利用活性氧敏感型荧光探针对小鼠肠道类器官中的氧化应激进行分析

该方法是细胞生物学领域中一种有价值的工具，可用于通过荧光探针检测在体外培养为类器官的活体原代细胞中的细胞内活性氧（ROS）水平。该技术的主要优势在于，可通过显微镜对完整肠类器官中的ROS进行定性观察，并利用96孔板通过流式细胞术对解离后的细胞进行定量分析。该方法可应用于其他类器官模型，也可使用不同的荧光传感器来分析多种细胞信号通路。

首次应用本方案之前，实验人员应先熟悉类器官培养和传代操作。尽管本方案已很好地适用于筛选实验，初学者仍建议从少量样本开始。本实验操作将由实验室工程师 Sophie Dulauroy 进行示范。

处死一只8至10周龄的Lgr5-GFP小鼠后，取其十二指肠与回肠之间的空肠部分5至8厘米，置于含抗生素的冷DPBS中并冰上保存。接着，用5至10毫升含抗生素的冷DPBS冲洗，清除肠内容物。然后使用圆头剪刀沿肠壁纵轴剪开肠道，并用镊子将组织转移至含有含抗生素冷DPBS的培养皿中。

轻轻晃动培养皿内的组织以冲洗。接着，使用塑料巴斯德吸管通过负压吸取肠道，并将其转移至含有10毫升冰冷的10毫摩尔EDTA溶液的15毫升离心管中。将离心管颠倒3次，置于冰上孵育10分钟。

孵育后，将组织转移至含有10毫升DPBS的离心管中，涡旋振荡2分钟。立即取10微升组分加入培养皿中，使用显微镜评估组分的质量。在含有DPBS的离心管中进行两次转移，每次转移之间涡旋振荡2分钟，随后将肠道置于含EDTA的冰上孵育5分钟，操作如前所述。

在含有DPBS的离心管中连续进行三次转移，每次转移之间以涡旋振荡三分钟，随后将最佳组分合并至一个50毫升离心管中，通过倒置所选离心管三次并经70微米细胞滤网过滤。然后离心收集隐窝，弃去上清液，并机械性地破坏沉淀，再加入5毫升冷的DMEM F12培养基。在显微镜下手动计数10微升等分试样中存在的隐窝数量。

计数后，再次离心隐窝并小心移除上清液。随后机械性地打散沉淀，向离心管中加入生长培养基，使隐窝浓度达到每微升90个。接下来，加入两倍体积的未稀释基底膜基质（BMM），使最终浓度为每微升30个隐窝，并小心地上下吹打混悬液，避免将气泡引入混合物中。

进行流式细胞术分析时，将10微升隐窝BMM混合物作为圆顶状滴加到预热的圆底96孔板每个孔的中心。进行成像时，将10微升混合物作为薄层沉积在预热的八孔载玻片培养腔中。室温静置5分钟使BMM凝固后，将培养板置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中。

孵育15分钟后，向每个孔中加入250 µL培养基，注意不要使BMM脱落，并将培养板放入培养箱中。为通过共聚焦显微镜观察氧化应激，向已接种类器官的八孔载玻片的相应孔中加入1 µL N-乙酰半胱氨酸储备液。孵育1小时后，向相应孔中加入1 µL叔丁基过氧化氢储备溶液，再继续孵育30分钟。

接下来，每孔加入 1 微升 1.25 毫摩尔的荧光探针稀释液，随后加入 1 微升 1.25 毫克/毫升的 Hoechst 溶液。再经 30 分钟孵育后，小心移除培养基，避免扰动 BMM，然后轻柔加入 250 微升不含酚红的预热 DMEM 培养基。使用配备温控腔室和气体供应系统的共聚焦显微镜对类器官进行成像，以检测荧光探针信号。

使用阳性对照设置激光强度和ROS信号的曝光时间，并确认该信号在阴性对照中较低。接着，通过目镜观察玻片，筛选表达GFP的类器官并调整激光强度。设置25微米的z轴层扫，定义成像位置以获得整个类器官的拼接图像，从而获取显示单层细胞的类器官切面。

在含有类器官的96孔圆底板的阴性对照孔中加入1 µL N-乙酰半胱氨酸储备液。孵育1小时后，在相应的孔中加入1 µL叔丁基过氧化氢储备液，并孵育30分钟。然后使用多通道移液器小心移除培养基，避免扰动贴壁的BMM，将培养基转移至另一块96孔圆底板中。

将此培养板置于一旁。随后，加入 100 µL 胰蛋白酶，并使用多通道移液器上下吹打 5 次，以破坏 BMM。短暂孵育 5 分钟后，再次通过上下吹打的方式解离类器官。

将培养板旋转后倒置，弃去上清液。将先前收集的培养基加回到另一块96孔板中对应的孔内，通过上下吹打五次重悬细胞。接着，加入一微升荧光探针，孵育30分钟。

然后再次离心培养板，并用250 µL DAPI溶液重悬细胞。将样品转移至流式细胞术检测管中，并将检测管置于冰上。使用单染样品，在未染色对照的基础上优化前向散射和侧向散射的电压设置，以及每种荧光染料的激光电压。

然后采用适当的设门策略，收集至少 20,000 个事件。活性氧染色与类器官的代表性共聚焦图像显示，在存在 NAC 抑制剂的情况下，仅可见类器官腔内死亡细胞的信号。在未经处理的类器官中，可观察到基础水平的活性氧信号，尤其是在 GFP 阳性细胞中，证明干细胞产生的活性氧高于分化细胞。

GFP阳性细胞在诱导剂存在且存在荧光探针的情况下表现出更强的胞质信号，表明经处理后干细胞内的活性氧水平显著升高。对肠类器官中活性氧产生的流式细胞术分析显示，经抑制剂刺激后基础活性氧水平降低，而经诱导剂刺激后则升高。经抑制剂预处理后再用诱导剂刺激的细胞，其活性氧水平低于仅用诱导剂刺激的细胞。

对分选为GFP阳性的干细胞进行类似分析，结果显示，与未刺激细胞相比，抑制剂处理后ROS水平降低3.5倍，诱导剂处理后则升高4倍。在进行该实验操作时，操作者应注意在类器官操作和解离过程中尽量减少细胞应激。此外，在分析ROS时，应始终设置阳性对照和阴性对照。

完成此操作后，可通过对抗原固定后的完整类器官进行免疫荧光染色、细胞分选及基因表达分析，以进一步深入了解活性氧（ROS）的调控机制。观看本视频后，您应掌握如何培养小鼠肠道类器官、对完整类器官进行活体成像分析，以及如何处理肠道组织以进行流式细胞术分析。