴的FVEP、PERG和OCT的视频实验方案。这种活体方法可应用于多种视神经病变的大型动物模型，如青光眼、缺血性或创伤性视神经病变以及视神经炎。

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